Tierärztliche Hochschule Hannover
Einfluss einer P-reduzierten Fütterung auf die Phosphatresorption im Dünndarm
wachsender Ziegen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Joie Liana Behrens
Hannover
Hannover 2021
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Gerhard Breves
Institut für Physiologie und Zellbiologie Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Dr. Alexandra Muscher-Banse
Institut für Physiologie und Zellbiologie Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Gerhard Breves 2. Gutachter: Prof. Dr. Christian Visscher
Tag der mündlichen Prüfung: 04.05.2021
Mit freundlicher Unterstützung durch die H. Wilhelm Schaumann Stiftung.
Meiner Familie in Liebe und Dankbarkeit
Teile der vorliegenden Arbeit wurden auf einer Tagung präsentiert und in einer international anerkannten Fachzeitschrift veröffentlicht:
J. L. Behrens, K. Hansen, N. Schnepel, K. Hustedt, G. Breves & A. S. Muscher- Banse (2020)
Effects of a phosphorus-reduced diet on vitamin D metabolism in young goats 24th Congress of the European Society of Veterinary and Comparative Nutrition (ESVCN); 17.-19. September 2020, online ausgetragen durch die Ludwig- Maximilians-Universität München, Programm und Abstract-Band Seite 30.
Joie L. Behrens, Nadine Schnepel, Kathrin Hansen, Karin Hustedt, Marion Burmester, Stefanie Klinger, Gerhard Breves and Alexandra S. Muscher-Banse (2021)
Modulation of Intestinal Phosphate Transport in Young Goats Fed a Low Phosphorus Diet
International Journal of Molecular Sciences 2021, 22, 866.
[https://doi.org/10.3390/ijms22020866]
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 2
2.1 Phosphor ... 2
2.1.1 Vorkommen und Gewinnung... 2
2.1.2 Verwendung und ökologische Folgen ... 3
2.1.3 Biologische Bedeutung ... 5
2.2 Besonderheiten der Wiederkäuer ... 6
2.2.1 Vormagensystem ... 6
2.2.2 Endogener Phosphatkreislauf ... 6
2.3 Regulation der Phosphathomöostase ... 8
2.4 Phosphatresorption im Dünndarm ... 10
2.4.1 Na+/K+-ATPase ... 11
2.4.2 NaPi-Cotransporter Typ II ... 12
2.4.3 NaPi-Cotransporter Typ III ... 14
2.4.4 Phosphat-Exporter XPR1 ... 15
2.4.5 Claudine ... 16
2.4.6 Zonula occludens-1 ... 16
2.4.7 Occludin ... 17
2.4.8 Cadherin-17 ... 17
2.4.9 Vitamin D-Rezeptor ... 17
3 Hypothesen und Zielsetzung ... 19
4 Material und Methoden ... 21
4.1 Versuchstiere, Haltung und Fütterungsregime ... 21
4.2 Futter ... 22
4.3 Probenahmen intestinaler Gewebe und Körperflüssigkeiten ... 24
4.4 Funktionale Untersuchung intestinaler Epithelien ... 25
4.4.1 Fluxratenbestimmung ... 26
4.4.2 Elektrophysiologische Untersuchung ... 27
4.5 Molekularbiologische Untersuchung intestinaler Epithelien ... 28
4.5.1 Intestinale mRNA-Expressionen von Na+/K+-ATPase, NaPiIIb, PiT1, PiT2, VDR, XPR1, Cadherin-17, Claudin-1, Claudin-2, Claudin-12, Claudin-15, Occludin und ZO-1 ... 28
4.5.2 Intestinale Proteinexpressionen von Na+/K+-ATPase, NaPiIIb und PiT1 31 4.6 Biochemische Analysen der Körperflüssigkeiten ... 32
4.7 Statistische Auswertung ... 32
5 Manuskript ... 33
6 Unveröffentlichte Ergebnisse ... 55
6.1 Futtereffizienz ... 55
6.2 Vitamin D ... 55
6.3 Korrelation: Claudin-2-mRNA / Plasma-Gesamtcalcium ... 55
7 Diskussion ... 57
7.1 Diskussion der Methodik ... 57
7.2 Diskussion der Ergebnisse ... 58
7.3 Schlussfolgerungen ... 66
8 Zusammenfassung ... 68
9 Summary ... 70
10 Literaturverzeichnis ... 72
11 Danksagung ... 96
Abkürzungsverzeichnis
ADFom Säure-Detergenzien-Faser nach Veraschung
ATP Adenosintriphosphat
aNDFom Neutral-Detergenzien-Faser nach Amylasebehandlung und Veraschung
BBM Bürstensaum-Membran
BBMV Bürstensaum-Membranvesikel
Ca2+ Calcium
cDNA komplementäre DNA
d Tage
FE Futtereffizienz
FGF23 Fibroblasten-Wachstumsfaktor 23
Gt Gewebeleitfähigkeit
h Stunde
Isc Kurzschlussstrom
Jms Fluxrate in serosaler Richtung
Jnet Nettofluxrate
Jsm Fluxrate in mukosaler Richtung
K+ Kalium
kBq Kilobecquerel
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
KO Knockout
LW Lebenswochen
ME metabolisierbare Energie
MJ Megajoule
n Stichprobenumfang
N Stickstoff
Na+ Natrium
p Signifikanzwert
P Phosphor
Pi Phosphat
PBST phosphatgepufferte Salzlösung mit Tween
PTH Parathormon
qPCR quantitative Polymerase-Kettenreaktion
r Korrelationskoeffizient
RT Raumtemperatur
SCFA kurzkettige Fettsäuren
TS Trockensubstanz
uS ursprüngliche Substanz
VDR Vitamin D-Rezeptor
XPR1 Xenotropic and polytropic retrovirus receptor 1
ZO-1 Zonula occludens-1
Chemische Elemente und Maßeinheiten werden entsprechend der offiziellen Nomenklatur (IUPAC) abgekürzt. Des Weiteren werden allgemein gebräuchliche Abkürzungen wie „z. B.“ nicht im Abkürzungsverzeichnis aufgeführt.
1 1 Einleitung
Phosphor (P) wird in der Landwirtschaft als Bestandteil von Düngemitteln und zur Fütterung von Nutztieren verwendet. Aufgrund limitierter P-Ressourcen einerseits und der Belastung des Ökosystems durch Umweltemissionen andererseits (KILLICHES et al. 2013), ist es sowohl unter ökonomischen als auch unter ökologischen Aspekten erstrebenswert, Nutztiere P-reduziert zu füttern.
P-Verbindungen, sogenannte Phosphate (Pi), sind ein essenzieller Bestandteil aller lebenden Organismen. Die Pi-Homöostase wird bei Wirbeltieren durch ein Zusammenspiel der intestinalen und renalen Pi-Resorption sowie der Anlagerung und Resorption von Knochenmineralien aufrechterhalten. Bei Wiederkäuern ist Pi für ein physiologisches Milieu im Vormagensystem von besonderer Bedeutung (MILTON u.
TERNOUTH 1984). Daher verfügen Wiederkäuer über einen endogenen Pi-Kreislauf, welcher durch hohe Pi-Sekretionsraten in den Speicheldrüsen eine adäquate Pi- Verfügbarkeit im Vormagensystem sicherstellt (KAY 1960).
Im Dünndarm erfolgt die Pi-Resorption sowohl transzellulär als auch parazellulär. Der transzelluläre Pi-Transport ist ein sekundär-aktiver, Natrium(Na+)-abhängiger Prozess, der von NaPi-Cotransportern der SLC34- und SLC20-Familien vermittelt wird (FORSTER et al. 2013). Die parazelluläre Pi-Resorption erfolgt passiv, angetrieben durch einen elektrochemischen Gradienten und wird durch interzelluläre Proteine des junktionalen Komplexes vermittelt (KNÖPFEL et al. 2019).
Zahlreiche Studien an verschiedenen Spezies ergaben, dass eine P-reduzierte Fütterung die Mineralstoffhomöostase, einschließlich des intestinalen Pi-Transports, beeinflusst. Die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen sind noch nicht vollständig verstanden und insbesondere beim Wiederkäuer besteht weiterer Forschungsbedarf. Daher liegt der Fokus dieser Arbeit auf der Untersuchung des Einflusses einer P-reduzierten Fütterung auf die Mineralstoffhomöostase, insbesondere hinsichtlich des intestinalen Pi-Transports und der Expression beteiligter oder möglicherweise beteiligter Proteine im Dünndarm wachsender Ziegen.
2 2 Literaturübersicht
2.1 Phosphor
2.1.1 Vorkommen und Gewinnung
P kommt weltweit hauptsächlich im Sedimentgestein der Erdkruste vor und steht an elfter Stelle der häufigsten Elemente (SYERS et al. 2011). Aufgrund seiner ausgeprägten Reaktivität liegt P in der Natur zumeist in Form von Pi-Verbindungen wie Apatit und Phosphorit vor, die zu den häufigsten Mineralophosphaten zählen. Große qualitative Unterschiede und die teils schlechte Zugänglichkeit der Pi-Vorkommen beschränken die Verfügbarkeit wirtschaftlich nutzbaren Pi auf wenige Regionen der Welt. Zu den wichtigsten Produzenten zählen Marokko, China und USA, die zusammen für zwei Drittel des global geförderten Pi verantwortlich sind (KILLICHES et al. 2013). Durch die Reduktion mit Kohlenstoff im elektrischen Lichtbogen bei Temperaturen über 1000 °C wird aus Pi-Gestein weißer P industriell hergestellt (GLEASON 2007).
Abbildung 1. Die weltweit größten bekannten Phosphatlagerstätten ab 100 Millionen Tonnen (KILLICHES et al. 2013).
3 2.1.2 Verwendung und ökologische Folgen
Etwa 95 % des global hergestellten P werden als Pi-Düngemittel und für die Tierfutterherstellung genutzt (DANESHGAR et al. 2018). Neben Stickstoff (N) und Kalium (K+) zählt P zu den bedeutsamsten Nährstoffen für den pflanzlichen Stoffwechsel. Da die natürlichen Bodenreserven dieser Nährstoffe begrenzt sind, ist der Einsatz von Düngemitteln im Ackerbau zum Erhalt der Bodenfruchtbarkeit unverzichtbar. In der vorindustriellen Zeit wurden adäquate Erträge allein durch den Einsatz tierischer und menschlicher Exkremente als organische Dünger erzielt. Die wachsende Weltbevölkerung im 18. und 19. Jahrhundert machte eine Steigerung der Lebensmittelproduktion erforderlich, die durch technische und züchterische Fortschritte sowie den Einsatz neuer Pflanzenschutz- und mineralischer Düngemittel erreicht wurde (SYERS et al. 2011).
Darüber hinaus wird mineralisches Pi für die Fütterung von Nutztieren, insbesondere der monogastrischen Spezies, eingesetzt, da P in pflanzlichen Futtermitteln vor allem organisch gebunden als Phytin-P enthalten ist, der für diese Spezies aufgrund eines fehlenden Enzyms nur unzureichend verwertbar ist. Die Gülle dieser Spezies ist daher besonders Pi-reich und wird als organischer Dünger zur Nährstoffrückführung auf Ackerflächen ausgebracht. Der übermäßige Einsatz sowohl von organischen als auch von mineralischen Düngern in der Landwirtschaft hat in einigen Regionen der Welt schwerwiegende Folgen für das Ökosystem. Durch Erosion werden Pi und andere Nährstoffe aus den Böden ins Oberflächen- und Grundwasser getragen. Die Eutrophierung reduziert die Wasserqualität, was mit einem verstärkten Algenwachstum, Sauerstoffmangel und dem Verlust der Biodiversität einhergeht.
Um Erosionen und somit Nährstoffverlusten entgegenzuwirken, werden im Ackerbau verschiedene Praktiken, wie das Konturpflügen und -bepflanzen, der Einsatz von Zwischenfrüchten und Vegetationsschutz, angewendet (STOCKING 1984). Dennoch gelangen einer Studie zufolge jährlich ca. 22 Mio. Tonnen P in die Ozeane (BENNETT et al. 2001).
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Andererseits hat eine unzureichende Pi-Düngung im Ackerbau Minderwuchs und Ertragsverluste zur Folge. Weltweit kommen in der Landwirtschaft abhängig von der Region beide Extreme, Überdüngung und P-Mangel, vor. Die natürlichen P-Gehalte und die Beschaffenheiten der landwirtschaftlich genutzten Böden sind sehr verschieden, sodass in der Europäischen Union vergleichsweise geringe Mengen Pi- Dünger eingesetzt werden müssen, da die Ackerflächen natürlicherweise P-reich sind und über ein gutes Nährstoffbindungsvermögen verfügen. In einigen zentralafrikanischen und asiatischen Ländern hingegen, insbesondere in ariden und semi-ariden Regionen, besteht ein natürlicher P-Mangel, den es durch eine gezielte Düngung auszugleichen gilt (DANESHGAR et al. 2018). Während der P-Verbrauch der Industrienationen recht stabil ist, steigt der Konsum in Entwicklungsländern aufgrund der wachsenden Bevölkerung, der steigenden Nachfrage nach tierischen Produkten sowie der Kultivierung von Pflanzen für nicht Ernährungszwecke stetig an (VAN VUUREN et al. 2010).
Neuere Schätzungen kamen zwar zu dem Ergebnis, dass die globalen P-Reserven noch über das Jahr 2300 hinaus reichen könnten, dennoch ergibt sich mit der Konzentration der Pi-Lagerstätten auf wenige Länder der Welt ein Versorgungsrisiko für die vom Import abhängigen Nationen (KILLICHES et al. 2013). Methoden zum P- Recycling, z. B. aus Abwässern, werden in Zukunft an Bedeutung gewinnen, sind aber technisch aufwändig und derzeit unwirtschaftlich (LAMPRECHT et al. 2011). Daher richtet sich der Fokus zur Schonung der globalen P-Reserven und des Ökosystems auf den Erosionsschutz und den sparsamen und gezielten Einsatz von P in der Landwirtschaft.
5 2.1.3 Biologische Bedeutung
Auch in Lebewesen kommt P hauptsächlich in Form von Pi-Verbindungen vor. Diese sind in zahlreiche biologische Prozesse involviert und daher essenziell für alle lebenden Organismen. Mengenmäßig ist Pi neben Calcium (Ca2+) das häufigste Mineral im Körper von Wirbeltieren. Etwa 80 % des Gesamt-Pi sind in Form von Ca2+- Pi-Kristallen (Hydroxylapatit) in Knochen und Zähnen eingelagert, wodurch diese ihre Festigkeit erhalten. Pi ist zudem Bestandteil von Zellmembranen sowie von DNA und RNA als Träger der Erbinformation. Es wird für die Bildung der zellulären Energieträger Adenosinmonophosphat, -diphosphat, und -triphosphat (AMP, ADP und ATP) und für die zelluläre Signaltransduktion benötigt. In Körperflüssigkeiten wirkt Pi, zusammen mit Bikarbonat, als Puffersubstanz und trägt zur Aufrechterhaltung physiologischer pH- Werte bei (ELLISON et al. 1958; BREVES u. SCHRÖDER 1991).
Abbildung 2 Phosphatflüsse in die Umwelt. Die wichtigsten Stoffflüsse der menschlichen Phosphatnutzung sind durch die roten Pfeile gekennzeichnet. Die gelben Pfeile stellen Phosphatflüsse zwischen Pflanzen, Böden und dem aquatischen System dar. Graue Pfeile visualisieren Phosphatverluste durch Abfälle aus der Lebensmittelindustrie (SYERS et al. 2011).
6 2.2 Besonderheiten der Wiederkäuer 2.2.1 Vormagensystem
Pflanzenfresser leben mit Mikroorganismen, die bestimmte Abteilungen des Gastrointestinaltrakts besiedeln, in Endosymbiose. Bei monogastrischen Pflanzenfressern sind Blind- und Dickdarm die Hauptlokalisationen für die mikrobielle Besiedlung, sodass von distalen Fermentationskammern die Rede ist. Mit dem Vormagensystem, bestehend aus Reticulum, Rumen und Omasum, verfügen Wiederkäuer über eine proximale, dem restlichen Verdauungstrakt vorgelagerte Fermentationskammer. Durch die vorwiegend anaeroben Bakterien, Archaeen, Protozoen und Pilze werden pflanzliche Nahrungsbestandteile fermentativ aufgeschlossen, sodass enthaltene Nährstoffe für den Wirt nutzbar werden (HUNGATE 1975; HUME u. WARNER 1980). Kohlenhydrate werden dabei zu kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) abgebaut, die dem Wirt als Energiequelle zur Verfügung stehen. Rohfaserhaltige Pflanzenteile sind reich an den Gerüstsubstanzen Cellulose, Hemizellulosen und Lignin. Bei diesen handelt es sich um polymere Kohlenhydrate mit β-glycosidischen Bindungen, zu deren Spaltung Wirbeltieren ein eigenes Enzym fehlt. Dieses wird von der mikrobiellen Flora bereitgestellt, sodass der Abbau zu SCFA erfolgen kann. Durch die proximale Lokalisation der Fermentationskammer steht dem Wiederkäuer im Vergleich zu anderen Pflanzenfressern eine längere Strecke für die intestinale Resorption der fermentativ aufgeschlossenen Nährstoffe zur Verfügung. Zusammen mit der Wiederkautätigkeit, welche die mikrobielle Besiedlung der Futterpartikel verbessert, macht dies die Verdauung rohfaserreichen Futters bei Wiederkäuern besonders effizient (NIWIŃSKA 2012).
2.2.2 Endogener Phosphatkreislauf
Zur Aufrechterhaltung des physiologischen Milieus im Vormagensystem spielt Pi eine wichtige Rolle, da es zum einen für die Synthese mikrobieller Zellmasse sowie für mikrobielle Stoffwechselvorgänge benötigt wird (DURAND et al. 1983; MILTON u.
TERNOUTH 1984) und zum anderen, neben Bikarbonat, als Puffer der entstehenden SCFA dient (COUNOTTE et al. 1979). Zur Sicherstellung einer adäquaten Pi-
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Verfügbarkeit im Reticulorumen, insbesondere in Zeiten diätetischen P-Mangels, verfügen Wiederkäuer über einen endogenen Pi-Kreislauf (Abbildung 3). In den Ohrspeicheldrüsen des Wiederkäuers, die zusammen mit den Unterkieferspeicheldrüsen, den Hauptanteil des Gesamtspeichels produzieren (SCHEUNERT u. TRAUTMANN 1921), wird Pi gegenüber dem Plasma aufkonzentriert, sodass im Speichel Pi-Konzentrationen von 12,5-32 mmol•l-1 vorherrschen (KAY 1960). Dies führt zusammen mit hohen Speichelflussraten dazu, dass bei Schafen 5-10 g und bei Rindern 30-60 g Pi pro Tag in das Vormagensystem gelangen (BREVES u. SCHRÖDER 1991). Pi aus dem Speichel und aus der Nahrung wird im Dünndarm resorbiert. Ein eventueller Überschuss wird mit dem Kot ausgeschieden, während renale Pi-Verluste bei Wiederkäuern durch die hohe Pi- Resorption in der Niere sehr gering sind (CLARK et al. 1973).
Abbildung 3. Der endogene Phosphatkreislauf der Wiederkäuer. Die grafische Gestaltung (Futter, Speicheldrüse, Knochen und Niere) wurde von Servier Medical Art (https://smart.servier.com) zur Verfügung gestellt.
8 2.3 Regulation der Phosphathomöostase
Ein feinreguliertes Zusammenspiel der intestinalen und renalen Resorption sowie der Anlagerung und Resorption von Knochenmineralien stellt bei Wirbeltieren die Plasmakonzentrationen von Pi innerhalb enger Grenzen ein. Bei Wiederkäuern wird Pi, anders als bei monogastrischen Spezies, kaum über die Nieren ausgeschieden, sodass Pi-Verluste hauptsächlich durch die fäkale Ausscheidung erfolgen (SCOTT et al. 1984).
Das Parathormon (PTH), welches von den Nebenschilddrüsen sezerniert wird, zählt zu den wichtigsten regulierenden Hormonen der Pi-Homöostase. Die PTH- Sekretionsrate ist umgekehrt proportional zur extrazellulären Ca2+-Konzentration (KEMPER et al. 1974). Eine reduzierte Pi-Konzentration im Plasma wirkt sich hingegen hemmend auf die PTH-Sekretion aus (MOALLEM et al. 1998) (Abbildung 4). In der Niere wirkt PTH hemmend auf die Resorption von Pi in den proximalen Tubuli (FORSTER et al. 2006) und stimulierend auf die Resorption von Ca2+ in den distalen Tubuli (FRIEDMAN u. GESEK 1993). Eine anhaltende Exposition gegenüber PTH fördert die Resorption von Knochenmineralien, sodass Pi und Ca2+ freigesetzt werden (KOUSTENI u. BILEZIKIAN 2008). Zudem wirkt PTH stimulierend auf das renale Enzym 1α-Hydroxylase (CYP27B1), welches für die Konversion des biologisch inaktiven Vitamin D-Prohormons 25-Hydroxyvitamin D3 (Calcidiol) zum biologisch aktiven 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (Calcitriol) verantwortlich ist (GAO et al. 2002).
Versuche an Rindern haben gezeigt, dass der CYP27B1-stimulierende Effekt des PTH nicht absolut ist, da die Verabreichung hoher Dosen PTH nach kurzer Zeit zu einer Hyperkalzämie führt, wodurch die Calcitriolsynthese nahezu vollständig gehemmt wird (HOVE et al. 1984). Während bei monogastrischen Spezies, wie beispielsweise Hühnern, Schweinen und Ratten, reduzierte Plasmakonzentration sowohl von Pi als auch von Ca2+ die Calcitriolsynthese stimulieren (HUGHES et al. 1975; BAXTER u.
DELUCA 1976; SOMMERVILLE et al. 1985), trifft dies bei Wiederkäuern nur dann zu, wenn Ca2+, nicht aber, wenn Pi reduziert ist (ABDEL-HAFEEZ et al. 1982; MAUNDER et al. 1986; ELFERS et al. 2015).
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Sowohl Calcitriol (KOWARSKI u. SCHACHTER 1969; SCHRÖDER u. BREVES 1996;
DANISI u. MURER 2011; HERNANDO et al. 2020) als auch ein diätetischer P-Mangel (JUNGBLUTH u. BINSWANGER 1989; SCHRÖDER et al. 1995a; HUBER et al. 2002) bewirken in verschiedenen Spezies inklusive der Wiederkäuer eine Steigerung der intestinalen Pi-Resorption. Calcitriol ist außerdem für einen normalen Knochenstoffwechsel essenziell, da es die Aktivität von Osteoblasten direkt und von Osteoklasten indirekt stimuliert (MCSHEEHY u. CHAMBERS 1987). Darüber hinaus wirkt Calcitriol hemmend auf die eigene Synthese in der Niere (OMDAHL et al. 2001).
An der Regulation der Pi-Homöostase ist außerdem der von Osteozyten synthetisierte Fibroblasten-Wachstumsfaktor 23 (FGF23) beteiligt. Stimulierend auf dessen Freisetzung wirken sich eine Hyperphosphatämie (BURNETT et al. 2006) sowie erhöhte Calcitriolspiegel aus (NISHI et al. 2005). Interessanterweise hatte in Untersuchungen mit menschlichen Patienten eine PTH-Injektion eine Hypophosphatämie und den Anstieg der Konzentrationen von Calcitriol und FGF23 zur Folge. Daraus wurde geschlossen, dass Calcitriol trotz eines niedrigen Plasma-Pi
stimulierend auf die FGF23-Sekretion wirkt (BURNETT‐BOWIE et al. 2009). Im Fall einer Hyperphosphatämie jedoch, die bei PTH-KO-Mäusen bestand, kam es zu einer Steigerung der FGF23-Spiegel, obwohl die Calcitriol-Konzentration unverändert oder reduziert war, sodass hier der regulierende Einfluss des erhöhten Plasma-Pi zu dominieren scheint (BAI et al. 2007).
Durch FGF23 wird die Pi-Konzentration im Plasma reduziert, indem die Pi-Resorption sowohl in der Niere (BIBER et al. 2009) als auch im Darm gehemmt wird. Letzteres wurde in Versuchen mit intestinalen Bürstensaum-Membranvesikeln (BBMV) von Mäusen demonstriert, bei denen die Aktivität und die Proteinexpression eines NaPi- Cotransporters (NaPiIIb) unter dem Einfluss von FGF23 reduziert waren (MIYAMOTO et al. 2005). Außerdem bewirkt FGF23 eine verminderte PTH-Sekretion (BEN-DOV et al. 2007), sodass eine reduzierte Freisetzung von Pi aus dem Knochen die Folge ist.
Auf CYP27B1 hat FGF23 ebenfalls einen hemmenden Einfluss (SHIMADA et al.
2004), wodurch weniger Calcitriol stimulierend auf die intestinale Pi-Resorption wirkt.
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Außerdem wird diskutiert, ob die Pi-Sekretion in den Speicheldrüsen der Wiederkäuer einer Regulation unterliegt und so zur Aufrechterhaltung der Pi-Homöostase beiträgt.
Eine direkte Abhängigkeit der Pi-Konzentration im Speichel von jener im Plasma wurde in verschiedenen Studien beschrieben. So hatte eine reduzierte Pi-Konzentration im Plasma von Rindern eine geringere Pi-Konzentration im Speichel zur Folge (VALK et al. 2002), während eine Hyperphosphatämie, die bei Rindern und Ziegen per intravenöser Infusion herbeigeführt wurde, mit einer gesteigerten Pi-Konzentration im Speichel einherging (RIAD et al. 1987; WIDIYONO et al. 1998).
2.4 Phosphatresorption im Dünndarm
Pi wird im Dünndarm transzellulär und parazellulär resorbiert (Abbildung 5). Bei Wiederkäuern erfolgt der Großteil der intestinalen Pi-Resorption im mittleren Jejunum (SCHARRER 1985). Die transzelluläre Pi-Resorption ist ein sekundär-aktiver Prozess, der durch apikal in der Zellmembran der Enterozyten lokalisierte Pi-Transportproteine der SLC34 (NaPiIIb)- und SLC20 (PiT1 und PiT2)-Familien vermittelt wird. Zu dessen Antrieb dient ein Na+- Gradient, welcher von der Na+/K+-ATPase generiert wird.
Abbildung 4. Adaptationsprozesse bei Hypophosphatämie und Hyperphosphatämie in monogastrischen Spezies (modifiziert nach BREVES u. SCHRÖDER (1991)).
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Als Teil der transzellulären Pi-Transportroute muss neben der apikalen Aufnahme die basolaterale Ausschleusung des Pi aus der Zelle berücksichtigt werden. Hierfür wird der Xenotropic and polytropic retrovirus receptor 1 (XPR1) verantwortlich gemacht.
Der parazelluläre Pi-Transport erfolgt durch passive Diffusion, angetrieben durch den elektrochemischen Gradienten, der zwischen der Lumenseite und der Blutseite des Epithels besteht. Für einige Tight Junction(TJ)- und Adherens Junction(AJ)-Proteine, welche im interzellulären Raum des Darmepithels lokalisiert sind, ist eine Beteiligung an der Regulation des parazellulären Ionentransports beschrieben worden, welche möglicherweise die Pi-Resorption mit einschließt. Im Folgenden wird auf jene Proteine im Detail eingegangen, deren Expressionen in dieser Studie untersucht werden.
2.4.1 Na+/K+-ATPase
Die Na+/K+-ATPase ist ein in der basolateralen Zellmembran lokalisiertes Transmembranprotein, welches in allen tierischen Zellen vorkommt. Als Na+/K+- Antiporter katalysiert sie unter Verbrauch des zellulären Energieträgers ATP den Transport von drei Na+-Ionen aus der Zelle hinaus und zwei K+-Ionen in die Zelle hinein, jeweils entgegen dem Konzentrationsgefälle. Die so generierten Na+- und K+- Gradienten dienen als Antrieb für die Erzeugung sowie die De- und Repolarisation
Abbildung 5. Epitheliale Transportvorgänge im Dünndarm.
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eines Membranpotentials, für die Regulierung der zytoplasmatischen Ionenzusammensetzung sowie des Zellvolumens und für transmembrane Transportvorgänge, wie z. B. die sekundär-aktiven Transporte von Glucose und Aminosäuren gegen das Konzentrationsgefälle (SKOU u. ESMANN 1992).
Verschiedene Hormone, darunter Aldosteron, Adrenalin, Schilddrüsenhormone, Wachstumsfaktoren und Insulin beeinflussen die Aktivität der Na+/K+-ATPase kurz- oder langfristig (EWART u. KLIP 1995). Eine Beeinflussung der intestinalen Expression des Enzyms durch die Fütterung wurde anhand von Na+-reduziert gefütterten Hühnern beschrieben, bei denen die mRNA-Expression der Na+/K+- ATPase im Jejunum erhöht war (GAL-GARBER et al. 2003). Eine N-reduzierte Fütterung von Ziegen hatte keinen Einfluss auf die jejunale Na+/K+-ATPase- Proteinexpression (MUSCHER et al. 2012), während in der Nierenrinde eine verminderte Proteinexpression unter einer diätetischen N-Reduktion und einer kombinierten Reduktion von N und Ca2+ beschrieben wurde, die positiv mit der mRNA- Expression korrelierte (FIRMENICH et al. 2018). In einer weiteren Studie konnte eine reduzierte Proteinexpression der Na+/K+-ATPase im mittleren Jejunum unter einer Ca2+-reduzierten Fütterung gezeigt werden (ELFERS et al. 2015).
2.4.2 NaPi-Cotransporter Typ II
Der sekundär-aktive Typ II NaPi-Cotransporter NaPiIIb (SLC34A2) ist in Dünndarm, Lunge, Uterus, Hoden, Speichel- und Milchdrüsen exprimiert (FEILD et al. 1999;
NISHIMURA u. NAITO 2008). Angetrieben wird dieser durch das Na+- Konzentrationsgefälle, welches durch die Na+/K+-ATPase unter ATP-Verbrauch generiert wird. Der Transporter besitzt eine höhere Affinität für die divalente Form des Pi, sodass bei einer Stöchiometrie von 3:1, Na+:HPO42-, mit jedem Pi-Ion eine positive Ladung von der mukosalen zur serosalen Seite des Epithels gelangt (MARKS et al.
2010).
Die segmentale Verteilung von NaPiIIb entlang des Dünndarms variiert zwischen den Spezies. Bei Mäusen ist NaPiIIb am stärksten im Ileum exprimiert (RADANOVIC et al.
2005), während die Expression des Transporters bei Ratten vor allem im Duodenum und Jejunum nachgewiesen wurde und entlang des Dünndarms bis hin zum Ileum
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abnimmt (GIRAL et al. 2009). Im Duodenum von Wiederkäuern ist NaPiIIb nahezu abwesend, jedoch im Jejunum und am umfangreichsten im Ileum nachweisbar (FOOTE et al. 2011; ELFERS et al. 2015).
Dass der aktive Pi-Transport im Dünndarm hauptsächlich durch NaPiIIb vermittelt ist, wurde an NaPiIIb-knockout(KO)-Mäusen demonstriert, bei denen die Pi-Resorption nach einer Pi-Bolusgabe zu etwa 50 % geringer war als beim Wildtyp (SABBAGH et al. 2009). Untersuchungen mit BBMV aus dem Dünndarm von Mäusen ergaben außerdem, dass die durch eine P-Depletion induzierte Stimulation des Pi-Transports auf eine Expressionssteigerung von NaPiIIb zurückzuführen ist (HATTENHAUER et al. 1999). Auch eine erhöhte Pi-Resorption im Jejunum von P-reduziert gefütterten Ziegen wurde als Folge der gesteigerten Proteinexpression von NaPiIIb gewertet (HUBER et al. 2002). Frühere Studien mit Ziegen und Schafen zeigten ebenfalls gesteigerte intestinale Pi-Resorptionsraten infolge einer P-Depletion, wobei anders als bei monogastrischen Spezies beschrieben, keine Erhöhung des Plasma-Calcitriols auftrat (BREVES et al. 1985; SCHRÖDER et al. 1995a).
Obwohl bei monogastrischen Spezies eine P-reduzierte Fütterung einen Anstieg der Calcitriolsynthese zur Folge hat und die Stimulation der NaPiIIb-Expression durch die Verabreichung von Calcitriol in Versuchen mit Ratten und Mäusen nachgewiesen wurde (CAO et al. 2016; HERNANDO et al. 2020), scheint auch bei Mäusen eine Vitamin D-unabhängige Regulation der intestinalen Pi-Resorption zu existieren. So konnte gezeigt werden, dass die Expression von NaPiIIb in VDR- und CYP27B1-KO- Mäusen unter einer P-Depletion in gleicher Weise reguliert war wie in Artgenossen des Wildtyps (CAPUANO et al. 2005). Eine Studie mit P-reduziert gefütterten Mäusen zeigte, dass die erhöhte Expression des renalen NaPiIIa durch eine gesteigerte Expression des Transkriptionsfaktors µE3 (TFE3) vermittelt war, welcher die Expression des Transportergens über Pi-response-Elemente in dessen Promoter- Sequenz stimuliert (KIDO et al. 1999; MIYAMOTO u. ITHO 2001). Dieser Mechanismus wird auch für die fütterungsinduzierte Expressionssteigerung von NaPiIIb im Dünndarm von Mäusen in Betracht gezogen (SEGAWA et al. 2004) und könnte daher möglicherweise auch für den Wiederkäuer gelten.
14 2.4.3 NaPi-Cotransporter Typ III
Die Pi-Transporter der SLC20-Familie wurden zunächst als die retroviralen Rezeptoren Gibbon ape leukemia virus receptor-1 (Glvr-1) und Rat amphotropic virus receptor-1 (Ram-1) identifiziert (JOHANN et al. 1992; MILLER et al. 1994). In späteren Studien wurde ihre Funktion als Na+-abhängige Pi-Transporter festgestellt und es erfolgte die Umbenennung in Phosphattransporter 1 (PiT1) und Phosphattransporter 2 (PiT2) (KAVANAUGH et al. 1994; KAVANAUGH u. KABAT 1996). Wie auch bei den Transportern der SLC34-Familie handelt es sich bei PiT1 und PiT2 um sekundär-aktive NaPi-Cotransporter, die durch den Na+-Gradienten der Na+/K+-ATPase-Aktivität energetisiert werden.
PiT1 und PiT2 sind in zahlreichen Geweben des Körpers, einschließlich Lunge, Darm, Leber und Knochen, lokalisiert (FORSTER et al. 2013). Neben der Bedeutung für die Vermittlung der Knochenmineralisation (CAVERZASIO u. BONJOUR 1996;
GUICHEUX et al. 2000) wird ihnen aufgrund der ubiquitären Verteilung eine Housekeeping-Funktion der zellulären Pi-Homöostase zugeschrieben (KAVANAUGH u. KABAT 1996; FREI et al. 2005; NISHIMURA u. NAITO 2008). Anders als die Typ II NaPi-Cotransporter transportieren PiT1 und PiT2 bevorzugt die monovalente Pi- Spezies. Bei einer Stöchiometrie von 2:1, Na+:H2PO4-, transportieren PiT1 und PiT2 mit jedem H2PO4--Ion zwei Na+-Ionen von der mukosalen zur serosalen Seite des Epithels. Mit jedem Transportvorgang wird daher eine positive Ladung zur serosalen Seite des Epithels verschoben (MARKS et al. 2010).
Interessanterweise konnte für PiT2, nicht aber für PiT1, in verschiedenen Studien gezeigt werden, dass bei sauren pH-Werten ein Na+-unabhängiger Pi-Transport möglich ist, indem Protonen (H+) als Substrat genutzt werden (BØTTGER et al. 2006;
VILLA-BELLOSTA et al. 2007). Darüber hinaus werden für PiT2 Pi-abhängige Konformationsänderungen seiner Protein-Untereinheiten an der Zelloberfläche postuliert, die sich direkt auf die Pi-Transportaktivität auswirken (SALAUN et al. 2002).
Obwohl die SLC20-Transporter im Dünndarm zahlreicher Spezies nachgewiesen wurden, wird ihr relativer Beitrag zum transzellulären Pi-Transport als gering eingeschätzt, da In-vitro-Untersuchungen mit Darmepithelien von NaPiIIb-KO-Mäusen
15
ergaben, dass NaPiIIb für über 90 % des aktiven intestinalen Pi-Transports verantwortlich ist (SABBAGH et al. 2009).
PiT1 wurde bei Ziegen im proximalen sowie im mittleren Jejunum und im Ileum auf mRNA-Ebene und im mittleren Jejunum auf Proteinebene nachgewiesen (ELFERS et al. 2015). Während im Duodenum und Jejunum von Ratten sowohl PiT1 als auch PiT2 auf Proteinebene nachgewiesen wurden, war im Ileum ausschließlich PiT2 exprimiert.
Eine P-reduzierte Fütterung dieser Tiere führte in intestinalen BBMV zu einem Anstieg der Proteinexpressionen beider Transporter (CANDEAL et al. 2017). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die mRNA-Expression von PiT1 (MIYAMOTO et al. 1999) und PiT2 (KATAI et al. 1999) in unterschiedlichen Geweben von Ratten durch Calcitriol stimuliert wird.
2.4.4 Phosphat-Exporter XPR1
Für ein besseres Verständnis des transepithelialen Pi-Weges ist es wichtig, neben der apikalen Aufnahme in die Enterozyten, den basolateralen Export des Pi
nachzuvollziehen. Der Xenotropic and polytropic retrovirus receptor 1 (XPR1) wurde vor zwei Jahrzenten als Eintrittsrezeptor für verschiedene Gammaretroviren in humane Zellen identifiziert (BATTINI et al. 1999). Neuere Experimente mit humanen Zellkulturen zeigten, dass die Depletion des XPR1 eine Abnahme des Pi-Exports zur Folge hat und dass die Wiedereinführung verschiedener XPR1-Proteine diesen Defekt behebt. In ebendieser Studie konnte zudem gezeigt werden, dass die Expression von XPR1 durch eine Reduktion des Pi-Gehalts in der Zellkulturlösung von 1mM auf 0mM unbeeinflusst blieb, sodass kein Hinweis auf eine Pi-abhängige Regulation besteht (GIOVANNINI et al. 2013).
Die XPR1-mRNA wurde in zahlreichen Geweben verschiedener Säugetiere, aber auch bei ferner verwandten Spezies wie der Fruchtfliege und dem Zebrafisch nachgewiesen, sodass eine universale Bedeutung des XPR1 für den Pi-Export in Metazoen angenommen wird (TAILOR et al. 1999; GIOVANNINI et al. 2013).
16 2.4.5 Claudine
Eine wichtige Gruppe der TJ-Proteine wird durch die Claudine repräsentiert, welche in abdichtende und permeabilitätsvermittelnde Mitglieder unterteilt werden können (MARKOV et al. 2010). Claudin-2, Claudin-12 und Claudin-15, die zur letzteren Gruppe gehören, bilden kationenselektive Poren (FUJITA et al. 2008; ROSENTHAL et al.
2020). Die Beteiligung von Claudin-2 und Claudin-12 am parazellulären Ca2+- Transport und die Stimulation ihrer Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene durch Calcitriol konnte in einer In-vitro-Studie mit Enterozyten demonstriert werden (FUJITA et al. 2008). Eine Ca2+-reduzierte Fütterung führte bei Ziegen zu einer erhöhten mRNA-Expression von Claudin-2 im Ileum und von Claudin- 12 im proximalen Jejunum, was auf erhöhte Calcitriolspiegel zurückgeführt wurde (ELFERS et al. 2016).
Eine Studie mit Mäusen ergab, dass Claudin-2- und Claudin-15 den parazellulären Na+-Transport regulieren und indirekt in die Resorption von Glucose, Aminosäuren und Fetten involviert sind. Ihre genetische Depletion führte zum Versterben der Jungtiere aufgrund von intestinaler Malabsorption (WADA et al. 2013). Für Claudin-1 werden abdichtende Eigenschaften angenommen, die zur Aufrechterhaltung der epithelialen Barriere und Homöostase beitragen. Claudin-1-KO-Mäuse verstarben einen Tag nach ihrer Geburt aufgrund von Dehydratation, die sich in einer runzligen Epidermis manifestierte (FURUSE et al. 2002). In einer intestinalen Zellkultur konnte gezeigt werden, dass eine durch Interferon-γ induzierte Permeabilitätssteigerung durch die Zugabe von Lubiproston gehemmt wird. Die durch das Medikament verbesserte Barrierefunktion wurde auf die Expressionssteigerung von Claudin-1 zurückgeführt (NISHII et al. 2020).
2.4.6 Zonula occludens-1
Beim Zonula occludens-1 (ZO-1) handelt es sich um ein Gerüstprotein, welches an der zytosolischen Seite der Zellmembran lokalisiert ist und durch die Vernetzung zwischen TJ-Proteinen und dem Zytoskelett für strukturelle Stabilität sorgt (STEVENSON et al.
1986; FANNING et al. 1998). Die experimentelle Depletion von ZO-1 in Madin-Darby canine kidney epithelial(MDCK)-Zellen führte zu morphologischen Veränderungen der
17
Zellen und zu einer Permeabilitätssteigerung für Makromoleküle, sodass eine Beeinträchtigung der epithelialen Barriere durch den Verlust von ZO-1 angenommen wird (VAN ITALLIE et al. 2009).
2.4.7 Occludin
Ein weiteres TJ-Protein, welches die transepitheliale Permeabilität von Makromolekülen reguliert, ist das Occludin. In-vitro- und Ex-vivo-Studien mit Darmzellen der Cancer coli-2(CaCo-2)-Linie bzw. mit Darmepithelien von Mäusen ergaben, dass die genetische Ausschaltung von Occludin eine erhöhte epitheliale Permeabilität, insbesondere für Makromoleküle zur Folge hat, ohne dass dabei der transepitheliale elektrische Widerstand beeinträchtigt wurde (AL-SADI et al. 2011).
2.4.8 Cadherin-17
Cadherine zählen zu den AJ-Proteinen, die zusammen mit den TJ-Proteinen den junktionalen Komplex bilden. Sie sind Ca2+-abhängige Transmembranproteine, die zum einen zur strukturellen Stabilität und Integrität von Epithelien beitragen und zum anderen in biologische Prozesse wie die Zellkommunikation, Morphogenese und Angiogenese involviert sind (ANGST et al. 2001). Cadherin-17 ist bei Menschen und Mäusen im Darm exprimiert und kommt bei Ratten außerdem in der Leber vor (GESSNER u. TAUBER 2000). In Ex-vivo-Studien mit Darmsegmenten von Cadherin- 17-KO-Mäusen wurde eine gesteigerte Permeabilität für große Moleküle festgestellt (CHANG et al. 2018). Bei Ziegen führte eine Ca2+-reduzierte Fütterung zu einer gesteigerten mRNA-Expression von Cadherin-17 im proximalen Jejunum (ELFERS et al. 2016).
2.4.9 Vitamin D-Rezeptor
Der kernständige Vitamin D-Rezeptor (VDR) ist ein Liganden-aktivierter Transkriptionsfaktor und Teil der Steroidrezeptor-Superfamilie. Im Darm von Wiederkäuern wurde immunhistochemisch die größte Menge an VDR im Duodenum nachgewiesen, gefolgt vom Jejunum und Ileum (LIESEGANG et al. 2008; RINER et al. 2008). Diese segmentale Verteilung des VDR wurde ebenso auf mRNA-Ebene bei Mäusen und Hühnern nachgewiesen (CHOW et al. 2013; HAN et al. 2018).
18
VDR reguliert die Expression zahlreicher Gene, die an der zellulären Proliferation und Differenzierung, der Immunantwort sowie der Regulation der Pi- und Ca2+-Homöostase beteiligt sind (WANG et al. 2012). Durch die Bindung von Calcitriol an den VDR wird die intestinale Resorption von Pi und Ca2+, ihre Mobilisierung aus dem Knochen und die Resorption von Ca2+ in der Niere stimuliert (DELUCA 2004). Bei VDR-KO-Mäusen traten Hypokalzämie, Hypophosphatämie und Hyperparathyreoidismus auf. Ein gestörter Knochenstoffwechsel manifestierte sich in Form einer Rachitis und Osteomalazie (DEMAY 2006). Eine Studie mit Vitamin D-defizienten Ratten kam zu dem Ergebnis, dass die Expression des VDR durch seinen eigenen Liganden stimuliert wird. Die Verabreichung von Calcitriol hatte eine intestinale Expressionssteigerung des Rezeptors sowohl auf mRNA als auch auf Proteinebene zur Folge (STROM et al.
1989).
Eine weitere Studie mit Ratten ergab, dass eine P-reduzierte Fütterung in einer Expressionssteigerung des intestinalen VDR-Proteins resultiert und es wurde angenommen, dass diese durch Calcitriol vermittelt war (SRIUSSADAPORN et al.
1995). Frühere Studien mit P-depletierten Ziegen befassten sich mit der Rezeptor- Bindungsaffinität und stellten fest, dass diese bei laktierenden (SCHRÖDER et al.
1990), nicht aber bei wachsenden Ziegen erhöht war (SCHRÖDER et al. 1995b). Bei Ca2+-reduziert gefütterten Ziegen konnte eine gesteigerte mRNA-Expression des Rezeptors im Ileum gezeigt werden, während die Proteinexpression unbeeinflusst war (ELFERS et al. 2015).
19 3 Hypothesen und Zielsetzung
In diesem Versuchsvorhaben soll der intestinale Pi-Transport bei wachsenden Ziegen und dessen Modulation durch eine P-reduzierte Fütterung untersucht werden. Die folgenden Hypothesen werden aufgestellt:
I. Die Lokalisation des intestinalen Pi-Transports wird durch die diätetische P- Reduktion beeinflusst.
II. Der Umfang des transzellulären Pi-Transports nimmt in Folge der diätetischen P-Reduktion zu, indem die intestinalen Expressionen beteiligter Transportproteine wie NaPiIIb, PiT1, PiT2 und/oder Na+/K+-ATPase erhöht werden.
III. Der Umfang des parazellulären Pi-Transports nimmt in Folge der diätetischen P-Reduktion zu, indem einige TJ- und AJ-Proteine, wie Claudin-2, Claudin-12, Occludin oder ZO-1, in ihrer Expression variiert werden.
IV. Das Protein XPR1 ist im Dünndarm von wachsenden Ziegen exprimiert und an der basolateralen Pi-Ausschleusung beteiligt.
Zur Überprüfung, ob es unter einer diätetischen P-Reduktion zu einer örtlichen Verschiebung der intestinalen Pi-Resorption kommt, sollen drei verschiedene Lokalisationen des Dünndarms (Duodenum, mittleres Jejunum und Ileum) der molekularbiologischen Charakterisierung unterzogen werden. Mittels Real-Time quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und Western Blot-Analysen soll untersucht werden, ob die Expressionsmengen der am intestinalen Pi-Transport beteiligten oder potenziell beteiligten Proteine segmental verschieden sind und ob es unter dem angewandten Fütterungsregime zu einer molekularen Anpassung kommt.
In Ussing-Kammern sollen funktionale Untersuchungen des intestinalen Pi-Transports durchgeführt werden. Dabei liegt der Fokus auf dem Duodenum und Ileum, da diese Darmsegmente hinsichtlich des Pi-Transports bei wachsenden Ziegen im Vergleich zum Jejunum weniger erforscht sind. Durch die gezielte Hemmung der transzellulären bzw. parazellulären Pi-Transportroute soll der jeweilige Anteil am Gesamt-Pi-Transport bestimmt werden und ob die P-reduzierte Fütterung diese Verhältnisse beeinflusst.
20
Diese Untersuchungen sollen einen wesentlichen Beitrag zum besseren Verständnis der Regulation der Mineralstoffhomöostase, insbesondere des intestinalen Pi- Transports, durch eine P-reduzierte Fütterung bei wachsenden Ziegen leisten.
21 4 Material und Methoden
4.1 Versuchstiere, Haltung und Fütterungsregime
Für dieses Versuchsvorhaben wurden 14 männliche Ziegenlämmer der Rasse Bunte Deutsche Edelziege im Alter von ca. einer Woche von einem Milchziegenbetrieb aus der Region Hannover bezogen und anhand der Bildung annähernd gewichtsgleicher Paare per Zufallsprinzip in zwei Gruppen mit jeweils sieben Tieren eingeteilt. Die Unterbringung erfolgte im Stallgebäude des Instituts für Physiologie und Zellbiologie in zwei Abteilen mit einer jeweiligen Grundfläche von ca. acht Quadratmetern und Sägemehleinstreu.
Zunächst erfolgte dreimal täglich, um 07:30, 13:00 und 19:00 Uhr, die tierindividuelle Fütterung mit einem handelsüblichen Milchaustauscher für Lämmer (Sprayfo, Trouw Nutrition Deutschland GmbH, Diepholz) aus Nuckelflaschen. Innerhalb einer Woche wurden die Ziegen an das gemeinsame Trinken aus Nuckeleimern gewöhnt.
Weizenstroh und Wasser standen den Tieren ad libitum zur Verfügung. Im Alter von sechs Lebenswochen (LW) und einem durchschnittlichen Körpergewicht von 13,7 kg erfolgte die schrittweise Gewöhnung an das pelletierte Kontrollfutter in Einzelfütterung, indem mittags statt des Milchaustauschers das pelletierte Futter angeboten wurde.
Nach zwei Wochen wurde auch die morgendliche Fütterung mit Milchaustauscher auf das pelletierte Kontrollfutter umgestellt und eine weitere Woche später erfolgte im Alter von 9 LW die vollständige Umstellung auf die zweimal tägliche Fütterung des pelletierten Kontrollfutters um 7:30 und 15:00 Uhr. Innerhalb der fünf darauffolgenden Tage wurde das Kontrollfutter in einer Gruppe schrittweise durch das P-reduzierte Versuchsfutter ersetzt.
Der Abschluss dieser Adaptationsphase markierte den Versuchsbeginn. Die Menge des pelletierten Futters pro Tag und Tier von 55 g ursprüngliche Substanz (uS) pro Kilogramm metabolisches Körpergewicht (55 g uS/kg KGW0,75/d) entsprach jener einer früheren Arbeit mit wachsenden Ziegen (COX 2013). Die Menge (kg uS) des in Gruppenfütterung angebotenen Weizenstrohs entsprach ab der vollständigen Futterumstellung 25 % jener des pelletierten Futters. Die Futteraufnahme wurde im Fall des pelletierten Futters tierindividuell und im Fall des Weizenstrohs durch
22
Gruppenmittelwerte anhand der Differenz zwischen angebotener und verweigerter Futtermenge ermittelt. Durch wöchentliches Wiegen der Ziegen wurde die Futtermenge kontinuierlich angepasst.
4.2 Futter
Die verwendeten pelletierten Futter wurden bei einem kommerziellen Futtermittelhersteller in Auftrag gegeben (ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest). Die Gehalte an Trockensubstanz (TS), Rohasche, Rohprotein, Rohfett und Rohfaser im pelletierten Futter sowie im Weizenstroh wurden mittels Weende-Analyse bestimmt, welche die Standardmethode des Verbandes Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) ist (NAUMANN u. BASSLER 1976). Die Gehalte an Neutral-Detergenzien-Faser nach Amylasebehandlung und Säure-Detergenzien-Faser wurden mit der Van Soest-Methode bestimmt und auf die organische Substanz korrigiert (aNDFom; ADFom) (VAN SOEST et al. 1991). Die P- Gehalte in der TS betrugen für das Kontrollfutter 0,48 % und für das P-reduzierte Futter 0,11 %. Die beiden pelletierten Futter waren isoenergetisch (ca. 12,9 MJ ME/kg TS) und enthielten vergleichbare Mengen an Ca2+ (ca. 12,5 g/kg TS). Die Komponenten und die Zusammensetzung der Futtermittel sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1. Komponenten und Zusammensetzung des Weizenstrohs und der pelletierten Futter.
Elemente Weizenstroh Kontrolle P-Reduktion
Komponenten (g/kg uS)
Sojaextraktionsschrot 68,0 68,0
Harnstoff 24,5 24,5
Weizenstärke 378 379
Zuckerrübenschnitzel 399 399
Abbildung 6. Futterumstellungen im Zeitverlauf.
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Vormischung Mineralstoffe und Vitamine†
10,0 10,0
MgHPO₄•3 H₂O 9,3 -
MgO - 2,2
NaH2PO4•2 H2O 9,7 0,4
NaCl 1,4 1,4
NaHCO3 - 5,0
CaCO3 14,3 14,3
Sipernat 22S‡ 41,8 52,3
Melasse 10,0 10,0
Sojaöl 34,0 34,0
Zusammensetzung*
TS (g/kg) 904 880 884
Nährstoffe (g/kg TS)
Rohasche 39,8 100 101
Rohprotein 25,4 165 169
ADFom 579 87,5 87,1
aNDFom 855 157 179
Rohfett 24,3 43,2 47,5
Harnstoff u. N. 27,8 31,1
Ca 2,8 12,6 12,3
P 0,6 4,8 1,1
Vitamin D3 (IE/kg TS) u. N. 1000 1075
ME (MJ/kg TS) 8,3 12,8 12,9
uS, ursprüngliche Substanz; TS, Trockensubstanz; u. N., unter Nachweisgrenze; ME, metabolisierbare Energie; ADFom, Säure-Detergenzien-Faser nach Veraschung; aNDFom, Neutral-Detergenzien-Faser nach Amylasebehandlung und Veraschung. * Die Zusammensetzung wurde vom Verband der Deutschen Landwirtschaftlichen Untersuchungs-
24
und Forschungsanstalt (VDLUFA) analysiert. † Vormischung Mineralstoffe und Vitamine pro kg: 0,2 g P; 12,1 g Ca; 1,7 g Na; 2,2 g Mg; 1.200.000 IE Vitamin A; 120.000 IE Vitamin D;
10.000 mg Vitamin E; 675 mg Vitamin K; 4.960 mg Fe; 6.336 mg Zn; 501 mg Cu; 3.000 mg Mn; 201 mg Co; 15 mg Se; 202 mg I. ‡ Sipernat 22S (Evonik Industries AG, Essen) ist eine feinpartikuläre Kieselsäure, die in der Lebens- und Futtermittelindustrie als hochsaugfähige Trägersubstanz, Fließregulator, Antibackmittel und Antistaubmittel eingesetzt wird.
4.3 Probenahmen intestinaler Gewebe und Körperflüssigkeiten
Nach einer Versuchsdauer von fünf bis sieben Wochen wurde gruppenalternierend täglich ein Tier per Bolzenschuss betäubt und mittels Kehlschnitt durch Ausbluten getötet. Kurz vor der Schlachtung wurden Blut- und Speichelproben entnommen. Die Blutentnahme von je 9 ml erfolgte durch die Punktion der äußeren Jugularvene mit Lithium-Heparin- und EDTA-beschichteten Monovetten® sowie Serum-Monovetten® (Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht). Durch die Zentrifugation des Vollbluts bei 2000 g für 15 min bei Raumtemperatur (RT) wurde Plasma gewonnen. Die Speichelprobengewinnung erfolgte mittels Salivette® (Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht), indem ein Wattetupfer mit einer Arterienklemme für 2 min in der Wangentasche der Ziegen platziert und anschließend im Probengefäß bei 1000 g für 2 min bei RT zentrifugiert wurde. Aus Pansen und Labmagen wurden je 50 ml Flüssigkeit entnommen. Die Blut- und Speichelproben sowie die Flüssigkeiten aus Pansen und Labmagen wurden bei -20 °C gelagert.
Teile des Duodenums, mittleren Jejunums und Ileums wurden innerhalb von 5 min nach dem Tod des Tieres entnommen. Für die Ussing-Kammer-Versuche wurden Teile des Duodenums und Ileums mit eiskalter Kochsalzlösung (0,9 %, w/v) gespült, entlang der Mesenteriallinie eröffnet und in einer modifizierten glucosehaltigen Krebs- Henseleit-Pufferlösung unter Carbogenbegasung (95 % O2, 5 % CO2) für die weitere Präparation aufbewahrt. Für die RNA-Isolierung und die Gesamtmembranpräparation wurde die Tunica mucosa aller entnommenen Darmsegmente abgestreift, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.
25
4.4 Funktionale Untersuchung intestinaler Epithelien
Ussing-Kammern ermöglichen die Charakterisierung transepithelialer Transportvorgänge, indem sie Daten für die Bestimmung von Fluxraten und elektrophysiologischer Parameter generieren. Die Experimente wurden mit duodenalen und ilealen Gewebeproben unter Verwendung von zwölf Ussing- Kammern für jedes Segment durchgeführt. Nach der Entfernung der Tunica serosa und der Tunica muscularis wurde die verbleibende Tunica mucosa zwischen die beiden Hälften der Inkubationskammer mit einer exponierten serosalen Fläche von 1,0 cm² montiert, sodass jede Kammer in ein mukosales und ein serosales Kompartiment unterteilt wurde (Abbildung 7).
Beide Seiten des Gewebes wurden mit 10 ml einer 38 °C warmen Pufferlösung inkubiert, die kontinuierlich mit Carbogen begast und so auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt wurden. Dieser pH-Wert entspricht jenem der extrazellulären Flüssigkeit.
Beide Pufferlösungen enthielten (mmol•l-1) 113,6 NaCl, 5,4 KCl, 0,2 HCl (1n), 1,2 MgCl2•6H2O, 21,0 NaHCO3, 1,2 CaCl2•2H2O, 1,2 Na2HPO4•2H2O, 1,2 Mannitol und 0,01 Indomethacin. Letzteres ist ein unspezifischer Hemmstoff der Cyclooxygenasen, der zur Vorbeugung von Prostaglandin-vermittelten Gewebsreaktionen eingesetzt wird. Der serosale Puffer enthielt außerdem (mmol•l-1) 10,0 Glucose, 6,0 Na+-Gluconat und 7,0 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), während dem mukosalen Puffer 6,0 NaOH (1n) und 20,0 HEPES zugesetzt wurden.
Am Ende des Experiments wurde Na+-Arsenat (5 mmol•l-1) oder 2,4,6- Triaminopyrimidin (TAP) (20 mmol•l-1) auf die mukosale Seite von jeweils vier Kammern zugegeben. Als kompetitiver Inhibitor des Na+-abhängigen Pi-Transports wird Na+-Arsenat verwendet, um den transzellulären Pi-Weg zu untersuchen (BUSCH et al. 1996). TAP wird für die Untersuchung des parazellulären Pi-Wegs eingesetzt, da es TJ-Proteine blockiert (MORENO 1975; SIMMONS u. NAFTALIN 1976) und somit den parazellulären Pi-Transport hemmen soll. Die übrigen vier Kammern waren Zeitkontrollen, denen keine Inhibitoren zugesetzt wurden.
26 4.4.1 Fluxratenbestimmung
Die Untersuchung der transepithelialen Fluxraten von Pi im Duodenum und Ileum, welche auf der Radioisotopentracer-Technik basiert, wurde nach etablierten Protokollen unter Verwendung von ³²P und ³H(-Mannitol) als Radioisotopentracer durchgeführt (SCHRÖDER et al. 1995a). ³²P wurde verwendet, um den Gesamt-Pi- Transport nachzuvollziehen, während (3H-)Mannitol den parazellulären Pi-Transport markierte (AUCHERE et al. 1998). Nach einer Äquilibrierungszeit von 5-10 min wurden 148 kBq des jeweiligen Radioisotops entweder auf der serosalen oder mukosalen Seite jeder Ussing-Kammer zugegeben.
Über einen Zeitraum von 60 min wurden im Abstand von 15 min Proben (500 µl) von der nicht radioaktiv markierten Seite entnommen und sofort durch gleiche Volumina der jeweiligen Pufferlösung ersetzt. Zusätzlich wurden zu Beginn und am Ende des Experiments Proben (50 µl) von der radioaktiv markierten Seite entnommen. Um Aufschluss über den jeweiligen Anteil des transzellulären und parazellulären Pi-
Abbildung 7. Schematischer Aufbau einer Ussing-Kammer (modifiziert nach HOENIG u. ZEIDEL (2014)).
27
Transports am gesamten transepithelialen Pi-Transport zu erhalten, wurden außerdem Probenahmen (500 µl) nach der Zugabe der Inhibitoren durchgeführt und sofort durch gleiche Volumina der jeweiligen Pufferlösung ersetzt. Zur Bestimmung der Radioaktivität der Proben wurde ein Flüssigszintillationszähler (Packard BioScience Company, Meriden, Connecticut, USA) verwendet. Unter Ausschluss elektrochemischer Gradienten wurden unidirektionale Fluxraten von Pi und Mannitol von der mukosalen zur serosalen Seite (Jms) und in der Gegenrichtung von der serosalen zur mukosalen Seite (Jsm) aus der Auftrittsrate des jeweiligen Tracers auf der nicht radioaktiv markierten Seite unter Verwendung von Standardgleichungen berechnet (SCHULTZ u. ZALUSKY 1964). Die Netto-Fluxraten (Jnet) wurden bestimmt, indem Jsm von Jms der gepaarten Gewebe subtrahiert wurde.
4.4.2 Elektrophysiologische Untersuchung
Die Ussing-Kammer-Versuche wurden unter kurzgeschlossenen Bedingungen durchgeführt, indem ein externer Strom (Isc) mittels Stromelektroden durch das Epithel geleitet wurde. Die über dem Epithel bestehende Potentialdifferenz wurde somit auf null geklemmt und die elektrische Antriebskraft des passiven Ionentransports eliminiert. Der applizierte Isc ist äquivalent zur algebraischen Summe der spontanen elektrogenen Ionenbewegung durch den aktiven Transport. Ein positiver Wert zeigt an, dass hauptsächlich positiv geladene Ionen in serosaler Richtung oder negativ geladene Ionen in entgegengesetzter Richtung transportiert werden (CLARKE 2009).
Mit einer computergesteuerten Spannungsklemme (Mussler Scientific Instruments, Aachen) wurden die Potentialdifferenz, die Gewebeleitfähigkeit (Gt) und der Isc kontinuierlich erfasst. Die Basalwerte für Gt und Isc wurden als Mittelwerte über die Zeit vor der Zugabe von Na+-Arsenat bzw. TAP bestimmt.
Um die Auswirkungen dieser Inhibitoren auf die transepithelialen Transportvorgänge im Duodenum und Ileum zu untersuchen, wurden Veränderungen von Gt und Isc nach der Zugabe beobachtet. Zur Überwachung des Gewebezustands diente sowohl die kontinuierliche Aufzeichnung von Gt und Isc als auch die Zugabe von Glucose (10 mmol•l-1) auf der mukosalen und Forskolin (0,01 mmol•l-1) auf der serosalen Seite aller Kammern am Ende der Experimente. Die Isc-Änderung nach der Zugabe dieser
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Substanzen ist im Fall der Glucose Carrier-vermittelt und im Fall des Forskolins auf eine Second messenger-vermittelte Chloridsekretion zurückzuführen und dient als Indikator für die Vitalität des Gewebes.
4.5 Molekularbiologische Untersuchung intestinaler Epithelien
4.5.1 Intestinale mRNA-Expressionen von Na+/K+-ATPase, NaPiIIb, PiT1, PiT2, VDR, XPR1, Cadherin-17, Claudin-1, Claudin-2, Claudin-12, Claudin-15, Occludin und ZO-1
Mit dem RNeasy® Plus Mini-Kit (Qiagen GmbH, Hilden) wurde die Gesamt-RNA nach dem Protokoll des Herstellers isoliert. Die Konzentration und Integrität der isolierten RNA wurde spektrophotometrisch mit dem NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) und einem RNA 6000 Nanoassay für einen Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Böblingen) gemessen. Gemäß dem Herstellerprotokoll wurden 200 ng der isolierten RNA unter Verwendung von TaqMan™ Reverse Transcription Reagenzien einschließlich Random-Hexamer- und Oligo-dT-Primern (Applied Biosystems Inc., Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) zur Erzeugung komplementärer DNA (cDNA) revers-transkribiert.
Um die epitheliale mRNA-Expression von 18S, Claudin-2 und Claudin-12 im Duodenum, mittleren Jejunum und Ileum zu quantifizieren, wurden caprin-spezifische TaqMan™ Primer und Sonden von TIB MOLBIOL (Berlin) erworben (Tabelle 2). Die Reaktionsmischungen von 20 µl enthielten den TaqMan™ Universal Master Mix (Applied Biosystems Inc.), 16 ng revers-transkribierte cDNA, 300 nmol•l-1 spezifische Primer und 100 nmol•l-1 spezifische Sonde. Die PCR-Produktamplifikation (2 min bei 50 °C; 10 min bei 95 °C; 40 Zyklen von 15 s bei 95 °C und 1 min bei 60 °C) und die Analyse wurden mit einem Real-Time PCR-Cycler (CFX96TM; Bio-Rad Laboratories GmbH, München) durchgeführt. Die Expressionen von NaPiIIb, PiT1, PiT2, Na+/K+- ATPase, XPR1, Claudin-1, Claudin-15, Cadherin-17, Occludin, ZO-1 und VDR in den Epithelien des Duodenums, des mittleren Jejunums und des Ileums wurden mit SYBR Green® PCR-Assays bestimmt. Spezifische Primer für die Quantifizierung der mRNA- Expression wurden im Fall von NaPiIIb, PiT1, Cadherin-17, Occludin und ZO-1 von TIB MOLBIOL GmbH (Berlin) und im Fall der Na+/K+-ATPase, PiT2, VDR, XPR1,
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Claudin-1 und Claudin-15 von Thermo Fisher Scientific Inc. synthetisiert (Tabelle 3).
Die Reaktionsgemische von 20 µl enthielten SensiFAST™ SYBR No-Rox Mix (BioCat, Heidelberg), 16 ng revers-transkribierte cDNA und 200 nmol•l-1 spezifische Primer. Die PCR-Produktamplifikation (3 min bei 95 °C; 40 Zyklen von 10 s bei 95 °C und 30 s bei 60 °C) und die Analyse wurden mit einem Real-Time PCR-Cycler (CFX96TM; Bio-Rad Laboratories GmbH) durchgeführt. Zur Bestimmung der Schmelzkurve begann das thermische Profil mit einer Inkubation von 10 min bei 55 °C, auf die eine allmähliche Temperaturerhöhung (0,5 °C/10 s) auf 95 °C folgte. Mithilfe von Kalibrierungskurven, generiert mit klonierten PCR-Fragmentstandards, wurden die absoluten Kopienzahlen bestimmt (WILKENS et al. 2009).
Die Spezifität der Amplikons wurde durch Sequenzierung (Microsynth Seqlab GmbH, Göttingen) und mittels NCBI Blast (Bethesda, MD, USA, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) verifiziert. Die Expressionsmengen der untersuchten Gene wurden auf 18S als konstant exprimiertes Referenzgen normalisiert. Jede Reaktion wurde zweimal durchgeführt und beinhaltete eine no template control (NTC).
Tabelle 2. Primer und Sonden der TaqMan™-Assays.
Gene Primer und Sonden (5’ → 3’) Accession
number Referenzen
18S
Forward: AAAAATAACAATACAGGACTCTTTCG Reverse: GCTATTGGAGCTGGAATTACCG 6FAM-TGGAATGAGTCCACTTTAAATCCTTCCGC- BBQ
KY129860 (WILKENS et al. 2018)
Claudin-2
Forward: CCAAAGACAGAGTGGCGGT Antisense: TCAAATTTCATGCTGTCAGGCAC FAM-TCCTGGGCTTCATCCCYGTTGC-BBQ
XM_00570 0206.3
(ELFERS et al. 2016)
Claudin-12
Sense: GCTGCTCTGCCTCATCGG Antisense: GCAGCCYGCACTATTGACCA FAM-TGTGTAACACGGCCTTCAGGTCCTC-BBQ
XM_00567 8898.3
(ELFERS et al. 2016)
30
Tabelle 3. Primer der SYBR Green-Assays.
Gene Primer (5’ → 3’) Accession
number Referenzen Na+/K+-
ATPase
Sense: TGGAACTCGGAGAAGAAGGA
Antisense: GCCACTCGGTCCTGATATGT XM_005690616.3 (ELFERS et al. 2015)
NaPiIIb Sense: CGGTCCAAAACAAAAGTATGATCAAG Reverse: AGCCAAAGGGGTAAGGGAA
XM_005681484.3 und
XM_013964569.2
(ELFERS et al. 2015)
PiT1 Sense: ATTCATCCTCCGTAAGGCAGATC
Antisense: CAGCAATGGTGCTCCAGTATACA XM_018055327.1 (ELFERS et al. 2015)
PiT2 Forward: CCAATCTCGGGGACTCACTG Reverse: GGAACGGGGTCCTCCTTTTT
XM_018041866.1 bis
XM_018041872.1
(BEHRENS et al. 2021)
VDR Forward: GCACTTCCTTACCTGACCCC Reverse: CCGCTTGAGGATCATCTCCC
XM_018047872.1 und
XM_018047873.1
(HERM et al. 2015)
XPR1 Forward: AATGCCGATGATCAGACGCT
Reverse: AGCCTTGGATTGAGAAGCGA XM_018060672.1 (BEHRENS et al. 2021)
Cadherin-17 Sense: CACCCTTTTGGTCATCGGTAT
Antisense: CATCAGTTTCTCAGAGGCTTGACT XM_018058228.1 (ELFERS et al. 2016)
Claudin-1 Forward: TTCATCCTGGCGTTTCTGGG
Reverse: GTTGCTTGCAGAGTGCTGTT XM_005675123.3 (BEHRENS et al. 2021)
Claudin-15 Forward: AGGGACTTCTTCGACCCCTT Reverse: CGTTATCACGGGGGCTTTGT
XM_013974836.2 bis
XM_018040880.1
(BEHRENS et al. 2021)
Occludin
Sense: CTCGTCTGGATAAAGAACTGGATGA Antisense:
CTCGTCTGGATAAAGAACTGGATGA
XM_018065677.1 bis
XM_018065681.1
(ELFERS et al. 2016)
ZO-1 Sense: CTCAGTACAGCCAGGGTGCT Reverse: TCCGGTTTGGACACTAATGAGTT
XM_018066114.1 bis
XM_018066118.1
(ELFERS et al. 2016)
