Syntrophe Oxidation der Fettsäure Acetat und des biogenen Amins Cadaverin (1,5-Diaminopentan) durch definierte methanogene Kokulturen

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Syntrophe Oxidation der Fettsäure Acetat und des biogenen Amins Cadaverin (1,5-Diaminopentan) durch definierte

methanogene Kokulturen

Dissertation

Zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

an der Universität Konstanz Fachbereich Biologie

vorgelegt von

Julia Christine Yvonne Röder

Tag der mündlichen Prüfung: 10.09.2010

Referent: Prof. Dr. Bernhard Schink, Universität Konstanz Referent: Prof. Dr. Alisdair Cook, Universität Konstanz

Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URN: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-123513

URL: http://kops.ub.uni-konstanz.de/volltexte/2010/12351/

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Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ...5

2 Abkürzungsverzeichnis ...8

3 Einleitung ...11

3.1 Syntrophie und revertierter Elektronentransport ... 11

3.2 Vorkommen und Verbreitung von Cadaverin... 12

3.3 Vorkommen und Verbreitung von Acetat ... 14

3.4 Ziele der Arbeit ... 17

4 Material und Methoden ...18

4.1 Chemikalien ... 18

4.2 Mikrobiologische Methoden ... 18

4.2.1 Herkunft der Organismen... 18

4.2.2 Nährmedium für die Cadaverin-oxidierende Kultur... 18

4.2.3 Herstellung des Grundmediums ... 20

4.2.4 Nährmedium für Thermacetogenium phaeum DSMZ 880 ... 20

4.2.5 Herstellung des DSMZ 880 Mediums ... 23

4.2.6 Natriumfreies Nährmedium für Thermacetogenium phaeum DSMZ 880 ... 23

4.2.7 Herstellung des natriumfreien DSMZ 880 Mediums ... 25

4.2.8 Nährmedium der Acetat-oxidierenden Kokultur SYNAC DSMZ 318 ... 26

4.2.9 Herstellung des DSMZ 318 Mediums ... 28

4.2.10 Komplexmedien ... 28

4.2.11 Substratlösungen für Wachstumsversuche der Kokultur LC 13M... 28

4.2.12 Verdünnungsreihe in Flüssigmedium zur Reinkultivierung anaerober Bakterien ... 28

4.2.13 Stammhaltung und Kultivierungstechniken ... 29

4.2.14 Bestimmung von Wachstumsparametern ... 29

4.2.15 Wachstumsversuche mit der Kokultur LC 13M... 30

4.2.16 Substratspektrum der Kokultur LC 13M ... 30

4.2.17 Temperatur-, pH-Optimum, Salz- und Phosphattoleranz ... 31

4.2.18 Auswirkung von Na⁺ auf das Wachstumsverhalten des acetogenen Bakteriums Thermacetogenium phaeum ... 31

4.2.19 Elektronentransport zwischen den Partnern der Acetat-oxidierenden Kokultur Synac... 32

4.3 Beschreibung von Bakterienisolaten ... 32

4.3.1 Agarosebeschichtete Objektträger modifiziert nach Wagener et al. 1986 ... 32

4.3.2 Bestimmung des Gram-Typs der Zellwand ... 33

4.3.3 Geißelfärbung ... 33

4.3.4 Nachweis von Cytochromen ... 33

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4.4 Nasschemische Analysen ... 33

4.4.1 Photometrische Tests ... 33

4.5 Chromatographische Methoden ... 34

4.5.1 Gaschromatographie mit FID... 34

4.5.2 Gaschromatographie mit WLD ... 34

4.5.3 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie / High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)... 35

4.6 Biochemische Methoden ... 36

4.6.1 Mikro-Proteinbestimmung (nach Pierce) ... 36

4.6.2 Anoxische Zellernte der methanogenen Kokultur LC 13M ... 37

4.6.3 Anoxische Zellernte der methanogenen Kokultur Synac ... 37

4.6.4 Enzymtests ... 38

4.7 Molekularbiologische Methoden ... 40

4.7.1 Polymerasekettenreaktion (Kokultur LC 13M) ... 40

4.7.2 Reinigung der PCR-Produkte ... 41

4.7.3 Agarosegelelektrophorese ... 42

4.7.4 Sequenzierung ... 42

4.7.5 SDS Gelelektophorese ... 42

4.7.6 Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen mit kolloidalem Coomassie-Blau ... 42

4.7.7 2D Gelelektophorese ... 43

4.7.7.1 Isoelektrische Fokussierung ... 43

4.7.7.2 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese... 43

5 Ergebnisse ...45

5.1 Syntrophe Cadaverinoxidation durch eine methanogene Kokultur LC 13M ... 45

5.1.1 Isolierung und Charakterisierung einer methanogenen Kokultur LC 13M ausgehend von der sulfatreduzierenden Kokultur LC 13d ... 45

5.1.1.1 Isolierung mittels Verdünnungsreihen in Flüssigmedium ... 45

5.1.1.2 Charakterisierung der methanogenen Kokultur LC 13M ... 45

5.1.1.3 Biochemie der methanogenen Kokultur LC 13M ... 50

5.1.1.4 Phylogenie der methanogenen Kokultur LC 13M... 52

5.2 Syntrophe Acetatoxidation durch eine methanogene Kokultur Synac ... 53

5.2.1 Cytologische Eigenschaften der Reinkultur Thermacetogenium phaeum bzw. der Kokultur Synac ... 53

5.2.2 Physiologische Eigenschaften der Reinkultur Thermacetogenium phaeum bzw. der Kokultur SYNAC .. 54

5.2.2.1 Einfluss von Na⁺ auf das Wachstum und die Produktbildung des acetogenen Bakteriums Thermacetogenium phaeum ... 54

5.2.2.2 Elektronentransfer zwischen den Partnern der Kokultur Synac... 56

5.2.2.3 Cytochrome des acetogenen Bakteriums Thermacetogenium phaeum ... 56

5.2.3 Biochemische Eigenschaften der Reinkultur des acetogenen Bakteriums T. phaeum bzw. der Kokultur Synac ... 57

(4)

5.2.4 Elektrophoretische Eigenschaften der Reinkultur T. phaeum, bzw. der Kokultur Synac ... 63

5.2.4.1 Eindimensionale Gelelektrophorese ... 63

5.2.4.2 Zweidimensionale Gelelektrophorese ... 64

6 Diskussion ...65

6.1 Diskussion: syntrophe Cadaverin-Oxidation durch eine methanogene Kokultur LC 13M... 65

6.1.1 Isolierung einer Cadaverin-oxidierenden, methanogenen Kokultur ... 65

6.1.2 Physiologie der methanogenen Kokultur LC 13M ... 65

6.1.3 Biochemie der methanogenen Kokultur LC 13M ... 66

6.1.4 Taxonomie der Reinkultur LC 13R ... 71

6.2 Diskussion: syntrophe Acetat-Oxidation durch eine methanogene Kokultur Synac ... 72

6.2.1 (Homo)-Acetogenese als spezielle Form der anaeroben Atmung mit CO2 als Elektronenakzeptor : der reduktive Acetyl-CoA-Weg/Wood-Ljungdahl-Weg ... 72

6.2.2 Energiekonservierung in acetogenen Bakterien ... 74

6.2.2.1 Na⁺-abhängige Organismen ... 75

6.2.2.2 H⁺-abhängige Organismen ... 76

6.2.3 Einfluss von Na⁺ auf das Wachstum und die Produktbildung des acetogenen Bakteriums Thermacetogenium phaeum ... 78

6.2.4 Elektronentransfer zwischen den Partnern der methanogenen Kokultur Synac ... 80

6.2.5 Potentielle Mechanismen der Ausbildung eines transmembranen H⁺/Na⁺ -Gradienten während der syntrophen Oxidation von Acetat durch die methanogene Kokultur Synac ... 80

6.2.5.1 NADH-Dehydrogenase I (NDH-I) ... 82

6.2.5.2 NADH : Chinon Oxidoreduktase (NQR) ... 83

6.2.5.3 Rnf-Protein-Komplexe ... 83

6.2.5.4 Elektronendismutierende Systeme ... 84

6.2.5.5 Ech (Energy converting hydrogenase)-Hydrogenasen ... 87

6.2.6 Potentielle - an der Energiekonservierung der Reinkultur - beteiligte Enzyme bzw. Enzymsysteme ... 89

6.2.7 Potentielle - an der Energiekonservierung der syntrophen Oxidation von Acetat - beteiligte Enzyme bzw. Enzymsysteme ... 93

6.3 Ausblick ... 99

7 Literaturverzeichnis ... 100

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1 Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurde die anaerobe, syntrophe Oxidation der Fettsäure Acetat und des biogenen Amins Cadaverin (1,5-Diaminopentan) durch zwei verschiedene definierte methanogene Kokulturen untersucht.

Es sollte geklärt werden auf welche Weise die syntrophe thermophile Kokultur SynAc die Fettsäure Acetat anaerob oxidiert. Dazu sollte das Acetat vergärende Bakterium Thermacetogenium phaeum - einerseits in Reinkultur, andererseits syntroph gewachsen - auf das Vorhandensein der Schlüssel- Enzyme des Wood-Ljungdahl Abbauweges untersucht werden. Unterschiede in der Enzymexpression unter beiden Wachstumsbedingungen sollten biochemisch und proteomisch untersucht und dargestellt werden. Die Proteine sollten bezüglich ihrer Lokalisation in den Kompartimenten in cytoplasmatische, oder Membran-assoziierte, bzw. –integrierte Proteine eingeordnet werden.

Aufgrund dieser spezifischen Anordnung sollten Rückschlüsse auf die möglichen energieliefernden Schritte des Acetatabbaus gezogen werden. Eine eventuelle Natriumabhängigkeit des acetogenen Bakteriums T. phaeum sollte untersucht werden.

Die aus der Anreicherungskultur La Cad isolierte syntrophe mesophile Kokultur LC 13M sollte physiologisch und phylogenetisch charakterisiert werden. Es sollte der Weg des Cadaverinabbaus durch biochemische Methoden aufgeschlüsselt werden. Die sich dabei bildenden Produkte sollten bestimmt und quantifiziert werden.

In beiden Projekten sollten die Enzyme identifiziert werden, die an der ATP-Synthese und an den revertierten Elektronentransportsystemen beteiligt sind, bei welchen primär synthetisiertes ATP reinvestiert werden muss .

1. Das gärende Bakterium T. phaeum in der thermophilen Kokultur SynAc verfügt über die charakteristischen Enzyme des Wood-Ljungdahl Abbauweges und wäre somit in der Lage Acetat zu oxidieren. Diese Reproduzierbarkeit der Enzymmessungen bestätigt unsere bisherigen Untersuchungen.

2. Die Expression bzw. Lokalisation der untersuchten Enzyme unterscheidet sich bei der Kultivierung von T. phaeum in Reinkultur versus syntroph gewachsener Zellen und ermöglicht die Skizzierung eines hypothetischen Modells der Enzymanordung in T. phaeum.

3. Das scheinbare Vorhandensein von sog. Ech Hydrogenasen, einer mit einer Ech-Hydrogenase assoziierten CO-Dehydrogenase, Rnf-Komplexen und eines NADH-Dehydrogenase I ähnlichen

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Zusammenfassung 6 Enzyms, weisen auf eine eventuelle Beteiligung dieser Enzyme bei der Konservierung von Energie hin.

4. Die Natriumabhängigkeit von T. phaeum in Reinkultur scheint abhängig von dem Substrat der vorausgehenden Kultivierung zu sein. Bei Wachstum auf Methanol als Energiequelle scheint das Vorhandensein von Na⁺ nicht notwendig zu sein. Im Gegensatz hierzu lässt sich - bei vorausgegangener autotropher Kultivierung mit H2/CO2 (80/20%) - ohne Natrium kein Wachstum beobachten.

5. Es scheinen bei Kultivierung mit Pyruvat keine Cytochrome in der Membran von T. phaeum vorhanden zu sein, die bei einem eventuellen Elektronentransport in der Membran eine Rolle spielen könnten.

6. Die isolierte mesophile Kokultur LC 13M verwertet das biogene Amin Cadaverin (1,5- Diaminopentan) anaerob als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle. Als Zwischen- bzw.

Endprodukte wurden Acetat, Butyrat, Glutarat und Methan gefunden, welche qualitativ und quantitativ bestimmt wurden. Bei Hemmung des methanogenen Partnerorganismus durch BES konnte kein Wachstum der definierten KoKultur beobachtet werden.

7. Die Kultur LC 13M kann auf alternativen Substraten unter ähnlicher Produktbildung wachsen.

8. Das gärende Bakterium verfügt über eine Enzymausstattung, die einen Abbau des Cadaverins nach dem skizzierten Abbauweg ermöglichen.

9. Ein revertierter Elektronentransport scheint nicht an das Vorhandensein eines speziellen Konzeptes der Elektronendismutation (sog. „Buckel-Thauer“ Reaktion) und dementsprechend nicht an die daran beteiligten Enzyme gekoppelt zu sein.

10. Der Cadaverin-oxidierende Partner konnte phylogenetisch eingeordnet werden.

Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass das acetogene Bakterium T. phaeum die Fettsäure Acetat anaerob syntroph über den Wood-Ljungdahl-Weg oxidiert. Dieser Abbau scheint je nach vorausgehender Kultivierung nicht an das Vorhandensein von Natrium gebunden zu sein.

Dementsprechend könnte es sich bei Thermacetogenium phaeum um ein H⁺-abhängiges, acetogenes Bakterium handeln. Der Elektronentransfer scheint primär über Wasserstoff, aber auch in gewissem Maße über Formiat stattzufinden. Die Lokalisation der beteiligten Enzyme lassen erste Rückschlüsse auf die möglichen energiekonservierenden Schritte dieses Acetatabbaus zu. Jedoch müssen diese Annahmen durch Proteomanalysen bestätigt werden. Es war möglich erste Unterschiede in den Proteinmustern der cytoplasmatischen Fraktion mit Hilfe von 2D-Gelelektrophorese darzustellen.

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Zusammenfassung 7 Diese Methode muss jedoch weiter optimiert werden, damit eine N-terminale Sequenzierung der betreffenden Proteine durchgeführt werden kann.

Weiterhin deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die definierte, methanogene Kokultur LC 13 M das biogene Amin Cadaverin (1,5-Diaminopentan) nach einem hier skizzierten hypothetischen Abbauweg anaerob oxidiert und das Substrat somit als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen kann. Der anaerobe Abbau von Cadaverin ist an eine syntrophe Partnerschaft mit einem methanogenen Partnerorganismus gekoppelt, wobei der Elektronenaustausch über Wasserstoff und nicht über Formiat zu erfolgen scheint. Der revertierte Elektronentransport scheint nicht mit Hilfe der an der „Buckel-Thauer“ Reaktion beteiligten Enzyme zu erfolgen. Die NADH- oxidierenden Enzyme müssen lokalisiert und identifiziert werden, um eine Aussage hinsichtlich ihrer Beteiligung am revertierten Elektronentransport treffen zu können.

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2 Abkürzungsverzeichnis

Acetyl-CoA Acetyl-Coenzym A

ACS Acetyl-CoA-Synthase

ACMA 9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridin

ADP Adenosindiphosphat

AMP Adeninmonophosphat

APAD⁺ 3-Acetylpyridin adenine dinukleotid oxidierte Form

ATP Adenosintriphosphat

-KG alpha-Ketoglutarat

bidest. bidestilliert

BES 2-Bromethansulfonsäure

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bp Base pair (Basenpaar)

BVox./red. Benzylviologen (1,1’-Dibenzyl-4,4-bipyridinium)

oxidierte/reduzierte Form

C Konzentration

CoA-SH Coenzym A

D Schichtdicke der Küvette

Da Dalton

DCCD N,W-Dicyclohexylcarbodiimid

DH Dehydrogenase

DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

DTE Dithioerythritol

DTT Dithiothreitol

 Extinktion

EC Kennnummer der Enzyme Nomenclature des

Nomenclature Comittee der International Union

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of Biochemistry and Molecular Biology (1992)

 molarer Extinktionskoeffizient

 Extinktionsänderung

EDTA Ethylendiamintetraacetat

FAD Flavinadenosindinukleotid oxidierte Form

Fdox./red. Ferredoxin oxidierte/reduzierte Form

FID Flammenionisationsdetektor

GC Gaschromatographie

HCl Chlorwasserstoffsäure

HPLC High Performance Liquid Chromatography

(Hochdruck-Flüssig-Chromatographie)

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure INT 2-[4-iodophenyl]-. 3-[4-nitrophenyl]-5- phenyltetrazolium

Chloride

K3[Fe(CN)6] Kaliumhexacyanidoferrat(III)

LDH Laktatdehydrogenase

MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonsäure

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

MVox./red. Methylviologen oxidierte/reduzierte Form

NAD⁺ Nikotinsäureamidadenosindinukleotid oxidierte Form NADH/H⁺ Nikotinsäureamidadenosindinukleinsäure reduzierte Form

NBT Nitrotetrazoliumblau

OD „Optische Dichte“ einer Bakteriensuspension bei der Wellenlänge 

PCR Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

PEP Phosphoenolpyruvat

RNS Ribonukleinsäure

SDS Natriumdodecylsulfat

Rpm Rounds per minute (Umdrehungen in der Minute)

T Zeit

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TBE Tris-Borat-EDTA

TCA Trichloressigsäure

TEA Triethanolamin

THF Tetrahydrofolat

Tris Tris (hydroxymethyl)-Aminomethan

TTC 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid

U Units

V Volumen

Ym molarer Wachstumsertrag

YATP Energieertragskoeffizient

% (v/v) Volumenprozent

% (w/v) Gewichtprozent

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3 Einleitung

3.1 Syntrophie und revertierter Elektronentransport

Syntrophie ist ein spezieller Fall von Symbiose bei der zwei metabolisch verschiedene Bakterienspezies aus energetischen Gründen voneinander abhängig sind. Im Gegensatz zu Symbiose ermöglicht das syntrophe Zusammenleben zweier metabolisch unterschiedlicher Bakterientypen diesen Partnern die Fähigkeit metabolische Aktionen, wie den Abbau eines speziellen Substrates vorzunehmen, zu denen keiner der beiden alleine in der Lage wäre. Die Abhängigkeit zweier syntropher Partner kann sogar so weit gehen, dass keiner der einzelnen Partner ohne den anderen agieren kann. Viele anaerobe Bakterien sind von der syntrophen Kooperation mit diversen metabolisch verschiedenen Bakterien abhängig. Die komplette Oxidation von komplexem, organischem Material zu Methan und CO2 kann nur von einer Gemeinschaft metabolisch verschiedener Bakterien erreicht werden.

Dieses Phänomen tritt vor allem bei Bakterien auf, denen aufgrund ihrer metabolischen Fähigkeiten nur eine sehr geringe Energiemenge zur Verfügung steht, wie Fettsäure-oxidierende Bakterien. In diesem Fall kooperieren Fettsäure-oxidierende Bakterien mit hydrogenotrophen, methanogenen Archaebakterien. Niedrige Wasserstoffpartialdrücke, die durch hydrogenotrophe Organismen (methanogene Archaebakterien, sulfatreduzierende Bakterien, Homoacetogene Bakterien erreicht werden, ermöglichen die Vergärung von Fermentationsprodukten (Acetat, Butyrat, etc.), die unter Standardbedingungen nicht stattfinden könnte. Dabei werden Reduktionsäquivalente [H] in Form von z.B. H2 oder Formiat vom fermentierenden Organismus auf den Partnerorganismus übertragen.

Da die Oxidation der Substrate direkt an die Bildung von reduzierten Co-Faktoren (NADH, Fdred. etc.) gekoppelt ist, erreichen die so übertragenen Elektronen jeweils unterschiedliche Redoxpotentialstufen und können nicht immer als molekularer Wasserstoff freigesetzt werden.

Bei reduziertem Ferredoxin befinden sich die Elektronen auf einem Potentialwert von ca. -420 mV, was die Freisetzung von molekularem Wasserstoff in einer Hydrogenasereaktion ermöglichen würde.

Im Gegensatz hierzu befinden sich die Elektronen bei der Reduktion von NAD⁺ zu NADH/H⁺ auf einem viel positiveren Redoxpotential von -320 mV und können somit nicht in einer analogen Weise freigesetzt werden. Welche Enzyme bzw. Proteinkomplexe für diesen sog. „revertierten Elektronentransport“ - der Elektronen vom Level des NADH/H⁺ auf das Level von Protonen H⁺

„bergauf“ transportiert - verantwortlich sind, ist in den meisten Organismen bis heute nicht vollständig geklärt. Es wird angenommen, dass NADH-Dehydrogenase Komplex 1-ähnliche Enzyme, miteinander gekoppelte Enzymsysteme wie Butyryl-CoA Dehydrogenase und NADH: Ferredoxin Oxidoreduktase (Li et al. 2008; Herrmann et al. 2008), komproportionierende Hydrogenasen (Schut

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Einleitung 12

und Adams 2009), oder sog. Rnf (Rhodobacter capsulatus nitrogen fixation) Proteine (Boiangiu et al.

2005) bei diesem speziellen Elektronentransport eine wesentliche Rolle spielen.

Die Methanogenese bildet typischerweise den terminalen Schritt der Elektronenaufnahme im anaeroben Abbau von komplexen organischen Substraten zu Methan und CO2 in Süsswasser- Sedimenten, Sümpfen, Reisfeldern, aber auch im Intestinaltrakt von Tieren.

Die geringe Energieausbeute des methanogenen Abbaus im Vergleich zur anaeroben Atmung, oder alternativen oxidativen Prozessen wie dem aeroben Abbau macht deutlich, weshalb die Methanogenese den am wenigsten exergonen Prozess bildet, nachdem die anderen potentiellen Elektronenakzeptoren bereits reduziert wurden. Diese geringe Energieausbeute hat zur Folge, dass das gebildete Methan einen Großteil der Energie beinhaltet, welche in der aeroben Umsetzung von Biomasse verfügbar ist. Diese Energie kann in Gegenwart von Sauerstoff von aeroben Methanoxidierern genutzt werden (Schink 1997).

3.2 Vorkommen und Verbreitung von Cadaverin

Cadaverin (1,5-Diaminopentan) gehört zu der Gruppe der biogenen Amine und ist ein primäres aliphatisches Amin. Es wird auch als Fäulnisbase bezeichnet, welche bei der Sauerstoff-limitierten, bakteriellen Zersetzung von proteinreichem organischem Material, z.B bei Verwesungsprozessen, zusammen mit anderen biogenen Aminen wie Putrescin oder Spermidin durch die Decarboxylierung von Aminosäuren, oder die Aminierung von Aldehyden und Ketonen (Bouchereau et al. 2000;

Krishnamurty et al. 1989; Maijala 1995; Nagao et al. 1988; Straub et al. 1995; Ten Brink et al. 1990) gebildet werden. Cadaverin entsteht durch Decarboxylierung der körpereigenen Aminosäure Lysin nach folgendem Reaktionsschema:

Abbildung 3-1 Decarboxylierung der Aminosäure Lysin COOH

CHNH2

(CH2)4

NH2

Lysin

CO2

NH2

CH2

(CH2)4

NH2

Lysin-Decarboxylase

Cadaverin

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Einleitung 13

Nach diesem Schema werden biogene Amine im Stoffwechsel von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen gebildet, und sind daher in geringen Konzentrationen präsent. Biogene Amine agieren häufig als Vorläufer von Alkaloiden und Hormonen. Manche Neurotransmitter wie Histamin verfügen sogar über regulative Funktionen (Pharmakologie und Toxikologie, Lüllmann und Mohr 1999).

Diese übelriechenden und oft in höherer Konzentration (100-400mg/kg) toxischen Substanzen spielen eine entscheidende Rolle in der Lebensmittelmikrobiologie, wo sie als Kontaminationen in Fischereiprodukten, Käse, Wein, Bier und noch vielen weiteren Lebensmitteln auftreten. Hierbei nehmen sie meist eine gefährdende, unerwünschte und gesundheitsschädigende Position ein. Es gibt allerdings auch unschädliche Funktionen von Aminen in der Lebensmittelherstellung wie z.B. in der Käserei, wo ihre Anwesenheit als Bestandteile der Aroma- und Geschmacksbildung sogar erwünscht ist (Mikrobiologie tierischer Lebensmittel Münch, H.D., Saupe, C., Wegner, K. und Zickrick, K. 1981;

Izquierdo-Pulido et al. 1994; Lindner 1986). In der Pflanzenphysiologie wird Cadaverin als möglicherweise essentieller Bestandteil für die normale Entwicklung der Wurzel betrachtet (Gamarnik und Frydman 1991). In der Mikrobiologie spielen die Diamine Putrescin (1,4- Diaminobutan) und Cadaverin (1,5-Diaminopentan) zudem bei einigen Organismen eine essentielle Rolle bei der Ausbildung einer intakten Peptidoglykanschicht (Kamio et al. 1986/1987). Biogene Amine können spezifischen Bakterien als einzige Kohlenstoff- und somit Energiequelle dienen. Über den bakteriellen Abbau der primären Amine ist bisher wenig bekannt. Mono- und Diaminoxidasen höherer Organismen und Bakterien (Ishizuka et al. 1993; Murooka et al. 1997; Yamashita et al. 1993) initiieren den aeroben Abbau und produzieren neben dem entsprechenden Aldehyd auch Ammonium und Wasserstoffperoxid (Leuschner et al. 1997). Alternativ hierzu wird Putrescin in einer Putrescin verwertenden Mutante von Escherichia coli mit Hilfe einer Putrescin: α-Ketoglutarat- Transaminase und einer darauffolgenden Dehydrogenasereaktion zu 4-Aminobutyrat abgebaut und weiter über Succinat verstoffwechselt (Prieto-Santos et al. 1986).

Der anaerobe Abbau primärer Amine könnte grundsätzlich über ähnliche Stoffwechselwege ablaufen. Die dabei anfallenden Reduktionsäquivalente könnten analog dem Abbau von primären Alkoholen freigesetzt werden (Eichler et al. 1985; Ferry et al. 1974). In Abwesenheit von externen Elektronenakzeptoren wie Sulfat oder Nitrat, könnte die unvollständige Oxidation von Cadaverin zu Fettsäuren oder Dicarbonsäuren an syntrophe Methanproduktion, Homoacetogenese, oder die reduktive Synthese langkettiger Fettsäuren gekoppelt sein (Allison et al. 1962; Kepler et al. 1965).

Bakterien, die biogene Amine anaerob verwerten können, sind zum größten Teil noch nicht näher charakterisiert. Das Wachstum auf biogenen Aminen als alleiniger Kohlenstoff- und Energiequelle

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Einleitung 14

wurde bisher nur am Beispiel des Putrescins (1,4-Diaminobutan) gezeigt und der Abbauweg mit Hilfe von Enzymnachweisen skizziert (Matthies et al. 1989).

3.3 Vorkommen und Verbreitung von Acetat

Essigsäure (Ethansäure) ist eine typisch riechende Carbonsäure mit einem Kohlenstoffgerüst aus zwei Kohlenstoffatomen. Die Salze und Ester der Essigsäure heißen Acetate oder auch Ethanoate. Unter physiologischen Bedingungen liegt Essigsäure größtenteils deprotoniert als Acetat-Anion (CH3COO⁻) vor. Essigsäure wurde historisch in Europa und Asien als Würzmittel zur Säuerung und Konservierung von Lebensmitteln genutzt. Dabei wurde Essig traditionell vor allem aus Wein gewonnen, der offen stehengelassen und vergoren wurde. Louis Pasteur entdeckte die Rolle der Bakterien bei der Essigherstellung und setzte damit den Grundstein für die kontrollierte Herstellung von Essig in Form von Weinessig. Die biotechnische Herstellung von Essigsäure erfolgt aerob durch die aerobe Oxidation von Ethanol durch Bakterien der Gattungen Acetobacter oder Gluconobacter. Die Bakterien wandeln durch Gärungsprozesse entstandene primäre Alkohole, im Falle des Ethanols über Acetaldehyd in Essigsäure um. Die Oxidation erfolgt durch die an der Außenseite der Cytoplasmamembran lokalisierte Alkoholdehydrogenasen (ADH) - die als prosthetische Gruppe Pyrrolochinolinchinon (PQQ) oder Methoxatin enthalten - und Aldehyddehydrogenasen (ALDH). Die bei der Oxidation freiwerdenden Elektronen werden auf der Stufe des Cytochrom c in die Elektronentransportkette eingeschleust und Protonen nach außen in den periplasmatischen Raum abgegeben (Allgemeine Mikrobiologie Fuchs, G. 2007).

In der Lebensmittelindustrie hat Essigsäure eine große Bedeutung als Geschmacksstoff, wird aber auch als Konservierungsmittel und bakterizides Mittel eingesetzt. Essigsäure und ihre Salze Kaliumacetat, Natriumacetat und Calciumacetat werden als Säuerungsmittel für Obst und Gemüse in Dosen und Gläsern, bei Fisch- konserven und verschiedensten Produkten zusammen mit Sorbinsäure oder Benzoesäure verwendet (Mikrobiologie tierischer Lebensmittel Münch, H.D., Saupe, C., Wegner, K. und Zickrick, K. 1981). Für die stoffliche Nutzung wird fast ausschliesslich großtechnisch hergestellter Eisessig genutzt. Dabei werden mehr als 65% der Weltproduktion für Polymere auf der Basis von Vinylacetat (43%) und Celluloseacetat (25%) aufgewendet. Vinylacetat bildet die Grundlage für Polyvinylacetat (PVAc), das unter anderem in Farben und Klebstoffen verwendet wird.

In geringerem Umfang wird es auch verwendet, um Vinylacetat-Copolymere und Polyvinylalkohol zu synthetisieren. Celluloseacetat wird allgemein vor allem zur Produktion von verschiedenen Filterpapieren, aber auch Zigarettenfiltern, Folien und Kunststoffprodukten verwendet. Essigsäure-n- butylester und Essigsäureisopropylester werden als Lösungsmittel für Kosmetika und Parfums verwendet (Cheung et al. 2005).

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Einleitung 15

In der Mikrobiologie spielen flüchtige Fettsäuren und deren Salze wie z. B. Acetat, Butyrat und Propionat eine wesentliche Rolle einerseits als Haupt-Endprodukte mikrobieller Gärungen und andererseits als Substrate der terminalen Mineralisierung von Kohlenstoff in Sedimenten. Somit bilden sie eine entscheidende Verbindung zwischen diesen zwei wichtigen anaeroben Prozessen (Wellsbury und Parkes 1995). In mikrobiologischen Prozessen, welche den Abbau und die Konservierung von organischem Material in Sedimenten kontrollieren, tritt Acetat als Schlüssel- Intermediat auf. Der Begriff Homoacetogene Bakterien umfasst eine Gruppe strikt anaerober - metabolisch sehr diverser - Mikroorganismen die über die Fähigkeit verfügen, eine Vielzahl von Substraten zu Acetat als Hauptprodukt abzubauen. Die meisten dieser Bakterien können chemolithoautotroph mit H2 und CO2 als alleiniger Energie- und Kohlenstoffquelle wachsen. Dies deutet darauf hin, dass die Reduktion von CO2 zu Acetat an die Nettosynthese von ATP gekoppelt sein muss.

Abbildung 3-2 Schema der Acetatbildung aus H2 und CO2. Die B12-abhängige Methyltransferase fungiert zugleich als Ionenpumpe und transloziert 1 Na⁺ pro Zyklus. CFeSP: Corrinoid-FeS-Protein. CODH/ACS: CO- Dehydrogenase/Acetyl-CoA-Synthase-Komplex.

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Einleitung 16

Der Stoffwechselweg der Acetatbildung aus CO2 (siehe Abb. 3-2) wurde hauptsächlich am Beispiel von Moorella thermoacetica (früher: Clostridium thermoaceticum) von der Arbeitsgruppe von H. G.

Wood und L.G. Ljungdahl aufgeklärt. Da in diesem Stoffwechselweg Acetyl-CoA als Zwischenprodukt auftritt und eine CO-Dehydrogenase eines der Schlüssel-Enzyme dieses Weges darstellt, wird dieser häufig als „reduktiver Acetyl-CoA Weg“ oder „CO-Dehydrogenase Weg“ bezeichnet (Diekert und Wohlfarth 1994). Acetat ist das wesentliche Substrat der Sulfatreduktion in marinen Sedimenten (Parkes et al. 1989; Sorensen et al. 1981), der Methanproduktion in Süßwasser Sedimenten (Cappenberg et al. 1974) und anaeroben Bioreaktoren (Colleran 1992). Es wurden einige anaerobe Bakterien beschrieben, die entweder autotroph mit CO2 und H2 als Elektronendonoren wachsen können, oder heterotroph durch die Oxidation von organischem Material zu CO2 in Abhängigkeit von H2 und organischer Komponenten wachsen können. Diese fakultativ lithotrophen Organismen schließen Sulfatreduzierer (Widdel et al. 1980/1987; Widdel und Pfennig 1984, Brysch et al. 1987) und acetogene Bakterien (Lee und Zinder 1988) ein. Das strikt anaerobe Bakterium Desulfuromonas acetoxidans kann Acetat zu CO2 mit elementarem Schwefel als Elektronenakzeptor oxidieren. Die Acetatoxidation verläuft hierbei über den Citratzyklus unter Bildung von Oxalacetat aus Acetat und 2 Molekülen CO2 über Pyruvat (Gebhardt et al. 1985; Pfennig et al. 1976). In Desulfobacter hydrogenophilus (Widdel 1987) scheint ein modifizierter Citratzyklus in der reduktiven Richtung abzulaufen, um Acetyl-CoA - bei Abwesenheit organischer Komponenten - aus 2 CO2 und 4 H2 zu bilden. Während des heterotrophen Wachstums dieses Baktriums mit Acetat läuft dieser Zyklus in der oxidativen Richtung ab, um Acetyl-CoA zu 2 CO2 und 8 Reduktionsäquivalenten zu oxidieren (Schauder et al. 1987; Gebhardt et al. 1983). Im Gegensatz hierzu oxidiert Desulfotomaculum acetoxidans Acetat strikt anaerob mit Sulfat als Elektronenakzeptor zu CO2 nicht mit Hilfe des Citratzyklus. Acetat wird in diesem Organismus über den oben bereits erwähnten reduktiven Acetyl- CoA Weg verstoffwechselt. (Widdel et al. 1977/1981, Spormann et al. 1989). Desulfobacterium autotrophicum ist ein weiterer Vertreter dieser Organismen, welcher Acetat analog der acetogenen Bakterien über den reduktiven Acetyl-CoA /CO-Dehydrogenase Weg unter gleichzeitiger Reduktion von Sulfat oxidiert (Brysch et al. 1987; Schauder et al. 1989).

Eine syntrophe Acetatoxidation konnte zuerst für ein moderat, thermophiles (58°C) Bakterium, Stamm AOR beschrieben werden (Zinder und Koch 1984). Dieser Organismus in Reinkultur reduziert CO2 zu Acetat in einer wasserstoffabhängigen Reaktion analog der Homoacetogenese und ist somit in der Lage, die syntrophe Oxidation von Acetat umzukehren und mit Hilfe des Wood-Ljungdahl- Weges zu wachsen (Lee und Zinder 1988a; Lee und Zinder 1988b; Lee und Zinder 1988c). Ein interessanter Aspekt dieses Stoffwechseltypus ist, dass diese Bakterien offensichtlich in der Lage dazu sind, die Acetatbildung und zugleich den Abbau von Acetat in beiden Richtungen mit

(17)

Einleitung 17

wahrscheinlich den identischen Enzymen durchführen und in beiden Richtungen ATP synthetisieren können. Ein weiterer thermophiler Stamm mit ähnlichen Eigenschaften, Thermacetogenium phaeum (Hattori et al. 2000) und ein mesophiler Stamm, Clostridium ultunense (Schnürer et al. 1996) konnten isoliert werden. Beide dieser Organismen nutzen den Wood-Ljungdahl Weg zur Acetatoxidation (Hattori et al. 2005; Schnürer et al. 1997). Geobacter sulfurreducens oxidiert Acetat zu CO2 mit Fumarat, Eisen(III), elementarem Schwefel oder Malat als Eletronenakzeptor. In Abwesenheit dieser Elektronenakzeptoren können die Elektronen auch auf einen anaeroben Partnerorganismus, z.B.

Wolinella succinogenes übertragen werden. Die Kokultur oxidiert Acetat zu CO2 mit gleichzeitiger Reduktion von Nitrat zu Ammonium (Cord-Ruwisch et al. 1998).

3.4 Ziele der Arbeit

Ein Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der syntrophen Oxidation von Acetat durch die thermophile, methanogene Ko-Kultur SYNAC. Das Ziel dieses Teil-Projektes war es die energieliefernden Schritte der syntrophen Acetatoxidation zu identifizieren. Hierzu sollten die Enzyme des Wood-Ljungdahl-Weges untersucht werden, welche – laut unserer Hypothese - sowohl bei der Acetatbildung des gärenden Partnerorganismus Thermacetogenium phaeum in Reinkultur als auch bei der Oxidation von Acetat durch die syntrophe Ko-Kultur SYNAC beteiligt sein sollen. Es war zu klären, ob es sich in beiden Fällen um die identischen Enzyme handelt und ob diese unabhängig von der Richtung des Stoffwechselweges in demselben Kompartiment lokalisiert sind. Anhand dieser Erkenntnisse sollte ein hypothetisches Modell erstellt werden, das die Anordnung der an der syntrophen Oxidation von Acetat beteiligten Enzyme im gärenden Bakterium Thermacetogenium phaeum zeigt.

Der andere Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit dem anaeroben Abbau des biogenen Amins Cadaverin (1,5-Diaminopentan). Ziel dieses Projektes war es die Oxidation von Cadaverin durch eine neu isolierte definierte methanogene Ko-Kultur zu untersuchen und das gärende Bakterium dieser syntrophen Partnerschaft phylogenetisch zu charakterisieren. Weiterhin sollten physiologische und biochemische Methoden zur Charakterisierung der Reinkultur bzw. der definierten Ko-Kultur als auch zur Skizzierung des Abbauweges herangezogen werden. Die sich aus dem Abbauweg ergebenden Produkte sollten definiert und quantifiziert werden. Die am revertierten Elektronentransport beteiligten Enzyme sollten identifiziert werden.

(18)

4 Material und Methoden

4.1 Chemikalien

Chemikalien und Biochemikalien stammten von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Riedel-de Haën (Seelze), Sigma (Deisenhofen), FMC Bioproducts/Biozym (Hessisch Oldendorf) und Roth (Karlsruhe). Einige Spezialchemikalien wurden bei anderen Firmen bezogen und werden im Text angegeben.

4.2 Mikrobiologische Methoden 4.2.1 Herkunft der Organismen

Die anaerobe sulfatreduzierende Kokultur LC 13d wurde aus der Anreicherungskultur La Cad isoliert, welche ursprünglich mit Sediment aus der Lahn bei Marburg gewonnen wurde. Methanospirillum hungatei Stamm M1h (DSM 13809) wurde aus der Kläranlage in Göttingen, Deutschland, isoliert.

Acetobacterium woodii (DSM 2396) und Desulfovibrio vulgaris Stamm Marburg (DSM 2119) wurden aus der Stammsamlung unseres Labors entnommen. Methanobrevibacter arboriphilus DH1 (DSM 1125) und Clostridium aminobutyricum (DSM 2364) wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen DSMZ, Braunschweig, Deutschland, erworben. T. phaeum Stamm PB^T wurde von Satoshi Hattori isoliert und zur Verfügung gestellt. Methanothermobacter thermoautotrophicus Stamm TM wurde ebenfalls von Satoshi Hattori isoliert und zur Verfügung gestellt.

4.2.2 Nährmedium für die Cadaverin-oxidierende Kultur

Zur Isolierung und Kultivierung der Kokultur LC 13M wurde ein Süsswasser- Grundmedium nach Widdel (1980) für anaerobe Bakterien verwendet, das sich aus einer Mineralsalzlösung und mehreren Zusatzlösungen zusammensetzt.

4.2.2.1 Zusammensetzung der Mineralsalzlösung Bestandteile in g/l:

NaCl 1,00

MgCl2 · 6 H2O 0,40

KH2PO4 0,20

NH4Cl 0,25

KCl 0,50

CaCl2 · 2 H2O 0,15 Resazurin 0.5 x 10^-3

(19)

4.2.2.2 Zusatzlösungen

Folgende Zusätze wurden nach dem Autoklavieren steril zugegeben:

30 ml/l 1 M NaHCO3-Lösung

1 ml/l Spurenelemente-Lösung SL 10 (Widdel et al. 1981) 1 ml/l Selenit-Wolframat-Lösung (Widdel 1980)

0,5 ml/l 7 Vitamine-Lösung (Widdel und Pfennig 1981) 2,0 ml/l Natriumsulfid-Lösung (Reduktionsmittel) 4.2.2.2.1 Natriumhydrogencarbonat-Lösung (Pufferstammlösung):

Für ein Liter Medium wurde 30 ml einer 1 M NaHCO3-Lösung in CO2-gesättigtem dest. Wasser bereitet und in einer fest verschlossenen Flasche autoklaviert.

4.2.2.2.2 Spurenelemente-Lösung SL 10 (Widdel 1983) Angaben in mg/l:

FeCl2 · 4 H2O 1500

ZnCl2 70

MnCl2 · 4 H2O 100 CoCl2 · 6 H2O 190 CuCl2 · 2 H2O 2 NiCl2 · 6 H2O 24 Na2MoO4 · 2 H2O 36

H3BO3 6

NTA ¹ 12,8

HCl 25%ig 25 ml

H2O bidest. Ad 1000 ml

1NTA: Nitrilotriessigsäure

Das Eisen-II-chlorid wurde in der Salzsäure gelöst, dann wurden die anderen Metallsalze hinzugegeben, auf das Endvolumen aufgefüllt und die Lösung autoklaviert.

4.2.2.2.3 Selenit-Wolframat-Lösung : Se-Wo-Lösung (Widdel 1980):

NaOH 0,5 g

Na2SeO3 · 5 H2O 3 mg Na2WO4 · 2 H2O 4 mg

Mit bidest. Wasser auf 1 l aufgefüllt und autoklaviert.

4.2.2.2.4 7-Vitamine-Lösung (Widdel & Pfennig, 1981):

Cyanocobalamin 10 mg

p-Aminobenzoesäure 10 mg

D(+)-Biotin 2 mg

Nicotinsäure 20 mg

Ca-D(+)-Pantothenat 5 mg Pyridoxamin-Dihydrochlorid 50 mg

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Thiamin-Dihydrochlorid 10 mg

Gelöst in bidest. Wasser zu 200 ml und sterilfiltriert in sterile Schraubkappenröhrchen.

Aufbewahrung im Dunkeln bei 4°C.

4.2.2.2.5 Natriumsulfid-Lösung (Reduktionsmittel):

3 g Na2S · 9H2O wurde in 25 ml N2-gesättigtem dest. Wasser gelöst und in einer Serumflasche unter N2 autoklaviert.

4.2.2.2.7 andere benötigte Reagenzien:

1 M HCl :

8,43 ml 37%ige HCl ad 100 ml mit bidest. Wasser 0,5 M Natriumcarbonat-Lösung:

5,3 g Na2CO3 wurde in bidest. Wasser zu einem Endvolumen von 100 ml gelöst und unter CO2 in einer Schraubdeckelflasche verschlossen autoklaviert.

4.2.3 Herstellung des Grundmediums

Die Mineralsalzlösung wurde in einem speziellen Glaskolben (Widdel 1980) 21 min bei 121ºC und 1 atm Überdruck autoklaviert. Unmittelbar nach dem Autoklavieren wurde der über dem Medium verbleibende Luftsauerstoff durch Spülen mit N2/CO2 (80%/20%) entfernt. Unter derselben Atmosphäre wurde das Medium in einem Eiswasserbad abgekühlt, bevor die Zusatzlösungen wie folgt zugegeben wurden:

[ ml/l]

NaHCO3 30

SL 10-Lösung 1 Se-Wo-Lösung 1 7-Vitamine-Lösung 0,5 Na2S-Lösung 2

Der pH-Wert des Mediums wurde mit 1M HCl bzw. 0,5 M Na2CO3-Lösung auf einen Wert zwischen 7,2 und 7,4 eingestellt.

4.2.4 Nährmedium für Thermacetogenium phaeum DSMZ 880

Zur Kultivierung von Thermacetogenium phaeum in Reinkultur auf Pyruvat bzw. Methanol wurde ein modifiziertes Süsswassermedium DSMZ 880 verwendet, das sich aus einer Mineralsalzlösung und mehreren Zusatzlösungen zusammensetzt.

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4.2.4.1 Zusammensetzung der Mineralsalzlösung des Mediums DSMZ 880 Bestandteile in g/l:

KH2PO4 0,30

NaCl 0,60

MgCl2 · 6 H2O 0,10 CaCl2 · 2 H2O 0,08

NH4Cl 1,00

Resazurin 0,5 x 10^-3

KHCO3 3,5

1 ml/l Spurenelemente-Lösung SL 10 mit 1.34 mM Na2-EDTA (Widdel et. al 1981) 1 ml/l Selenit-Wolframat-Lösung (nach Widdel, 1980)

10 ml/l 10 Vitamine-Lösung (DSMZ Medium 141) 2,8 ml/l Natriumsulfid-Lösung (Reduktionsmittel) 3,8 ml/l Cysteinlösung (Reduktionsmittel)

4.2.4.2.1 Spurenelemente-Lösung SL 10 modifiziert (Widdel 1983):

Angaben in mg/l:

FeCl3 · 6 H2O 1350

ZnCl2 100

H3BO3 10

NTA ¹ 12800

NaCl 1000

Na2SeO3 x 5 H2O 26 H2O dest. Ad 1000 ml

1NTA : Nitrilotriessigsäure

Die NTA wurde zuerst in 200 ml bidest. Wasser gelöst und der pH auf 6,5 mit KOH eingestellt. Dann wurden die anderen Salze hinzugegeben, auf das Endvolumen aufgefüllt und die Lösung autoklaviert.

4.2.4.2.2 Selenit-Wolframat-Lösung (Widdel 1980):

NaOH 0,5 g

(22)

4.2.4.2.3 10-Vitamine-Lösung modifiziert DSMZ Medium 141 (Widdel & Pfennig, 1981) Angaben in mg/l:

Cyanocobalamin 0,10

p-Aminobenzoesäure 5

D(+)-Biotin 2

Nicotinsäure 5

Ca-D(+)-Pantothenat 5 Pyridoxamin-Dihydrochlorid 10 Thiamin-Dihydrochlorid 5

Folsäure 2

Riboflavin 5

Liponsäure 5

4.2.4.2.4 0,5 M Natriumsulfid-Lösung (Reduktionsmittel):

4.2.4.2.5 100 mM Cystein-Lösung (Reduktionsmittel):

1,58 g Cysteinhydrochlorid wurden in 100 ml dest. Wasser gelöst, evakuiert, mit N2 begast und in einer Serumflasche autoklaviert.

4.2.4.2.6 1 M Na-Pyruvat-Lösung (Substrat):

5,5 g Na-Pyruvat wurden in 40 ml bidest. Wasser gelöst. Danach wurde auf 50 ml mit bidest Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde evakuiert, mit N2 begast und in eine sterile mit N2 begaste Serumflasche sterilfiltriert.

4.2.4.2.7 1 M Methanol-Lösung (Substrat):

2,02 ml 100%iges Methanol wurden mit bidest. Wasser auf 50 ml aufgefüllt. Die Lösung wurde evakuiert, mit N2 begast und autoklaviert.

1 M HCl:

8,43 ml 37%ige HCl ad 100 ml mit dest. Wasser 0,5 M Natriumcarbonat-Lösung:

5,3 g Na2CO3 wurde in dest. Wasser zu einem Endvolumen von 100 ml gelöst und unter CO2 in einer Schraubdeckelflasche verschlossen autoklaviert.

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4.2.5 Herstellung des DSMZ 880 Mediums

[ ml/l]

SL 10-Lösung 1

Se-Wo-Lösung 1

10-Vitamine-Lösung 10

Na2S-Lösung 2,8

Cystein-Lösung 3,8

Na-Pyruvat-Lösung/Methanol-Lösung 2/1

4.2.6 Natriumfreies Nährmedium für Thermacetogenium phaeum DSMZ 880

Um zu prüfen, ob Thermacetogenium phaeum in Reinkultur auf Pyruvat Natrium zum Wachstum benötigt, wurde ein natriumfreies, modifiziertes Süsswassermedium DSMZ 880 hergestellt, das sich aus einer Mineralsalzlösung und mehreren Zusatzlösungen zusammensetzt.

KH2PO4 0,30

KCl 0,60

MgCl2 · 6 H2O 0,10 CaCl2 · 2 H2O 0,08

NH4Cl 1,00

Resazurin 0,5 x 10^-3

KHCO3 3,5

1 ml/l Spurenelemente-Lösung SL 10 mit 1.34 mM Na2-EDTA (Widdel et al. 1981) 1 ml/l Selenit-Wolframat-Lösung modifiziert (Widdel 1980)

10 ml/l 10 Vitamine-Lösung (DSMZ Medium 141) 3,8 ml/l Cysteinlösung (Reduktionsmittel)

(24)

4.2.6.2.1 Spurenelemente-Lösung SL 10 modifiziert (Widdel 1983):

Angaben in mg/l:

FeCl3 · 6 H2O 1350

ZnCl2 100

MnCl2 · 4 H2O 100 CoCl2 · 6 H2O 24 CuCl2 · 2 H2O 25 NiCl2 · 6 H2O 120 K2MoO4 · 2 H2O 24

H3BO3 10

NTA ¹ 12800

KCl 1000

H2O dest. Ad 1000 ml

KOH 0,7 g

Selenige Säure 2,2 mg K2WO4 · 2 H2O 4 mg

Cyanocobalamin 0,10

D(+)-Biotin 2

Nicotinsäure 5

Folsäure 2

Riboflavin 5

Liponsäure 5

(25)

4.2.6.2.4 100 mM Titan(III)-NTA-Lösung (Reduktionsmittel):

5,73 g NTA wurden in 30 ml bidest. Wasser gelöst und mit 15 ml 5 M KOH versetzt. Die Lösung wurde evakuiert und mit N2 begast. Unter Rühren wurden gleichzeitig 6,4 ml einer 100 mM TiCl3-Lösung und 8 ml 2 M K2CO3 mit einer Spritze zugesetzt. Das hierbei entstehende CO2 konnte durch eine Auslasskanüle entweichen. Die Lösung wurde auf 75 ml Endvolumen mit bidest. Wasser aufgefüllt und in eine natriumfreie, anoxische Müller-Krempelflasche sterilfiltriert.

4.2.6.2.5 100 mM Cystein-Lösung (Reduktionsmittel):

1,58 g Cysteinhydrochlorid wurden in 100 ml dest. Wasser gelöst, evakuiert, mit N2 begast und in einer Serumflasche autoklaviert.

4.2.6.2.6 40 mM K-Pyruvat (Substrat):

3,52 g Brenztraubensäure wurden mit 1 M KOH neutralisiert und je 1 l Medium zugegeben.

1 M HCl:

8,43 ml 37%ige HCl ad 100 ml mit dest. Wasser 0,5 M Kaliumcarbonat-Lösung:

5,3 g K2CO3 wurde in dest. Wasser zu einem Endvolumen von 100 ml gelöst und unter CO2 in einer Schraubdeckelflasche verschlossen autoklaviert.

1 M KOH:

2,8 g KOH wurden in 40 ml bidest. Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf 50 ml mit bidest. Wasser aufgefüllt, evakuiert mit N2 begast und autoklaviert.

4.2.7 Herstellung des natriumfreien DSMZ 880 Mediums

Alle hierfür benutzen Glasgerätschaften, Butylgummisepten, Spatel und Pipetten wurden über Nacht in einer 5%igen HCl-Lösung eingelegt. Danach wurden sie dreimal mit bidest. Wasser gespült, in ebenso behandelte Glasbecher überführt und mit Alufolie verschlossen. Diese wurden dann autoklaviert. Die Mineralsalzlösung wurde in einem speziellen Glaskolben (Widdel 1980) 21 min bei 121ºC und 1 atm Überdruck autoklaviert. Unmittelbar nach dem Autoklavieren wurde der über dem Medium verbleibende Luftsauerstoff durch Spülen mit N2/CO2 (80%/20%) entfernt. Unter derselben Atmosphäre wurde das Medium in einem Eiswasserbad abgekühlt, bevor die Zusatzlösungen wie folgt zugegeben wurden:

[ ml/l]

SL 10-Lösung 1

Se-Wo-Lösung 1

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Titan(III)NTA 0,1

Cystein-Lösung 3,8

Brenztraubensäure-Lösung 2,8

Der pH-Wert des Mediums wurde mit 1M HCl bzw. 0,5 M K2CO3-Lösung auf einen Wert zwischen 7,0 und 7,1 eingestellt.

4.2.8 Nährmedium der Acetat-oxidierenden Kokultur SYNAC DSMZ 318

Zur Kultivierung der thermophilen Kokultur SYNAC wurde ein modifiziertes Süsswassermedium DSMZ 318 mit 80 mM Acetat als Substrat verwendet, das sich aus einer Mineralsalzlösung und mehreren Zusatzlösungen zusammensetzt und zusätzlich mit 10 mM Hepes gepuffert wurde.

KH2PO4 0,30

NaCl 0,60

MgCl2 · 6 H2O 0,10 CaCl2 · 2 H2O 0,08

NH4Cl 1,00

Resazurin 1 x 10^-3

KHCO3 2,0

Acetat (wasserfrei) 8,3 Cysteinhydrochlorid 0,3

HEPES 2,4

1 ml/l Spurenelemente-Lösung SL 10 (Widdel et al. 1981) 1 ml/l Selenit-Wolframat-Lösung (Widdel 1980)

10 ml/l 10 Vitamine-Lösung (DSMZ Medium 141) 2,0 ml/l Natriumsulfid-Lösung (Reduktionsmittel)

4.2.8.2.1 Spurenelemente-Lösung SL 10 modifiziert (Widdel 1983) Angaben in mg/l:

FeCl3 · 6 H2O 1350

ZnCl2 100

H3BO3 10

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NTA¹ 12800

NaCl 1000

Na2SeO3 x 5 H2O 26 H2O dest. Ad 1000 ml

NaOH 0,5 g

Cyanocobalamin 0,10

D(+)-Biotin 2

Nicotinsäure 5

Folsäure 2

Riboflavin 5

Liponsäure 5

4.2.8.2.4 0,5 M Natriumsulfid-Lösung (Reduktionsmittel):

1 M HCl :

8,43 ml 37%ige HCl ad 100 ml mit dest. Wasser 0,5 M Natriumcarbonat-Lösung:

5,3 g Na2CO3 wurde in dest. Wasser zu einem Endvolumen von 100 ml gelöst und unter CO2 in einer Schraubdeckelflasche verschlossen autoklaviert.

(28)

4.2.9 Herstellung des DSMZ 318 Mediums

[ ml/l] SL 10-Lösung 10

Se-Wo-Lösung 1

Na2S-Lösung 2,5

4.2.10 Komplexmedien

Halbfestes AC-Medium (1%Agarose, 1:10 verdünnt, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) in 27-ml Serumröhrchen, begast mit N2/CO2 (80/20%) diente der Reinheitskontrolle.

4.2.11 Substratlösungen für Wachstumsversuche der Kokultur LC 13M

sämtliche Substratlösungen wurden als Stammlösungen verschiedener Konzentrationen angesetzt, in Schraubdeckelflaschen, bzw. Serumflaschen unter N2 autoklaviert und unmittelbar vor dem Beimpfen dem Medium zugesetzt. Stammlösungen hitzeempfindlicher Substrate wurden in sterile Schraubdeckelflaschen, bzw. in mit N2 begaste Serumflaschen sterilfiltriert.

4.2.12 Verdünnungsreihe in Flüssigmedium zur Reinkultivierung anaerober Bakterien

4.2.12.1 Hintergrund

Um den sulfatreduzierenden Partnerorganismus der sulfatreduzierenden Kokultur LC 13d gegen das methanogene Archaebakterium Methanospirillum hungatei auszutauschen, wurden Verdünnungsreihen mit Methanospirillum hungatei M1h im Hintergrund mit 5 mM Cadaverin und 2 mM Acetat erstellt.

4.2.12.2 Reagenzien 500 mM Cadaverin:

4,4 g 1,5 Diaminopentan-Dihydrochlorid wurde abgewogen, in 50 ml dest. Wasser gelöst und sterilfiltriert.

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1 M Na-Acetat:

3,28 g Na-Acetat wurden in 30 ml bidest. Wasser gelöst. Nach Auffüllen auf 40 ml wurde die Lösung evakuiert mit N2 begast und autoklaviert.

4.2.12.3 Durchführung

Zuerst wurde das sterile Mineralmedium, das alle Bestandteile (Kohlenstoffquelle, evt.

Elektronenakzeptoren etc.) und den methanogenen Partnerorganismus M. hungatei Stamm M1h (5%

Inokulum) im Hintergrund enthielt, vorbereitet. Davon ausgehend wurden die entsprechenden ml Medium in vorher mit N2/CO2 (20/80%) begaste, sterile Serumröhrchen mit Hilfe einer sterilen, mit Stickstoff gespülten Spritze übertragen, so dass das Endvolumen jedes Röhrchens mit Inokulum genau 10 ml betrug. Nach vorherigem Abflammen des Butylgummistopfens mit 70%igem Ethanol. in der Bunsenbrennerflamme wurde 1 ml der sulfatreduzierenden Kokultur LC 13d mit Hilfe einer sterilen, mit N2 begasten Spritze in das erste Röhrchen (10^-1) gegeben. Das Röhrchen wurde mehrmals vorsichtig durchmischt. Hiervon ausgehend wurde eine Verdünnungsreihe in Stufen von 10^-1bis 10^-7 angesetzt. Die fertigen Röhrchen wurden kopfüber bei 28ºC im Dunkeln inkubiert.

Nach einigen Wochen konnte Wachstum bis in die höchste Verdünnungsstufe beobachtet werden.

Von dieser Verdünnungsstufe ausgehend wurde eine neue Verdünnungsreihe mit M. hungatei Stamm M1h im Hintergrund angesetzt. Dieser Vorgang wurde dreimal durchgeführt.

4.2.13 Stammhaltung und Kultivierungstechniken

Sämtliche Kulturen wurden als Flüssigkultur gehalten und bei Bedarf übertragen. Für alle Experimente wurden stets frische Vorkulturen je nach Bedarf in 120 ml Serumflaschen, 750 ml/1200 ml Müller-Krempelflaschen (Müller & Krempel, Bülach, Schweiz), oder 27 ml Serumröhrchen mit ausreichendem Gasraum und mit dem entsprechenden Gas (Angaben siehe einzelne Experimente) befüllt angesetzt. Substrate oder weitere Zutaten wurden dem Medium, falls nicht anders angegeben, direkt vor dem Beimpfen aus sterilen Stammlösungen zugesetzt. In der Regel wurden die Medien mit 5-10% des Volumens des Mediums beimpft und, wenn nicht anders vermerkt, bei 28°C im Dunkeln inkubiert.

4.2.14 Bestimmung von Wachstumsparametern

Wachstum wurde anhand von Trübungsmessungen verfolgt. Für die direkte Messung von Trübung in Röhrchen wurde ein Camspec Modell M107 Spektrophotometer (Camspec Ltd, Cambridge, 24 UK) verwendet, während Messungen in Küvetten in einem Spektralphotometer Modell 100-40 (Hitachi, Tokyo, Japan) durchgeführt wurden. In der Regel wurde bei einer Wellenlänge von 578 nm gemessen. Wachstumserträge (Ys) wurden mittels der maximal erreichten Trübung (∆ODEnde-

(30)

∆ODAnfang), der daraus berechneten Trockenzellmasse und des Substratverbrauchs bestimmt. Unter der Annahme, dass der Gesamtproteinanteil der Zelle ca. 50% der Trockenzellmasse ausmacht, wurden in einigen Experimenten Trübungswerte über Trockenzellmasse-Gehalte in Proteingehalte umgerechnet. Der Proteingehalt wurde mit dem empirischen Zusammenhang OD 0,1 = 25 mg Trockenzellmasse x l^-1 kalkuliert. In-vivo-Substratumsatzraten (∆S/∆t), die „physiologische Aktivität der Zellen“, bezogen auf Trockenzellmasse (X) von wachsenden Kulturen wurden mit Hilfe der Wachstumsrate (µ) und des molaren Wachstumsertrags (YS) mittels der Beziehung ∆S/∆t = µ x X/YS

berechnet.

4.2.15 Wachstumsversuche mit der Kokultur LC 13M

Wachstumsexperimente wurden entweder in 120-ml Serumflaschen, oder in 27-ml Serumröhrchen durchgeführt. Diese waren mit dem entsprechenden Medium gefüllt, mit N2/CO2 (80%/20%) begast und mit Butylgummistopfen und Aluminiumkrampen verschlossen. Für spezifische Wachstumsversuche wurde die KoKultur LC 13 M in Süßwassermedium (siehe 4.2.2) mit 5 mM Cadaverin +/- 2 mM Acetat, 5 mM Cadaverin +/- 10 mM 2-Bromethansulfonsäure, 5 mM Cadaverin +/- 0.05% Hefeextrakt, oder 0.05% Hefeextrakt alleine kultiviert.

Das Wachstum wurde durch Messung der Trübung bei 578 nm verfolgt. Zur Erfassung der Reaktionsprodukte wurde jeweils 1 ml der Kultur am Tag des Animpfens (t0) und am letzten Tag der Kultivierung (t1) abgenommen und mittels HPLC auf Produktbildung untersucht. Zudem wurde jeweils 0.2 ml des Gasraums in einen Gaschromatographen mit FID injiziert, um Methan quantitativ zu erfassen. Die hier angeführten chromatographischen Methoden werden im Abschnitt 4.5 näher erläutert. Um herauszufinden, ob der Elektronentransfer bei der methanogenen Kokultur LC 13M auf dem Transport von Wasserstoff, Formiat, oder beidem basiert, wurde Methanospirillum hungatei durch Methanobrevibacter arboriphilus mit Hilfe einer Flüssigverdünnungsreihe (siehe 4.2.12) ersetzt. Mögliche unspezifische Effekte von BES wurden durch Zugabe von 10 mM BES zur sulfatreduzierenden Kokultur LC 13D in Anwesenheit von Sulfat getestet. Mit den Resultaten konnten Wachstumskurven und Stoffwechselbilanzen erstellt werden. Die Trockenzellmasse (X), die Wachstumserträge (YS), die max. Wachstumsrate max., bzw. die Verdopplungszeit td und die

„physiologische Aktivität“ der Zellen konnten ermittelt werden (siehe 4.2.14).

4.2.16 Substratspektrum der Kokultur LC 13M

Wachstumsexperimente zur Substratspezifität der Kokultur LC 13 M wurden mit verschiedenen Substraten in 27-ml Serumröhrchen, gefüllt mit 10 ml Medium unter einer N2/CO2 (80%/20%) Gasatmosphäre durchgeführt. Als Substrate wurden zugegeben (falls nicht anders vermerkt, in einer Konzentration von 5 mM): Putrescin, Lysin, 5-Aminovalerat, γ-Aminobutyrat, β-Alanin, Crotonat, Glutarat, Butyrat, Ethylamin, Ethanolamin, Glycin, Anilin, Phenylalanin, Casaminosäuren 0.1%,

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Aspartat, Formiat + 2 mM Acetat, Valerat, Citrat, Fumarat, Glutarat + 2 mM Acetat, Malat, Malonat, Oxalat + 2 mM Acetat, Succinat + 2 mM Acetat, Butanol, 1,4-Butandiol, Cholin, Ethylenglykol, Glycerin, Methanol, 1,3-Propandiol, Arabinose, Fruktose, Galaktose, Glukosamin, Glukose, Saccharose und Xylose. Um mögliche Elektronenakzeptoren zu bestimmen, wurden jeweils Duplikaten der Kokultur LC 13 M mit 5 mM Cadaverin als Substrat, jeweils 10 mM BES und 10 mM des entsprechenden Elektronenakzeptors (Nitrat, Fumarat oder Sulfat) zugegeben. Die entsprechenden Substrate wurden aus autoklavierten, oder sterilfiltrierten Stammlösungen zugegeben. Das Wachstum wurde durch Messung der Trübung bei 578 nm verfolgt. Zur Erfassung der Reaktionsprodukte wurde jeweils 1 ml der Kultur am Tag des Animpfens (t0) und am letzten Tag der Kultivierung (t1) abgenommen und mittels HPLC auf Produktbildung untersucht. Zudem wurde jeweils 0.2 ml des Gasraums in einen Gaschromatographen mit FID injiziert, um Methan quantitativ zu erfassen.

4.2.17 Temperatur-, pH-Optimum, Salz- und Phosphattoleranz

Um das Temperaturoptimum der Kokultur LC 13 M zu bestimmen, wurden jeweils zwei Replikate in 27-ml Serumröhrchen, gefüllt mit 10 ml Medium unter einer N2/CO2 (80%/20%) Gasatmosphäre mit 5 mM Cadaverin bei 4-55°C inkubiert und das Wachstum anhand der Trübung bei 578 nm beobachtet. Um den optimalen pH Bereich zu bestimmen, wurde ein Puffersystem bestehend aus Citrat, Tris-HCl und Kaliumphosphat (je 10 mM) in einem pH Bereich von 4,0-8,5 benutzt. Es wurden jeweils zwei Replikate in 70-ml Serumflaschen gefüllt mit 25 ml Medium unter einer N2/CO2

(80%/20%) Gasatmosphäre mit 5 mM Cadaverin bei 28°C inkubiert und das Wachstum anhand der Trübung bei 578 nm verfolgt. Um den Effekt von Salzkonzentrationen auf das Wachstum der Kokultur LC 13M zu untersuchen, wurden je zwei Replikate der Kokultur alternativ auf Brackwasser- und Salzwassermedium (modifiziert nach Widdel et al. 1983) inokuliert. Die Phosphattoleranz der Kokultur LC 13 M wurde anhand von jeweils zwei Replikaten getestet, in denen dem Medium zusätzlich unterschiedliche Konzentrationen Kaliumphosphat (1-50 mM) zugegeben wurde. Das Wachstum wurde durch Messung der Trübung bei 578 nm verfolgt.

4.2.18 Auswirkung von Na

⁺

auf das Wachstumsverhalten des acetogenen Bakteriums

Thermacetogenium phaeum

Acetogene Bakterien können in Na⁺-abhängige und H⁺-abhängige Organismen eingeteilt werden. Um zu bestimmen welcher dieser beiden Gruppen Thermacetogenium phaeum angehört, sollte dessen Wachstumsverhalten auf die Abhängigkeit von Natriumionen untersucht werden. Hierzu mussten zuerst alle benutzen Reaktionsgefäße und Hilfsutensilien über Nacht in 5%iger Salzsäure inkubiert, dreimal mit bidest. Wasser gespült und autoklaviert, um vorhandenes Natrium zu entfernen. Die Wachstumsexperimente wurden in 120-ml Müller-Krempel Flaschen durchgeführt. Diese waren mit

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50 ml des entsprechenden, natriumfreien Mediums (siehe 4.2.6) und 40 mM Pyruvat als Substrat gefüllt und mit N2/CO2 (80%/20%), bzw. H2/CO2 (80%/20%) begast. Als Inokulum diente eine Reinkultur von T. phaeum die zuvor auf jeweils entweder auf 20 mM Methanol (T. phaeum I), oder autotroph mit H2/CO2 (80%/20%) (T. phaeum II) gewachsen war. Es wurden vier Replikate ohne Natriumzugabe, eine Positivkontrolle mit Zugabe von 20 mM NaCl und eine Sterilkontrolle angesetzt.

Das Wachstum wurde durch Messung der Trübung bei 578 nm verfolgt. Zur Erfassung der Reaktionsprodukte wurde jeweils 1 ml der Kultur am Tag des Animpfens (t0) und am letzten Tag der Kultivierung (t1) abgenommen und mittels HPLC auf Produktbildung untersucht (siehe 4.5).

4.2.19 Elektronentransport zwischen den Partnern der Acetat-oxidierenden Kokultur Synac

Es wurde bisher noch nicht beschrieben, ob die Elektronen von Thermacetogenium phaeum zu seinem methanogenen Partner Methanothermobacter thermoautotrophicus in Form von molekularem Wasserstoff, oder Formiat transportiert werden. Um diese Frage zu beantworten, sollten Wachstumsversuche mit einer auf Methanol präkultivierten Reinkultur Thermacetogenium phaeum durchgeführt werden. Durch die Kombination verschiedener Substrate in Lösung, oder in Gasform sollten Rückschlüsse auf den Elektronencarrier gezogen werden. Hierzu wurden 120-ml Müller-Krempel Flaschen mit dem entsprechenden Medium (4.2.4) ohne Substrat befüllt und mit N2/CO2 (80%/20%) begast. Das Substrat in Form von 20 mM Formiat, 20 mM Formiat + H2, H2/CO2

(80%/20%), oder reinem H2 als Negativkontrolle wurde jeweils individuell zugegeben. Als Positivkontrolle diente ein Ansatz mit 20 mM Methanol als einzigem Substrat.

4.3 Beschreibung von Bakterienisolaten

4.3.1 Agarosebeschichtete Objektträger modifiziert nach Wagener et al. 1986

Um Bakterienisolate unter dem Mikroskop photographisch adäquat abbilden zu können, ist es oft nötig, die Organismen mit Hilfe von Agar- bzw. Agarose-beschichteten Objektträgern zu immobilisieren.

Qualitativ hochwertige Agarose (Seakem LE) wurde viermal analog der Verdünnungsreihe in Agar, in dest. Wasser gewaschen. Es wurde eine 1.6 %ige (w/v) Suspension hergestellt und in einem verschlossenen Gefäß 15 min bei 121ºC und 1 atm Überdruck autoklaviert.

Ca. 20 Objektträger wurden gereinigt, indem sie nacheinander in Gefäße mit Wasser, 97%igem Ethanol und 99%igem Aceton eingetaucht wurden. Anschließend wurden die Objektträger bis zur vollständigen Verflüchtigung der Flüssigkeit unter dem Abzug gelagert. Die trockenen und gereinigten Objektträger wurden dann auf einer perfekt ausbalancierten Oberfläche (mit Hilfe einer Wasserwaage geprüft) plaziert. Die Agarosesuspension wurde dann zu je 1.6 ml mit Hilfe einer