der Klinik für Rinder
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Einfluss der wiederholten instrumentellen Samenübertragung und von Inseminatkomponenten auf Eigenschaften
uteriner neutrophiler Granulozyten der Stute
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades einer
D O K T O R I N D E R V E T E R I N Ä R M E D I Z I N
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Alexandra Görgens aus Hildesheim
Hannover 2004
Univ.-Prof. Dr. med. vet. W. Leibold Univ.-Prof. Dr. med. vet. E. Klug PD Dr. med. vet. H. Zerbe
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. W. Leibold
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. A.-R. Günzel- Apel
Tag der mündlichen Prüfung: 04.06.2004
Diese Arbeit wurde gefördert von der H. Wilhelm Schaumann-Stiftung.
Meinen Eltern, meinem Bruder und meinem Opa
Vom Leben begeistert sein,
von jedem Leben,
auch von einem Leben,
das Mühe macht
2 LITERATURÜBERSICHT ...12
2.1 INSTRUMENTELLE SAMENÜBERTRAGUNG (IS) BEI DER STUTE...12
2.1.1 Einführung des Verfahrens und Besamungsmanagement ...12
2.1.2 Instrumentelle Samenübertragung (IS) mit Frischsamen...12
2.1.3 Bedeutung der Mehrfachbesamung für den Befruchtungserfolg...13
2.1.4 Wahl des Besamungszeitpunktes...14
2.1.5 Uterine Immunantwort nach Insemination ...15
2.1.6 Spermieneliminierung aus dem weiblichen Genitale ...16
2.1.7 Immunmodulatorisch wirksame Bestandteile des Inseminats...17
2.2 ENDOMETRITIS BEI DER STUTE...21
2.2.1 Rolle und Pathogenese bei der equinen Endometritis ...21
2.2.2 "Resistente" und "empfängliche" Stuten...22
2.3 UTERINE POLYMORPHKERNIGE NEUTROPHILE GRANULOZYTEN (PMN)...25
2.3.1 Extravasation und Migration ...26
2.3.2 Das Chemokin lnterleukin-8 (IL-8) ...26
2.3.3 PMN beeinflussende Faktoren ...28
3 MATERIAL UND METHODEN ...30
3.1 GERÄTE UND MATERIALIEN...30
3.1.1 Geräte-, Klinik - und Laborbedarf...30
3.1.2 Medikamente, Reagenzien und andere Materialien ...32
3.1.3 Lösungen, Medien und Puffer ...33
3.1.4 Materialien für die Zählung, Differenzierung, Vitalitätsbestimmung und Separation von Leukozyten und Spermien...34
3.1.5 Induktoren der Leukozyteneinwanderung in den Uterus...35
3.1.6 Materialien für die Durchflusszytometrie ...36
3.1.7 Materialien für die Bestimmung der Phagozytoseaktivität ...37
3.1.8 Materialien für die indirekte Membranimmunfluoreszenz...38
3.1.9 Materialien für den in-vitro-Transmigrationstest...38
3.1.10 Probanden...43
3.2 METHODEN...44
3.2.1. Gewinnung und Separation von Leukozyten aus dem Blut ...44
3.2.1.1 Blutentnahme...44
3.2.1.2 Serumgewinnung ...44
3.2.1.3 Separation polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten...44
3.2.2 Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung...46
3.2.3 Leukozytendifferenzierung...47
3.2.4 Gewinnung und Isolierung uteriner Leukozyten...47
3.2.5 Durchflusszytometrie ...49
3.2.6 Bestimmung der Phagozytosekapazität neutrophiler Granulozyten...51
3.2.10 Histologische Untersuchung von Endometriumgewebe ...58
3.2.11 Kontrolle von Rossesymptomen bei Versuchsstuten ...59
3.2.12 Statistische Auswertung und Datenverarbeitung...60
4 ERGEBNISSE...62
4.1 UNTERSUCHUNG ZUM EINFLUSS DER INSTRUMENTELLEN SAMENÜBERTRAGUNG (IS) AUF DIE UTERINE LEUKOZYTENEINWANDERUNG...62
4.1.1 Anzahl und Verweildauer von Leukozyten im Uterus nach Inseminatin von Frischsamen ...62
4.1.2 Untersuchungen zum Einfluss von wiederholten IS auf die uterine Leukozytenzahl ...65
4.1.2.1 Uteriner PMN-Influx nach IS und Infusion von rekombinatem humanem Interleukin 8 ( rhIL-8) ...65
4.1.2.2 UterinerPMN-Influx nach modellhafter wiederholter IS beim Pferd ...67
4.1.3 Einfluss der Uterusspülungen auf die bakterielle Kontamination der Gebärmutter ...69
4.1.4 Einfluss des histologische Status des Endometriums auf den Leukozyteninflux...70
4.2 FUNKTIONELLE EIGENSCHAFTEN UTERINER NEUTROPHILER GRANULOZYTEN NACH EINMALIGER UND WIEDERHOLTER INSEMINATION ...72
4.2.1 Phagozytoseaktivität ...73
4.2.2 Expression funktionsassoziierter PMN-Oberflächenstrukturen...75
4.3 TRÄCHTIGKEITSRESULTATE...78
4.4 IN-VITRO-UNTERSUCHUNGEN ZUR MODULATION DES UTERINEN PMN-INFLUX DURCH KOMPONENTEN DES INSEMINATES...79
4.4.1 Frischsamenverdünner ...80
4.4.2 Spermien...82
4.4.3 Seminalplasma ...85
5 DISKUSSION ...89
5.1 KONZEPTIONELLE ÜBERLEGUNGEN ZU UNTERSUCHUNGEN DER UTERINEN ENTZÜNDUNGSREAKTION NACH INSTRUMENTELLER SAMENÜBERTRAGUNG (IS) ...89
5.2 DYNAMIK DES UTERINEN PMN-INFLUX NACH IS ...91
5.3 EFFEKT EINER SIMULIERTEN WIEDERHOLTEN IS AUF DEN INTRAUTERI NEN PMN-INFLUX ...94
5.4 BESAMUNGSEFFEKTE AUF DIE FUNKTIONALITÄT UTERINER PMN...97
5.5 INSEMINATKOMPONENTEN MODULIEREN DIE PMN-TRANSMIGRATION... 99
5.6 FAZIT UND KONSEQUENZEN FÜR ZUKÜNFTIGE FORSCHUNGSAKTIVITÄTEN... 102
6 ZUSAMMENFASSUNG ...104
7 SUMMARY ...107
8 LITERATURVERZEICHNIS ...109
BSA bovines Serumalbumin C3 und C5 Komplementkomponenten
CD cluster of differentiation (Bezeichnung zellulärer Differenzierungsantigene)
cm Zentimeter
CO2 Kohlendioxid
CV Coefficient of Variance (Varianzkoeffizient)
CZ 5.1.5, 4, 3.2 Bezeichnung monoklonaler Antikörper mit Spezifitäten gegen equine Zellen dest. destillata (einfach destilliert)
DHR 123 Dihydrorhodamin 123
DMSO Dimethylsulfoxid
E. coli. Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
FACScan fluorescence activated cell scanner (Fluoreszenz-aktiviertes Zellanalysegerät)
Fc fragment cristalline (kristallisierbares Antikörperfragment) FCS fetal calf serum (fetales Kälberserum)
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FL -1, -2, -3 Fluoreszenz (1 = grün, 2 = orange, 3 = rot)
FS Frischsamen
FSV Frischsamenverdünner
FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht) g Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sec2)
ggf. gegebenenfalls
ggr. geringgradig
h hora/horae (Stunde(n))
hgr. hochgradig
Ig Immunglobulin(e)
IL-8 Interleukin-8
i.m. intramuskulär
IS Instrumentelle Samenübertragung
kg Kilogramm
KGW Kilogramm-Körpergewicht
Li Lithium
LPS Lipopolysaccharide mAk monoklonaler Antikörper
mgr. mittelgradig
MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) MIF Membranimmunfluoreszenz
min Minute
ml Milliliter
µg Mikrogramm
MW Mittelwert
n Anzahl der Tiere pro Untersuchung
NaCl (0,9%ige) Natriumchloridlösung NK Negativkontrolle
p Irrtumswahrscheinlichkeit (probability)
PBS phosphat buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PGF2α Prostaglandin F2α
p. insem. post inseminationem (nach der Besamung) Pj / PI Propidiumjodid (englisch: Propidium Iodide = PI) PK Positivkontrolle
PMN polymorphkernige neutrophile Granulozyten
® eingetragenes Warenzeichen
r Korrelationskoeffizient
rhIL-8 rekombinantes humanes Interleukin-8
ROS reactive oxygen species (reaktive Sauerstoffspezies)
R0+ Zellkulturmedium RPMI 1640 mit HEPES-Puffer, L-Glutamin, NaHCO3, mit Antibiotikum
Sc. Streptococcus
SD standard deviation (Standardabweichung)
SEM standard error mean (Standardfehler des Mittelwerts) Sheath fluid Trägermedium für Durchflusszytometrie
spp. spezies
SPL Seminalplasma
SSC side scatter (Seitwärtsstreulicht)
St. Staphylococcus
Tab. Tabelle
tridest. tridestillata (dreifach destilliert)
u.a. unter anderem
Vk Variationskoeffizient
Well Vertiefung in einer Mikrotiterplatte oder einer Transmigrationskammer
z.T. zum Teil
1. Einleitung
Die instrumentelle Samenübertragung (IS) beim Pferd hat in den letzten 15 Jahren weltweit an Bedeutung gewonnen. Sowohl für den Stuten- als auch für den Hengsthalter bringt die IS erheblich züchterische und wirtschaftliche Vorteile. Durch Optimierung des Besamungsmanagements und gezielte Auswahl der Zuchttiere gelingt es, hohe Trächtigkeitsraten (im Mittel 70 – 80 %) zu erreichen. Trotz dieser erfolgreichen Strategie kommt es bei Einzeltieren immer wieder zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten durch niedrigere Trächtigkeitsergebnisse. Die verantwortlichen Ursachen werden derzeit in den verschiedensten Bereichen der Reproduktionsbiologie gesucht. Als ein möglicher Aspekt wird die inflammatorische Reaktion des Endometriums auf die Besamung oder Belegung in Betracht gezogen, die zu Störungen in der fr ühen Embryonalentwicklung führen kann (POPE et al. 1990). Bei der Beobachtung von Stutenpopulationen fielen HUGHES und LOY (1969) Stuten auf, die nach mikrobieller uteriner Exponierung mit einer Streptococcus-Suspension nicht erkrankten („resistente Stute“) und solche, die eine erhöhte Krankheitsanfälligkeit („empfängliche Stuten“) aufwiesen. Etwa 15 % der Stuten entwickeln nach einer Besamung eine persistente Endometritis, welche eine reduzierte Fertilität nach sich zieht und somit zu wirtschaftlichen Verlusten führt (RIGBY und BARHOUMI 2001).
Nach der IS kommt es zu einer von neutrophilen Granulozyten dominierten Leukozyteneinwanderung in das endometriale Gewebe und das uterine Lumen (ENGELHARDT et al. 1997, ROZEBOOM et al. 1998). Derzeit wird davon ausgegangen, dass die als „physiologische Entzündung“ bezeichnete Reaktion durch Phagozytose von überzähligen Spermien und weiteren uterinen Kontaminanten an der Säuberung des uterinen Lumens beteiligt ist. Ihre Bedeutung für ein erfolgreiches Befruchtungsgeschehen ist weder be- noch widerlegt. Wenig ist bekannt über die Kinetik des zellulären Influx in den Uterus. Im ersten Teil der Arbeit soll deshalb der Beginn der Leukozyteneinwanderung und die Dauer ihrer Präsenz im Uterus untersucht werden. Eingewanderte Leukozyten sollen auf ihre Zusammensetzung, ihren Immunphänotyp und ihre funktionelle Kapazität geprüft werden.
Ausserdem soll eine Methode zur Simulation einer wiederholten IS etabliert werden. Ziel ist es, mit diesem Verfahren den Einfluss einer wiederholten IS auf zelluläre Mechanismen im Uterus und auf die Fruchtbarkeit untersuchen zu können.
Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit modulierenden Eigenschaften von Inseminatkomponenten (Spermien, Seminalplasma, Verdünner) auf das Wanderungsverhalten von PMN unter definierten in- vitro-Bedingungen. Hier soll nach Erklärungen für das Phänomen gesucht werden, dass Sperma zwar einen massiven Influx von Granulozyten in den Uterus bewirkt, jedoch viele Studien von einer die Granulozytenchemotaxis hemmenden Eigenschaft des Seminalplasmas berichten (CLARK und KLEBANOFF 1976, TROEDSSON et al. 1999, ROZEBOOM et al. 2000).
Mit der vorliegenden Arbeit soll damit das Verständnis für die im Uterus abla ufenden zellulären Prozesse nach der Besamung erweitert werden. Dies könnte zur Entwicklung von Konzepten beitragen, die über die Förderung oder Hemmung der leukozytären Reaktion im Rahmen der Besamung zu verbesserten Befruchtungsergebnissen führen.
2 Literaturübersicht
2.1 Instrumentelle Samenübertragung (IS) bei der Stute
2.1.1 Einführung des Verfahrens und Besamungsmanagement
Instrumentelle Samenübertragung oder auch künstliche Besamung der Stute wurde schon vor mehreren Jahrhunderten eingesetzt. Die ersten Erfahrungen mit dieser Art der Besamung machten Pferde aus dem arabischen Raum, wie aus überlieferten Schriften des 14.
Jahrhundert hervorgeht. Im größeren Rahmen wird dieses Verfahren allerdings erst seit dem zwanzigsten Jahrhundert durchgeführt (PERRY 1968). Russische Vorreiter wiesen den Weg als sie versuchten, mit der IS die Besamungserfolge von Hengsten zu verbessern (BOYLE 1992). Viele europäische Länder folgten diesem Beispiel relativ schnell und trugen zu einer erfolgreichen Weiterverbreitung der Technik in ganz Europa bei. In den fünfziger Jahren sind in China tausende Stuten erfolgreich besamt worden. In den USA veranlasste die Standardbred-Zucht andere Zuchtverbände zum Einsatz der IS bei Stuten (BOYLE 1992).
Allmählich stellte sich für diese Technik eine Akzeptanz in den einzelnen Zuchtverbänden ein. Die Verfahren wurden erheblich verbessert und in Deutschland nach dem zweiten Weltkrieg umfangreich zur Bekämpfung von Deckseuchen eingesetzt. Aber erst in den letzten 15 Jahren hat sich in Europa ein routinemäßiger Einsatz dieser Methode entwickelt. So liegt in der hannoverschen Zucht am Landgestüt Celle mittlerweile der Anteil der IS an den Belegungen bei annähernd 100 %.
2.1.2 Instrumentelle Samenübertragung (IS) mit Frischsamen
Die IS mit Frischsamen ist z.Z. das gebräuchlichste Verfahren in der Warmblutzucht. Die Befruchtungsraten sind mittlerweile höher als beim Natursprung. In der Tat kann die IS nicht nur die potentielle Fertilität einer Stute erhöhen, sondern ebenso die eines Hengstes. Seit den Studien von HOUSEHOLDER et al. (1981) wird im Allgemeinen eine minimale Spermiendosis von 500 x 106 progressiv motilen Spermien für eine IS an jedem zweiten Tag
mit maximalen Trächtigkeitsraten akzeptiert, obgleich Hengste mit hervorragender Fertilität eine maximale Trächtigkeitsrate mit einer viel geringeren Spermienzahl pro Frischsamendosis erzielen können. DENDAAS konnte 1992 beim Bullen zeigen, dass die Spermiendosis, die für maximale Trächtigkeitsraten nötig ist, vom jeweiligen Bullen abhängt. Dies könnte beim Hengst ähnlich sein.
2.1.3 Bedeutung der Mehrfachbesamung für den Befruchtungserfolg
Prinzipiell sollte die Anzahl der IS so gering wie möglich gehalten werden. Dafür sprechen vor allem wirtschaftliche Faktoren. Zusätzlich besteht bei jeder IS das Risiko einer Keimeinschleppung in den Uterus. Dagegen muss jedoch die Besamungsfrequenz ausreichend hoch sein, um zu garantieren, dass trotz der Variabilität von Rossedauer und Ovulationszeitpunkt mindestens eine der IS ovulationsnah erfolgt. Die Frequenz der IS und deren Beziehung zur Trächtigkeitsrate ist bei der Stute über Jahre einer genauen Prüfung unterzogen worden. Eine für die Entstehung der Endometritis „empfängliche Stute“ mit einer ungenügenden uterinen Clearance sollte vernünftigerweise nur einmalig besamt werden, um eine wiederholte Manipulation und Belastung des Uterus mit irritierenden und kontaminierenden Faktoren zu vermeiden (METCALF 2000 b). Dagegen können bei der IS von Stuten, bei denen eine Subfertilität bekannt ist, oder beim Einsatz eines subfertilen Hengstes wiederholte IS die Verfügbarkeit einer adäquaten Anzahl an Spermien im Eileiter sichern.
Die tägliche IS geschlechtsgesunder Stuten mit tiefgefrorenem Sperma über mehrere Tage hatte keine negativen Auswirkungen auf die Trächtigkeitrate (LOVE et al. 1989). TYLER (1982) zeigte, dass nach einer Doppelbesamung beim Kaninchen, Spermien aus der zweiten Insemination unbeeinträchtigt eine grosse Zahl von uterinen PMN passieren und zur Befruchtung der Eizelle führen können. Stuten, die dreimal in 24-stündigem Abstand innerhalb der Rosse im Natursprung gedeckt wurden, erzielten im Vergleich zu anderen in der Praxis gängigen Belegungsarten und IS-Frequenzen die höchsten Trächtigkeitsraten pro Rosse (73,6%) (MERTENS 2002).
2.1.4 Wahl des Besamungszeitpunktes
Für akzeptable Befruchtungsergebnisse ist die Wahl des optimalen Inseminationszeitpunktes Voraussetzung. Die zeitliche Beziehung der Insemination zur Ovulation und die resultierenden Trächtigkeitsraten wurden in zahlreichen Studien untersucht. Entscheidend für die Festlegung des Zeitpunktes der Belegung sind Kenntnisse über Lebensdauer und Befruchtungsfähigkeit der Gameten im weiblichen Genitaltrakt. Die Lebensdauer der unbefruchteten Eizelle ist auf einige Stunden nach der Ovulation begrenzt. Vermutlich ist der Oozyt nur für maximal 12 Stunden nach der Ovulation befruchtungsfähig (GINTHER 1992).
Die Spermien benötigen für ihre Wanderung durch das weibliche Genitale und für das Erreichen der Befruchtungsfähigkeit etwa 9 Stunden (ANDERS et al. 1987). Die Möglichkeit des Überlebens der Spermatozoen über einen Zeitraum von wenigstens 6 Tagen konnte in einer Eileiter-Zellkultur nachgewiesen werden (ELLINGTON et al. 1993). Dies stützt die Beobachtung von NEWCOMBE (1994) nach der eine Stute von einer Einzelbesamung sieben Tage vor der Ovulation tragend wurde. Von einer Trächtigkeit resultierend aus einer Besamung mindestens 6 Tage vor der Ovulation berichten WOODS et al. (1990).
Es wurde wiederholt dokumentiert, dass praeovulatorische Inseminationen mit gekühltem Frischsamen bessere Trächtigkeitsraten ergeben, als postovulatorische Besamungen, solange die Stuten in einem Zeitraum von 0 bis 48 Stunden vor der Ovulation belegt wurden. Bei der Bewertung der postovulatorischen Besamung ist auch die mit der steigenden Progesteronkonzentration einhergehende Abnahme der Myometriumkontraktilität zu beachten (ZEROBIN und SPÖRRI 1972). TROEDSSON et al. (1991, 1993) gehen davon aus, dass bei der Stute die Kontraktionsfähigkeit des Uterus ein entscheidendes Kriterium für die uterine Reinigung nach der Besamung ist. Durch Abnahme der Kontraktilität können überschüssige Spermien, Keime und uterine Ent zündungsprodukte nicht rechtzeitig vor dem Abstieg des Embryos eliminiert werden. Im Resultat nimmt die Fertilität durch Störungen der Embryona lentwicklung ab. WOODS et al. (1990) konnten vermehrte Embryonalverluste bei postovulatorischen Inseminationen aufzeigen.
2.1.5 Uterine Immunantwort nach Insemination
Nach Absetzen des Inseminats in den Uterus kommt es zu einer inflammatorischen Reaktion des Organs, die durch Ödematisierung, Hyperämie und intrauterine Immigration von Leukozyten in das Endometrium und das equine Uteruslumen gekennzeichnet ist (VOGELPOEL und VERHOEF 1985). Eine von PMN geprägte leukozytäre intrauterine Immigration nach der Belegung wurde bei der Stute dokumentiert (KATILA 1995, KOTILAINEN et al. 1994, TROEDSSON et al. 1995). Hier erscheinen bereits eine Stunde nach der Insemination die ersten Zellen im Uterus. Zwischen 6 und 12 Stunden nach der Insemination erreicht die leukozytäre Reaktion ihr Maximum, um dann nach 48 Stunden vollständig abzuklingen (KATILA 1995). Beim Schwein, das sich durch ein großvolumiges Inseminat auszeichnet, wurde erstmals von LOVELL und GETTY (1968) nach Natursprung und von PURSEL et al. (1978) nach IS eine uterine inflammatorische Reaktion beobachtet. In beiden Fällen konnte ein starker Leukozyteneinstrom in den Uterus registriert werden, der in erster Linie durch neutrophile Granulozyten geprägt war. Detaillierte Untersuchungen von ROZEBOOM et al. (1998) bestätigten, dass 92-99% der aus dem Uterus isolierten Leukozyten PMN waren. Daneben konnten ENGELHARDT et al. (1997) einen geringen Anteil mononukleärer Zellen in der luminalen Flüssigkeit nachweisen. Sie identifizierten diese Zellen als Makrophagen und/oder Monozyten. Gleichzeitig belegten sie anhand histologischer Studien, dass der luminale Leukozyteninflux von einer verstärkten Einwanderung dieser Zellen ins Endometrium begleitet ist. Die leukozytäre Reaktion greift jedoch nicht auf die uterotubale Verbindung und den Eileiter über.
Die auf den Besamungsreiz hin induzierte uterine Reaktion wird maßgeblich durch den Hormonstatus der Tiere beeinflusst. ROWSON et al. (1953) demonstrierten am Beispiel des Rindes, dass es nach einer Insemination in der Lutealphase bei ovariektomierten Kühen oder nach einer Progesteronbehandlung ausnahmslos zur Ausbildung einer Pyometra kommt.
Hingegen zeigten sich östrische oder ovariektomierte Östrogen-behandelte Kühe resistent gegenüber einer Infektion. Nach einer Insemination von diöstrischen Sauen konnten ENGELHARDT et al. (1997) durchschnittlich weniger endometriale Leukozyten finden als nach einer Insemination im Östrus. Bei einem Teil der diöstrisch besamten Tiere kam es zur
Ausbildung einer Endometritis. Die inflammatorische uterine Reaktion nach der Besamung ist nach Ansicht verschiedener Autoren Voraussetzung für eine erfolgreiche Trächtigkeit. Die Bedeutung der uterinen Immunantwort liegt nach Ansicht mehrerer Autoren in ihrem Beitrag zur „uterinen Clearance“ (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1990, TROEDSSON et al. 1995, ENGELHARDT 1997, ROZEBOOM et al. 1999). Um das von POPE et al. (1990) beschriebene optimale Uterusmilieu für die Embryonenentwicklung zu schaffen, müssen überschüssige Spermien, Spermienreste und die bei der Besamung eingeschleppten bakteriellen Kontaminanten aus dem weiblichen Genitaltrakt eliminiert werden.
2.1.6 Spermieneliminierung aus dem weiblichen Genitale
Verschiedene Studien belegen, dass die Spermienkonzentration im porcinen Uterus im Laufe von 2 Tagen nach der Insemination allmählich abnimmt, wobei die Spermienanzahl bereits innerhalb der ersten Stunden um 5-10% reduziert wird (FIRST et al. 1968, VIRING et al.
1980, KAMERMAN 1994). Eine veränderte Oberflächenbeschaffenheit der Spermien scheint den Vorgang zu beschleunigen. So fanden MATTNER et al. (1968) und PURSEL et al.
(1978) 2 Stunden nach der Insemination mit Tiefgefriersperma bedeutend weniger Spermien im Reproduktionstrakt der Sau als nach einer Besamung mit frischem Samen.
Der wohl bedeutendste Mechanismus bei der Spermienreduktion ist der Rückfluss über Zervix uteri und Vagina, dessen Ursache gesteigerte retrograd gerichtete Myometriumkontraktionen sind. Nach VIRING und EINARSSON (1981) werden dabei innerhalb der ersten 2 Stunden nach der Bedeckung der Sau 25-30 % der Spermien ausgeschieden.
KAMERMAN (1994) geht von einer 50%igen Elimination der applizierten Spermien innerhalb der ersten Stunden bei der Sau aus. Neuere Untersuchungen von STEVERINK et al.
(1998) ermittelten eine durchschnittliche Rückflussrate von 70% des eingesetzten Besamungsvolumens mit einem Spermienverlust von 25% in einem Zeitraum von 2,5 Stunden nach der Besamung. Die größten Verluste traten dabei schon während der Insemination auf.
Im Zuge der Spermienwanderung kommt es darüber hinaus zur Adhäsion der Spermien an zilientragende Uterusepithelzellen, zur Einwanderung in uterine Drüsen und zur Agglutination der Zellen, so dass diese Spermien für eine Befruchtung nicht mehr zur Verfügung stehen (HUNTER 1995).
Schließlich wird der oben bereits erwähnten uterinen Leukozytenimmigration eine Beteiligung an der Spermienelimination zugesprochen (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al.
1990, TROEDSSON et al. 1995, ROZEBOOM et al. 1999, ENGELHARDT et al. 1997).
Insbesondere sind dabei die primär anzutreffenden neutrophilen Granulozyten für die Phagozytose von Spermien verantwortlich (LOVELL und GETTY 1968, PURSEL et al.
1978, KAMERMAN 1994, FRANK et al. 1983). LOVELL und GETTY (1968) sowie PURSEL et al. (1978) beobachteten 2 Stunden nach dem Deckakt phagozytierende uterine Leukozyten.
Neben der Phagozytose durch PMN spielt die Phagozytose durch uterine Makrophagen (HANEY und MISUKENIS 1983), vaginale Fibroblasten und Epithelzellen (PHILIPS und MAHLER 1977) bei der Beseitigung der Spermien eine Rolle.
2.1.7 Immunmodulatorisch wirksame Bestandteile des Inseminats
Spermien
Während der Spermatoge nese, der epididymalen Reifung und des Kontaktes mit dem Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen bei der Ejakulation kommt es zu einer kontinuierlichen Ausbildung eines Spermienmembran-Polypeptid-Profils. Diese charakteristische Ober- flächenstruktur stellt ein potentielles Antigen für den weiblichen Genitaltrakt dar, in dem es daraufhin zur Antikörperproduktion kommt (ANSBACHER 1981, HAAS und BEER 1986).
Allerdings ist die Gefahr der Immunisierung bei unseren domestizierten Haussäugetieren geringer als beim Menschen, da sie innerhalb ihres reproduktiven Lebens nur wenige Male besamt werden (MATOUSEK 1985). Um festzustellen, welche Rolle Spermien bei der Auslösung inflammatorischer Prozesse am equinen Uterus spielen, wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt. TROEDSSON (1995) berichtete, dass die Stärke einer
Sperma- induzierten Leukozytenrekrutierung in dem equinen Uterus vergleichbar mit der einer uterinen Reaktion auf die Kontamination mit Streptococcus zooepidemicus ist. Das verwendete Sperma war vo n Seminalplasma und Bakterien befreit worden. Auch in anderen Spezies wie Ratte und Maus (AUSTIN 1957), Ziege und Schaf (MATTNER 1986), Kaninchen (TYLER 1977), Mensch (COHEN 1984) und Schwein (ROZEBOOM et al. 1999) konnte eine Sperma- induzierte intrauterine Leukozytenimmigration nachgewiesen werden.
MARONI und WILKINSON (1971) beobachteten die Anlockung von Makrophagen durch mit Serum oder Plasma inkubierten humanen Spermien. CLARK und KLEBANOFF (1976) demonstrierten in- vitro den chemoattraktiven Effekt von in Serum inkubierten bovinen und humanen Spermien vorwiegend auf neutrophile Granulozyten, wobei speziesspezifische Unterschiede bezüglich der Intensität der Anlockung bestanden. Die Autoren gehen davon aus, dass Spermien die Komplementkaskade über den „a lternativen Weg“ aktivieren und damit chemoattraktive Komplementkomponenten gebildet werden. Im Gegensatz zum
„klassischen Weg“ wird dabei die Komplementaktivierung in Abwesenheit von Antikörpern ausgelöst. Im Plasma vorhandene spontan aktivierte Komplementkomponenten (C3b) binden an die Oberfläche von Pathogenen (hier Spermien) und lösen so die weiteren Schritte der Komplementkaskade aus (JANEWAY und TRAVERS 1997).
TROEDSSON et al. (1998) bestätigen am Beispiel der Hengstspermien, dass Komplementkomponenten essentiell für die chemoattraktive Wirkung der Spermien sind. So haben equine Spermien allein oder in hitzeinaktiviertem Blutplasma keinen migrationsfördernden Effekt auf PMN, während Spermien inkubiert in Blutplasma oder uterinem Sekret chemoattraktive Eigenschaften zeigen. Daraus schließen die Autoren auf das Vorkommen von uterinen Komplementkomponenten, wie sie auch schon beim Kaninchen von JONES et al. (1988) beschrieben wurden. Neben dem Weg der Komplementaktivierung scheint beim Schwein ein zusätzlicher komplement-unabhängiger Mechanismus für die Spermien- induzierte Chemotaxis der PMN zu existieren (ROZEBOOM et al. 2001). Epididymale und gewaschene Eberspermien zeigten eine chemoattraktive Wirkung auf PMN sowohl in frischem Blutplasma als auch in hitzeinaktiviertem Blutplasma.
VOGELPOEL und VERHOEF (1985) studierten mittels Chemolumineszenzmessung die spermieninduzierte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) durch PMN im Beisein von Serum. Es konnte gezeigt werden, dass Spermien in erster Linie über den „alternativen Komplementweg“ und teilweise auch über Immunglobuline PMN aktivieren können. Der
Einsatz von toten Spermien führte im Vergleich zu lebenden Spermien zur schnelleren und mehr als doppelt so hohen Aktivierungsrate der PMN.
Seminalplasma
Nach einer Bedeckung dient das Seminalplasma (SPL) als Bestandteil des Inseminats dem Schutz und der Ernährung der Spermien im weiblichen Genitale (WABERSKI et al. 1995b, c). Bei verlängerter Exposition konnten dagegen nachteilige Effekte des SPL auf die Spermien bei Pferd und Rind nachgewiesen werden (PICKETT et al. 1975; AMANN et al.
1987; MAGISTRINI et al. 1988; PRUITT et al. 1993). Durch seinen hohen Östrogengehalt (ca. 10 ng/ml) und die daraus resultierende Freisetzung des uterokontraktilen PGF2α aus dem porcinen Endometrium hat SPL einen positiven Einfluss auf den passiven Spermientransport (CLAUS 1990, WABERSKI et al. 1995b). Zusätzlich reguliert es den zeitlichen Ablauf der Kapazitation (WABERSKI et al. 1999b). Bei der Sau wurde eine ovulationsvo rverlegende Wirkung des SPL nachgeweisen (WABERSKI et al. 1999a, NORDEN 2000).
Von Spermien befreites SPL war beim Kaninchen (TYLER 1977) und beim Menschen (COHEN 1984) nicht chemoattraktiv für PMN. In einer Studie von REILAS (2001) hatte dagegen die intrauterine Verabreichung von SPL eine Neutrophilie im equinen Uterus zur Folge. Ebenso konnte die Autorin nachweisen, dass der Zusatz von SPL zu aufgetauten Spermien keine Reduzierung der uterinen inflammatorischen Reaktion bewirkt. Hingegen konnten ROZEBOOM et al. (1999) nach der Insemination von reinem SPL und Spermien mit SPL etwa 30% weniger Leukozyten aus dem uterinen Lumen von Jungsauen isolieren, als nach der Verabreichung von Spermien in PBS. Dies deckt sich mit den Ergebnissen von CLARK und KLEBANOFF (1976) sowie von TROEDSSON et al. (1999) bei humanem, bovinem und equinem SPL. Die Autoren zeigten einen negativen Einfluss von mit Serum inkubiertem SPL auf Chemotaxis und Phagozytoseaktivität von PMN. Sie gehen von einer Hemmung des „alternativen Komplementwegs“ aus, der für die spermienbedingte Anlockung der Zellen ins uterine Lumen verantwortlich sein könnte. ROZEBOOM et al. (2000) setzten porcines SPL und Spermien in Blutplasma sowie in hitzeinaktiviertem Blutplasma in einer Transmigrationskammer ein und verglichen die daraufhin einsetzende Wanderung porciner PMN gege nüber einer Negativ- (Fetales Kälberserum) und einer Positivkontrolle (Lipopolysaccharid-aktiviertes Blutplasma). Bei Anwesenheit von SPL wanderten durchschnittlich 40-50% weniger PMN als bei Anwesenheit von gereinigten Spermien. Dabei
hatte die Hitzeinaktivierung des Blutplasmas keinen Einfluss. Aus diesen Ergebnissen und aus denen der oben beschriebenen in vivo-Versuche (ROZEBOOM et al. 1999) ziehen die Autoren den Schluss, dass porcines SPL über Hemmung der Komplementkaskade und die Blockierung bisher nicht identifizierter hitzestabiler, chemotaktischer Faktoren suppressiv auf die besamungsbedingte uterine inflammatorische Reaktion wirkt.
PRAKASH und LANG (1980) demonstrierten im humanen System, dass SPL in der Lage ist, Spermien vor Antikörpererkennung und Phagozytose zu schützen. Dabei maskieren oder modifizieren Komponenten des SPL (z.B. Polyamine, Transglutaminase) die Spermienantigene. Auch die im Zuge der Phagozytose erfolgende Produktio n von reaktiven Sauerstoffspezies durch Makrophagen und neutrophile Granulozyten wird durch das SPL von Mensch (SKIBINSKI et al. 1992) und Rind (BAMBERGER et al. 1984) gehemmt. Diese Ergebnisse konnten durch einen in- vivo-Versuch bei Stuten bestätigt werden. Nach experimentell induzierter akuter Endometritis sind Stuten mit in SPL oder Verdünner suspendierten Spermien inseminiert worden. Während bei Anwesenheit von SPL 77 % der Stuten tragend wurden, konnte bei Verwendung von Verdünner ohne SPL nur bei 5 % der Stuten eine Trächtigkeit nachgewiesen werden. Aufgrund z.T. widersprüchlicher Resultate hinsichtlich der chemotaktischen Wirkung bzw. der Wirkungsweise von SPL und seiner Komponenten sind weitere Studien über die Rolle des SPL im Besamungsgeschehen erforderlich.
Frischsamen-Verdünner (FV)
Die Art und Weise, wie mit dem gewonnenen Samen verfahren wird, richtet sich nach seiner späteren Verwendung als Frischsamen, Versandsamen oder Tiefgefriersamen. Für die Frischsamenverdünnung stehen z.B. der Kenney-Verdünner, ein Magermilch-Verdünner oder ein glycinhaltiger- Eigelb-Verdünner zur Verfügung (SAMPER et al. 2000).
Samenverdünner sind isotone Medien mit Pufferkapazität. Sie enthalten schützende Stoffe, die das Überleben der Spermatozoen außerhalb des Reproduktionstraktes der Stute sichern.
Hierzu gehören auf der einen Seite die Lipoproteine, zu finden in Eigelb- und Magermilchpräparationen, die Spermien vor Schädigung durch Abkühlen oder Gefrieren schützen. Weiterhin sind Substrate, wie z.B. Glucose für den Energie-Stoffwechsel der Spermien, enthalten. Ausserdem werden dem FV Antibiotika zugesetzt, um bakterielles
Wachstum zu reduzieren bzw. zu verhindern, da eine Kontamination mit ubiquitären Keimen bei Samengewinnung und –aufbereitung nicht ganz zu vermeiden ist. Der gewonnene und beurteilte Samen sollte innerhalb weniger Minuten nach der Ejakulation mit einem 37°C warmen FV je nach Lagerungszeit und Spermienkonzentration etwa in einem Verhältnis von 1 : 1 (Sperma zu Verdünner) und einer Konzentration von 25-50 x 106 Samenzellen/ml verdünnt werden. Dann wird er sukzessiv auf 5°C abgekühlt, um den Metabolismus der Spermien zu hemmen (VARNER et al. 1987). Weiterhin erfolgt häufig ein Zusatz von zuvor abzentifugiertem Seminalplasma in einer Endkonzentration von 5-20% (JASKO et al. 1991).
REILAS et al. (2001) überprüften inflammatorische Effekte von verschiedenen, in der Praxis gebräuchlichen FV, indem anschließend an die intrauterine Applikation eine Uterusspülung durchgeführt wurde. Nach Verabreichung von PBS, einem Eigelb- sowie einem Magermilchverdünner konnten, z.B. im Gegensatz zum Natursprung und zur Applikation von tiefgefrorenem Samen, nur geringe PMN-Konzentrationen im Uterus nachgewiesen werden.
FIALA et al. (2002) konnten dagegen nach einer intrauterinen Infusion eines Magermilchverdünners wesentlich höhere PMN-Zahlen nachweisen. Die uteri dieser Stuten wurden nach 2, 4 und 24 Stunden mittels Katheter und PBS gespült. Es war ein kontinuierlicher Anstieg der PMN-Zahlen zu verzeichnen mit einem Maximum nach 24 Stunden.
2.2 Endometritis bei der Stute
2.2.1 Rolle und Pathogenese der equinen Endometritis
Durch Belegung (Natursprung oder IS) oder peripartal kann es zu einer Kontamination des Uterus mit Infektionserregern und damit zur Entzündung des Endometriums kommen. Dies kann zu einer Störung des uterinen Milieus führen und die Fertilität beeinträchtigen. Im Anschluss an eine Besamung wird ein kurzzeitiger, vorübergehender entzündlicher Prozess am Endometrium als physiologisch angesehen. Er is t eine notwendige Reaktion des Organismus auf unterschiedliche Kontaminanten, wie das Hengstsperma, Bestandteile des verwendeten Verdünners oder auch auf die in das Uteruslumen eingebrachten Bakterien (KOTILAINEN et al. 1994, TROEDSSON et al. 1995).
Neben Erkrankungen des Respirationsapparates und Koliken wird die Endometritis als eines der wichtigsten Probleme in der Pferdepraxis eingestuft (DOIG et al. 1981, TRAUB- DARGATZ et al. 1991). Den Hauptgrund für verminderte Fertilität bei Zuchtstuten stellt die persistierende Endometritis dar. ZENT und TROEDSSON (1998) haben in einer Studie mit Vollblutstuten beobachtet, dass in einer repräsentativen Gruppe etwa 15% der Stuten im Anschluss an eine Belegung eine persistierende Endometritis entwickelt haben.
Es wird grundsätzlich davon ausgegangen, dass das Uteruslumen einer fertilen Stute keimfrei ist oder von einer nur vorübergehenden, nicht ortsansässigen Mikroflora besiedelt wird, obwohl der Reproduktionstrakt einer Stute durch Deckakt, Abfohlung und tierärztliche Tätigkeiten mit Bakterien oftmals kontaminiert wird. Auch anatomische Veränderungen, wie eine Uro- oder Pneumovagina können für die Entwicklung einer persistierenden Endometritis mitverantwortlich sein (SAMPER et al. 2000). Die physikalischen Barrieren gegen eine Infektion sind die Schamlippen, der Hymenalbereich und die Zervix uteri. Die Möglichkeit der Bakterienisolation aus geschlechtsgesunden Stuten nimmt fortschreitend von der Fossa clitoridis (94%), über Vestibulum (69%) und craniale Vagina (42%) zum Uterus (31%) ab (HINRICHS und KENNEY et al. 1989).
Normalerweise wird die Schleimhaut des Vestibulums und der Clitoris von einer harmlosen Bakterienpopulation besiedelt, welche charakteristischen Schwankungen unterworfen ist. In Verbindung mit gutartigen saprophytischen Organismen können opportunistische Organismen, wie Streptococcus zooepidemicus, Escherichia coli und Staphylococcus spp.
isoliert werden. Die Praeputialschleimhaut des Hengstes weist eine ähnliche Flora auf. Die am häufigsten isolierte Bakterienspezies bei einer akuten Endometritis ist Sc. zooepidemicus, gefolgt von E. coli. Der Uterus antwortet auf eine bakterielle Kontamination mit einem massiven Influx von neutrophilen Granulozyten (PYCOCK und ALLEN 1990), die die Bakterien u.a. durch Phagozytose innerhalb von 24 Stunden eliminieren. Die inflammatorischen Nebenprodukte werden in der Regel mechanisch beseitigt.
2.2.2 „Resistente“ und „empfängliche“ Stuten
Stuten können nach ihrer Fähigkeit, eine bakterielle Infektion zu eliminieren, in empfänglich („susceptible mares“) und resistent („resistant mares“) gegenüber einer persistierenden
Endometritis eingeordnet worden. Bereits 1969 wurde von HUGHES und LOY eine natürliche Resistenz junger Stuten gegenüber einer künstlich erzeugten bakteriellen Infektion festgestellt. Weitere Untersuchungen von PETERSON et al. (1969) haben ergeben, dass nach uteriner Verabreichung einer Sc. zooepidemicus- oder Pseumonaden-Suspension multipare und güste Stuten häufiger eine anhaltende Entzündung entwickelten als Maidenstuten.
HUGHES und LOY entwickelten 1969 diesen Gedanken weiter und bestätigten, dass
„resistente“ Stuten ohne unterstützende medikamentelle Behandlung in der Lage sind, eine induzierte Infektion zu eliminieren, während dies bei empfänglichen Stuten nicht der Fall ist.
RIGBY et al. (2001) postulierten, das annähernd 15% der belegten Stuten eine persistierende Endometritis ausbilden. Die Empfänglichkeit gegenüber einer Endometritis ist kein absoluter Status einer Zuchtstute, da ein Versagen des uterinen Schutzmechanismus meist nur den Prozess der uterinen Clearance verlangsamt. In der Praxis ist eine große Variation hinsichtlich der Formen einer „Empfänglichkeit“ zu beobachten, was bedeutet, dass Stuten oft nicht eindeutig einer der beiden Gruppen, „resistent“ oder „empfänglich“, zugeordnet werden können (PYCOCK et al. 1997).
Bei der IS wird der Samen direkt in die Gebärmutter appliziert, was immer ein Infektionsrisiko darstellt. In der Regel sind die uterinen Abwehrkräfte in der Lage, innerhalb weniger Stunden bis Tage eine Infektion erfolgreich zu bekämpfen. Bei „empfänglichen“
Stuten kann es jedoch zur Entwicklung einer persistierenden Endometritis kommen.
Außerdem konnte aufgezeigt werden, dass Spermien auch ohne eine bakterielle Kontamination eine entzündliche Antwort im Uterus induzieren (KATILA et al. 1995;
TROEDSSON 1995). Diese Arbeiten deuten an, dass die Intensität der uterinen entzündlichen Reaktion von der Konzentration und/oder dem Volumen des Inseminates abhängt. Dies bedeutet, dass konzentrierter Samen (Tiefgefriersperma) eine stärkere entzündliche Reaktion im Uterus hervorruft als frisches oder verdünntes Sperma. Nach PARLEVLIET et al. (1997) ist die Intensität der uterinen entzündlichen Reaktion auf eine Besamung vielmehr von den Spermien selbst als vom Samenverdünner abhängig. Nach bisherigen Erkenntnissen hat die Vitalität der Spermien keinen signifikanten Einfluss auf den PMN-Influx in den Uterus (KATILA 1997).
Die transiente Endometritis im Anschluss an eine Belegung klingt spontan innerhalb von 24 bis 72 Stunden ab, so dass das Uterusmilieu dann bereit für die Aufnahme und Versorgung des Embryos ist. Diese Form der Endometritis ist somit eine physiologische Reaktion, um den
Uterus von überschüssigen Spermien, Seminalplasma und von Entzündungsprodukten zu reinigen, bevor der Embryo ca. 5 Tage nach der Befruchtung aus dem Eileiter in das Uteruslumen übertritt. Wenn dagegen die Endometritis bis zum 4. oder 5. Zyklustag fortbesteht, gefährdet das Uterusmilieu das Überleben des Embryos im Uterus. Ausserdem kann es im Ergebnis einer entzündungsbedingten Freisetzung von PGF2a zur Luteolyse und damit zum vorzeitigen Eintritt der Rosse kommen (NEELY et al. 1979).
Die meisten Studien über Immunglobuline, Opsonine und die funktionellen Fähigkeiten von neutrophilen Granulozyten aus dem Uterus von „empfänglichen“ Stuten konnten die Vermutung einer eingeschränkten Immunantwort als entscheidende Krankheitsursache bisher nicht bestätigen (ALLEN und PYCOCK 1989). Dagegen beobachteten LIU et al. (1985) bei PMN „empfänglicher“ Stuten eine reduzierte Phagozytosefähigkeit und stellten ausserdem einen Defekt in der Opsonisierung durch Komplementfaktoren und Antikörper fest.
EVANS et al. (1986) wiesen darauf hin, dass eine verminderte physikalische Drainage der Gebärmutter verantwortlich für eine erhöhte Empfänglichkeit der Stute für die Entstehung einer Endometritis sein könnte. Die mechanische Fähigkeit des Uterus zur Elimination von Bakterien, inflammatorischen Trümmern und Flüssigkeitsansammlungen wird heute häufig als ein kritischer Faktor der uterinen Selbstreinigung gesehen. Die myometriale Aktivität ist häufig bei älteren und multipaaren Stuten reduziert (EVANS und IRVINE 1986). Bei einem Vergleich von empfänglichen und resistenten Stuten hinsichtlich der Eliminierung eines nicht-antigenen Markers aus dem Uterus, konnten TROEDSSON und LIU (1991) eine verzögerte mechanische Clearance bei den empfänglichen Stuten nachweisen. Es ist eine logische Schlussfolgerung, dass jegliche Beeinträchtigung dieser Funktion (z.B. der myometrialen Kontraktilität) eine Stute empfänglich für eine persistierende Endometritis macht (TROEDSSON et al. 1991, 1993; LEBLANC et al. 1994).
Das Erkennen einer für eine Endometritis empfänglichen Stute ist häufig schwierig, da schon geringgradige Veränderungen des uterinen Milieus Störfaktoren sein können, welche mit den gebräuchlichen Untersuchungsmethoden nur schwierig zu erfassen sind. Viele Stuten zeigen vor der Belegung keine Anzeichen einer Endometritis, reagieren aber trotzdem mit einer persistierenden Entzündung.
Der Vorbericht ist unter Praxisbedingungen ein sehr nützliches Hilfsmittel zur Erkennung einer solchen „empfänglichen“ Zuchtstute. Zum Nachweis uteriner
Flüssigkeitsansammlungen, welche für eine verminderte uterine Clearance sprechen, setzte sich in der Praxis die Ultraschalluntersuchung durch. Die Anwesenheit von vermehrter Flüssigkeit im Uteruslumen vor einer Belegung kann als deutlicher Hinweis auf eine nachfolgende besamungsinduzierte persistierende Entzündungsreaktion gewertet werden (PYCOCK und NEWCOMBE 1996). ÖZGEN et al. (1997) machen für Flüssigkeitsansammlungen im Uterus auch hormonelle Dysregulationen verantwortlich, die über eine gestörte Expression von Östrogen- und Progesteronrezeptoren im Endometrium zur Hypersekretion der Uterindrüsen führen könnte. Weitere Ursachen einer uterinen Flüssigkeitsakkumulation können sowohl eine Übersekretion durch Uterindrüsen, als auch Störungen des Lymphabflusses sein (RASCH et al. 1996). Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist jedoch noch nicht sicher geklärt, ob die Flüssigkeitsakkumulation das Resultat einer Überproduktion, eines Defizits der mechanischen Clearance über die Zervix oder eines Mangels der lymphatischen Resorption darstellt. Eine Kombination aller drei möglichen Ursachen scheint möglich.
2.3. Uterine polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN)
Neben den Makrophagen sind die PMN eine bedeutende Zellpopulation bei der unspezifischen zellulären Immunabwehr. Sowohl bei akuten Entzündungen als auch bei der Bekämpfung von parasitären und bakteriellen Infektionen treten sie meist gemeinsam mit Antikörpern und Komplementfaktoren in Aktion. Kennzeichnend für eine akute Entzündungsreaktion ist der Influx von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) in das Gewebe. Am Ort der Entzündung sind PMN neben Makrophagen als erste Leukozytensubpopulation anzutreffen (LEHRER 1988).
PMN werden nach ihrer Bildung im Knochenmark in den Blutstrom abgegeben, wo sie nur wenige Stunden zirkulieren (WECKER 1990, KLEIN 1991). Das Pferd weist, bezogen auf kernhaltige Zellen, ein sogenanntes granulozytäres Blutbild auf. Die segmentkernigen neutrophilen Granulozyten stellen beim gesunden Individuum mit 50-80% die größte Leukozytenpopulation dar (BICKHARDT 1992).
2.3.1 Extravasation und Migration
Als Extravasation wird der Vorgang des Auswanderns von PMN aus dem peripheren Blut in das extravaskuläre Gewebe bezeichnet. Sowohl durch die Gefäßendothelzellen des betroffenen Gewebes als auch durch die Granulozyten selbst kann dieser Prozess vermittelt und reguliert werden (HOGG 1992). Verschiedene chemoattraktive Substanzen wie Komplementkomponenten, Produkte bakterieller Erreger (z.B. LPS) oder von ortständigen Zellen sezernierte Zytokine können in einem entzündetem Gebiet auf die PMN einwirken.
Auf diese Signale reagieren die PMN mit einer veränderten Expression von Adhäsionsmolekülen. Die Folge ist eine reversible Anheftung der PMN an die Endothelzellen, wodurch eine Reduzierung ihrer Strömungsgeschwindigkeit und eine Transmigration ins Entzündungsgebiet erreicht wird. Durch ihre selektive Expression von Adhäsionsmolekülen tragen die Gefässendothelzellen des betroffenen Gebietes ebenfalls zur Anheftung der PMN bei. Hierzu gehören interzelluläre Adhäsionsmoleküle, E-Selektine und P-Selektine, welche als Gegenstücke zu Kohlenhydratepitopen auf Leukozyten agieren (JANEWAY und TRAVERS 1997). Darüber hinaus sind durch Entzündungsmediatoren stimulierte Endothelzellen in der Lage, PMN-aktivierende Substanzen, wie den Plättchen- Aktivierenden-Faktor (PAF) und das potente chemoattraktive Zytokin Interleukin-8 (IL-8), zu erzeugen, welche zusätzlich die Adhäsion und die transendotheliale Migration der PMN fördern (HUBER et al. 1991).
2.3.2 Das Chemokin Interleukin-8 (IL-8)
Unter Zuhilfenahme verschiedener in- vitro-Detektionssysteme wurden viele Untersuchungen hinsichtlich des Migrationsverhaltens von PMN auf unterschiedlichste Substanzen durchgeführt. Als ein sehr potentes und definiertes Chemoattraktivum für equine PMN hat sich das Zytokin Interleukin-8 (IL-8) erwiesen (ENGELKE 2000). Interleukin 8 ist unter dem Synonym Neutrophilen Attraktives/Aktivierendes Protein 1 (NAP-1), Neutrophile Aktivierender Faktor (NAF), „Granulocyte chemotactic protein“ (GCP), „Leucocyte adhesion inhibitor“ (LAI), „Monocyte derived neutrophil activating peptide“ (MONAP), „monocyte
derived neutrophil chemotactic factor“ (MDNCF) u.a.m. bekannt (GILLI 1999). Anhand dieser Umschreibungen wird die bedeutende Eigenschaft des IL-8 deutlich, nämlich die Aktivierung von PMN zur Migration. Seine Spezifität für PMN wird aus der IL-8- Rezeptordichte auf der Oberfläche verschiedener Leukozytensubpopulationen ersichtlich. Bei T-Lymphozyten beträgt sie etwa 300/Zelle, bei Neutrophilen dagegen ca. 20.000/Zelle (BAGGIOLINI und CLARK-LEWIS 1992).
Das Interleukin-8 wird von vielen Zellen gebildet, hierzu gehören Endothel- und Epithelzellen, Lymphozyten, Monozyten, Fibroblasten und neutrophile Granulozyten (KUNKEL et al. 1991, BURMESTER und PEZZUTTO 1998). Sowohl durch chemo taktisch induzierte Migration (SIDDIQUI et al. 1999) als auch durch phagozytotische Aktivität kann die Freisetzung des IL-8 von den PMN noch gesteigert werden (BAZZONI et al. 1991).
Es wurden zwei IL-8-Varianten gefunden, wobei die eine aus 72 Aminosäuren besteht und in erster Linie von Monozyten und Lymphozyten produziert wird, während die andere aus 77 Aminosäuren aufgebaut ist und u.a. von Endothelzellen sezerniert wird. Durch Abkopplung von fünf Aminosäuren kann diese zweite Form zur biologisch aktiven 72-Aminosäuren- Variante umgesetzt werden. Es bewirkt bei PMN eine Migrationsaktivierung und eine Voraktivierung zur Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten („priming“). Außerdem fördert es die Freisetztung lysosomaler Enzyme (SCHROEDER et al. 1987) und führt zu einer Hochregulierung des Makrophagen Rezeptors 1 (Mac-1, CD11b/18) (ROBERTS et al. 1993).
Sowohl beim Menschen als auch bei anderen Spezies konnte die chemoattraktive Wirkung des IL-8 nachgewiesen werden. In einer breit angelegten Studie konnten SUGAWARA et al.
(1995) zeigen, dass humanes IL-8 Effekte auf PMN von Ziege, Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen, Huhn, Hund und Affe hat. Nach intradermaler Applikation beobachteten ZWAHLEN et al. (1994) einen PMN-Influx in das Gewebe beim Hund. Beim Rind bewirkt humanes IL-8 eine transendotheliale in-vitro-Migration (BOCHSLER et al. 1994). Dagegen konnte eine in- vivo-Applikation von IL-8 in die Zitzenzisterne des Euters weder eine Immigration von PMN in das Lumen der Zitze noch in die Zitzenwand induzieren (PERSSON et al. 1993). Eine starke chemoattraktive Wirkung des Zytokins auf equine PMN konnte sowohl in vivo nach Applikation des humanen IL-8 in den Uterus der Stute als auch in vitro mit Hilfe einer Transmigrationkammer und aus dem Blut separierten equinen PMN von ENGELKE (2000) nachgewiesen werden.
2.3.3 PMN beeinflussende Faktoren
Bereits eine Stunde nach der Belegung einer Stute (KOTILAINEN et al. 1994, KATILA 1995) oder im Anschluß an eine experimentelle Infektion (WATSON et al. 1987) sind die ersten PMN im Uteruslumen zu finden. Die Antwort der PMN auf chemotaktische Signale wie Bakterien, Sperma und/oder Samenverdünner ist ein massiver Influx in das Uteruslumen (PYCOCK und ALLEN 1988). Bakterien, Samenzellen und Zelltrümmer werden von den aktivierten Uterus-PMN phagozytiert. Dies erfolgt in Anwesenheit von Opsoninen, insbesondere den Immunglobulinen, aber auch dem Komplementfaktoren C3b, iC3b, C4b (TROEDSSON et al. 1993). Für eine anhaltende Rekrutierung der PMN aus dem Blut sorgen neben den Spaltprodukten der Komplementkaskade (C5a und C3a), auch Prostaglandin F2a
(PGF2a) und Prostaglandin E (PGE), sowie Leukotriene B4 (LTB4) (LEES et al. 1986, WATSON et al. 1987, PYCOCK und ALLEN 1990).
Bei vergleichenden Untersuchungen wurden PMN aus dem Uterus „empfänglicher“ und
„resistenter“ Stuten mit Grad I- und Grad-III-kategorisiertem Endometrium gewonnen. Bei dieser histologischen Endometriumskategorisierung zeigten die Uterus-PMN der Grad-III- Stuten eine erheblich verminderte Phagozytoseaktivität von opsonisierten Candida- Blastosporen (CHEUNG et al. 1985, WATSON et al. 1987). Hinsichtlich der PMN- Funktionalität erhielten LIU et al. (1985) ähnliche Resultate, da sie bei den Uterus-PMN der Grad-III-Stuten eine verringerte Wanderungsbereitschaft und Zellelastizität (als Maß für die Phagozytosefähigkeit) feststellten. Dagege n beobachtete ENGELKE (2000), dass degenerative endometriale Veränderungen nicht per se die Funktionalität von uterinen PMN reduzieren. Bei Experimenten, die mit zellfreien Substanzen, z.B. mit einem Filtrat einer Sc.
zooepidemicus-Suspension, durchgeführt wurden, wiesen die PMN der „empfänglichen“
Stuten dagegen eine höhere Aktivität als die der sogenannten „resistenten“ Stuten auf. Auch eine von HANSEN und ASBURY (1987) durchgeführte Studie bescheinigte den
„empfänglichen“ Stuten eine bessere in- vitro-Funktionalität. Ein Einfluss des Zyklusstandes konnte von diesen Autoren nicht beobachtet werden. BLUE et al. (1984) und STRZEMIENSKI et al. (1984) konnten ebenfalls keine unterschiedlichen Ergebnisse bezüglich der in- vivo-Migration nach Inkubation von PMN im Uterussekret aus Östrus oder Diöstrus finden. Für Untersuchungen hinsichtlich eines möglichen hormonellen Einflusses auf
PMN-Eigenschaften wurden die Versuchstuten jeweils medikamentös unter Östrogen- bzw.
Progesteroneinfluss gesetzt. Auch hier wurden verschiedene Resultate erzielt. WASHBURN et al. (1982) bescheinigten den Blut-PMN von unter Östrogeneinfluss stehenden Stuten eine höhere Phagozytoskapazität als denjenigen von unter Progesteroneinfluss stehenden Stuten.
Eine Veränderung der Migrationseigenschaften von Uterus-PMN, die von Stuten gewonnen wurden, welche entweder mit Progesteron oder Östrogen behandelt worden waren, konnte WATSON (1988) nicht feststellen.
Die zahlreichen Studien zu den Eigenschaften uteriner PMN von „resistenten“ und
„empfänglichen“ Stuten unterscheiden sich meist im Versuchsdesign, in den eingesetzten Tiergruppen und den verwendeten chemotaktischen Substanzen für die Stimulation der uterinen PMN-Immigration, so dass die erzielten Resultate teilweise gegensätzlich und untereinander schwer vergleichbar sind. Zukünftige Forschungsarbeiten sollten besonderen Wert auf die Definition der Versuchsbedingungen legen. In der vorliegenden Dissertation soll der Einfluss wiederholter Inseminationen auf den uterinen PMN-Influx geprüft werden. Dabei sollen die zeitliche Dynamik der Einwanderung der neutrophilen Granulozyten, ihre Funktionalität und modulierende Faktoren untersucht werden.
3 Material und Methoden
3.1 Geräte und Materialien
3.1.1 Geräte, Klinik- und Laborbedarf Geräte
Aqua dest.-Aufbereitungssystem „SG Umkehr- Osmoseanlage Typ RO 50/14 SMB TypI“
Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG
Reinstwasser System Typ SG –RS 90-4 UF“
Autoklav Typ GE406
Druckbehälter zur Sterilfiltration
Durchflusszytometer mit Computereinheit
“Fluorescence Activated Cell Analyser (FACScanR )“
Fa. Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel
Fa. Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel
Fa. Getinge AB, Getinge/Schweden Fa. Alloy Products, Wisconsin/USA Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
Eismaschine Typ UBE 30-10 Fa. Ziegra, Isernhagen Fluoreszenzmikroskop mit Ploemiluminator und
Phasenkontrasteinrichtung
Fa. Zeiss, Oberkochen Heißluftsterilisator Typ ST5050
Laborfeinwaage B6
Fa. Heraeus, Hanau
Fa. Mettler, Zürich/Schweiz
Laborwaage BL310 Fa. Sartorius GmbH, Göttingen
Magnetrührer mit Heizplatte IKAMAG®RH Fa. Janke u. Kunkel, Staufen Pipette, einstellbar“ Transferpette®“ (2-20µl)
Pipetten, einstellbar „pipetman“ (100-1000 µl, 20- 200µl, 10-100 µl, 1-20 µl)
Röhrchen-Schüttler Typ Reamix
Rüttler für Mikrotiterplatten AM69 Microshaker Sterile Werkbank, Heraus LaminAir® HLB 2472 Kühlzentrifuge Varifuge K Typ 4500
Zentrifuge Megafuge 1.0R
Tischzentrifuge mit Winkelrotor für Reaktionsgefäße 1,5 ml
Fa. Brandt, Wertheim
Fa. Gilson, Villers Le Bel/Frankreich Fa. ASID, Unterschleißheim
Fa. Dynatech, Zug/Schweitz Fa. Heraus-Christ, Hanau Fa. Heraeus-Christ, Osterode Fa. Heraeus-Christ, Osterode Fa. Wifug, Bradford/England Plattenzentrifuge mit Plattenrotor, Typ UJ II KS Fa. Heraeus-Christ, Osterode Hettich Zentrifuge Rotina 48 Fa. Hettich, Tuttlingen
Bunsenbrenner mit automatischer Zündung gasprofi 1
Fa. Wartewig, Göttingen CO2-Brutschrank Typ BK 5060E Fa. Heraeus-Christ, Hanau Feuchtkammer (Plastikbox mit Gittereinsatz) Einzelhandel
Pinzette, gebogen, anatomisch Fa. Eickemeyer (170710), Tuttlingen PC-MB 25 x 80 mm, 3 µm Porengröße, PVP
Membranen
Fa. Cytogen (155812), Ober-Mörlen Transwell Membraneinsätze (permeabel)
Nr. 3402, 3 µm Porengröße
Fa. Costar GmbH, Bodenheim Zellzählkammer nach BÜRKER
10-Well- Transmigrationskammer 400 µl/285 µl
Filter 0,45 µm „Sartobran-PH Capsule Sartobran® Filter 0,2 µm „Sartobran-PH Capsule Sartobran®
Fa. Brandt, Wertheim
Fa. Cytogen (442000), Ober-Mörlen Fa. Sartorius, Göttingen
Fa. Sartorius, Göttingen
Klinikbedarf
Cervix- Zange nach Albrechtsen, 54 cm Künstliche Vagina, Modell Hannover Einwegtupferentnahmegeräte
Ultraschallgerät Scanner 100 LC Ultraschallgerät Falco 100
Fa. Eikemeyer, Tuttlingen Bertram
Fa. Albrecht, Aulendorf Fa. Pie Medical
Fa. Pie Medical
Uterusbiopsiegerät nach Roberts, 65 cm Fa. Eikemeyer, Tuttlingen Scheidenspekulum nach Polansky, 25 cm
Embryotransferkatheter „Neustadt/Aisch“
Fa. Eikemeyer, Tuttlingen
Fa. W. Wörrlein, Medizintechnik, Ansbach Untersuchungshandschuhe, Der supersensitive, 90
cm, transparent,
Untersuchungsgel Bovi.VetGel
Kanüle Neolus, 1,2 x 40 mm; 0,9 x 40 mm
Fa. Müller
Tierärztebedarf J. Lehneke, Schortens Fa. Terumo, Leuven/Belgien
S-Monovette®, 10 ml, Lithium-Heparin Kanüle für S-Monovette
Fa. Sarstedt, Nümbrecht Fa. Sarstedt, Nümbrecht Spritzen, 2, 5, 10 und 20 ml Fa. Codan, Leusahn
Spritzen, 50 ml mit 60-ml-Skalierung Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Vacutainer® Brand Luer Adapters
Vacutainer® Systems, Halter
Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
Laborbedarf
Eppendorf- Reaktionsgefäß, 1,5 ml Eppendorf- Reaktionsgefäß, 0,5 ml
Einmal-Pasteurpipetten aus Polyethylen niedriger Dichte
Fa. Greiner (616201), Frickenhausen Fa. Sarstedt (72699), Nümbrecht Fa. Merck (612F1767), Darmstadt Mikrotiterplatten, 96-Loch, Rundboden, steril
Multipette®
Fa. Techno Plastic Products TPP® Fa. Eppendorf, Hamburg
Objektträger, 76 x 26 mm Fa. Heiland, Gallin Laborflaschen mit Gewinde, 100 ml, 500 ml
Papier, saugfähig
Pasteurpipetten, 22,5 cm aus Glas
Pipettenspitzen Plastibrand® 0,5 µl -20 µl Pipettenspitzen, blau und gelb
Fa. VWR international, Hannover Einzelhandel
Fa. Brandt (747720), Wertheim Fa. Brandt (702565), Wertheim
Fa. Sarstedt (70/762002 und 70/760002), Nürnbrecht
Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 ml Fa. Becton Dickinson (352008), Heidelberg Probenröhrchen mit 12 ml Fa. Greiner (191161), Frickenhausen Falcon, 50 ml, Polypropylen
Händedesinfektionsmittel Sterilium
Fa. Corning (430829), New York/USA Fa. Bode Chemie (669), Hamburg
3.1.2 Medikamente, Reagenzien und andere Materialen
Acridinorange Fa. Sigma-Aldrich (A6014), Steinheim
bovines Serum-Albumin, BSA, Fraktion V Fa. PAA (K41-001-100), Linz/Österreich DTAF-Ziegen-Antikörper-anti-Maus-IgG und IgM,
schwere und leichte Ketten
Fa. Dianova (115-015-068), Hamburg Dinolytic®, 5 mg/ml, (Dinopros-Trometamol) Fa. Pharmacia Tiergesundheit, Erlangen Ethanol, absolut Fa. J.T. Baker (8228), Deventer/Holland
Ethidiumbromid Fa. Sigma-Aldrich (E87A51), Steinhe im
Fetales Kälberserum (FCS) Fa. Biochrom (SO 113/431B), Berlin Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Fa. Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim Formaldehyd Solotus 35-37% Fa. Caelo, Hilden
Interleukin-8, human, rekombinant (72a.a.) Fa. Pepro Tech (200-08M) , Rocky Hill, NJ/USA
Isopropyl-Alkohol 70 % Tierärztebedarf J. Lehneke, Schortens Kaliumchlorid (KCL), kristallin
Kaliumhydrogencarbonat, reinst (KHCO3)
Fa. Sigma-Aldrich (P-4504), Steinheim Fa. Merck (4852), Darmstadt
Natriumazid, NaN3, 10%ig Fa. Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim Natriumchlorid, NaCl Fa. Roth (9265.2), Karlsruhe
Natriumhydroxyd-Pellets, wasserfrei Fa. Sigma-Aldrich (S-5881), Steinheim Natriumhypochlorit-Lösung 12% Fa. Roth (9062), Karlsruhe
Pansorbin® cells (hitzeinaktivierte Staphylokokken sp.)
Ovogest® 1500 (1500 IE Choriongonadotropin) Paraformaldehyd
Fa. Calbiochem-Novabiochem (507867), Bad Soden/Taunus
Fa. Intervet, Unterschleißheim
Fa. Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim PBS Dulbecco, Instant (9,55 g/l, phosphatgepufferte
Salzlösung)
Fa. Biochrom (L-182-10), Berlin
Percoll® Fa. Amersham Biosciences (17-0891-01), Uppsala/
Schweden
PMA, Phorbol-12-Myristat-13-Acetat Fa. Sigma (P-8139), Deisenhofen Propidiumjodid, PJ
RPMI 1640-Medium (Trockensunbstanz)
Fa. Calbiochem-Novabiochem (537059), Bad Soden/Taunus
Fa. Biochrom KG, Berlin Türk’sche Lösung (Essigsäure-Gentiana-
Violettlösung)
Fa. Merck (1.09277.0500), Darmstadt
3.1.3 Lösungen, Medien und Puffer FITC-Puffer
Na2CO3 NaCl
Aqua tridest.
HCl FITC
1,06 g 0,59 g ad 100 ml ad pH 9,2
15 mg Natriumchloridlösung, 0,9%
NaCl
Aqua tridest.
8,77 g ad 1000 ml
Phosphatpuffer (PBS/ 2fach PBS) NaCl
Na2HPO4 x H2O KH2PO4
KCL
Aqua tridest.
8 g /16 g 1,24 g /2,48 g 0,2 g /0,4 g 0,2 g /0,4 g ad 1000 ml /1000 ml MIF-Puffer (PBS mit 1% BSA und 0,01%
NaN3) BSA NaN3
PBS
1,0 0,01 g ad 100 ml
Medium für Zellkulturarbeiten
Zellkulturmedium R0+ R0- (RPMI 1640 mit Hepes-Puffer) mit Zusatz von Penicillin (10 IU/ml) Streptomycin (100 µg/ml)
3.1.4 Materialien für die Zählung, Differenzierung, Vitalitätsbestimmung und Separation von Leukozyten und Spermien
WRIGHT-Lösung
Die Anfärbung eines Blutausstriches zur mikroskopischen Erstellung eines Differentialblutbildes erfolgte mit WRIGHT-Lösung (s. 3.1.2). Sie wurde in der im Handel erhältlichen Ausgangslösung unverdünnt eingesetzt (s. 3.2.3).
TÜRK’sche -Lösung
Zur Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im Blut (s. 3.2.3) wurde handelsübliche unverdünnte TÜRK’sche-Lösung (Gentianaviolett 20 mg, Essigsäure 6,5 ml, Aqua dest. ad 100 ml, s. 3.1.2) eingesetzt.
Acridinorange-Ethidiumbro mid
Um die Anzahl vitaler Zellen mikroskopisch zu bestimmen, wurde die bei 4°C maximal 6 Monate haltbare Lösung eingesetzt. Die Gebrauchslösung enthielt 2,5 mg Acridinorange und 2,5 mg Ethidiumbromid, die in 1000 ml PBS mit 0,02% Natriumazid (s. 3.1.2) gelöst wurden.
Percoll
Percoll ist ein synthetisches Sol, welches aus Silikatpartikeln besteht, die mit Polyvinyl- Pyrrolidon beschichtet sind. Bei 20°C hat es ein spezifisches Gewicht von 1,130 g/ml. In einen isotonen Zustand wurde das Percoll durch Zusatz von 870 mg kristallinem NaCl zu 100 ml Percoll gebracht. Mit steriler 0,9%iger NaCl-Lösung (s. 3.2.4.3) wurden das 100%ige Percoll zu 78%ige und eine 55%ige Percoll- Lösung verdünnt.
3.1.5 Induktoren der Leukozyteneinwanderung in den Uterus
Interleukin-8 ist ein physiologisch im weiblichen Endometrium synthetisiertes Zytokin. Als Chemokin für neutrophile Granulozyten, deren Einwanderung in den equinen Uterus stimuliert wurde, ist in dieser Arbeit rekombinantes humanes, lyophilisiertes Interleukin-8 (rhIL-8, 8,4 kDa, 72 Aminosäuren) eingesetzt worden.
Das lyophilisierte Cytokin wurde mit 0,1 % BSA in PBS rekonstituiert und auf 1 µg/ml verdünnt und in aliquoten Teilen zu 1 ml bei -20°C gelagert. Vor der Anwendung am Tier wurde eine Konzentration von 25 ng rhIL-8/ml Trägermedium (PBS) gewählt. Dafür wurden die benötigten Aliquots unmittelbar vor der Applikation aufgetaut.
Den grössten Anteil an den verschiedenen Arten der Belegung einer Stute hat die instrumentelle Samenübertragung mit Frischsamen. Dieser enthält zu unterschiedlich hohen Anteilen Eigelb, Magermilchpulver, Glucose, Ampuwa und ein Antibiotikum. Frischsamen ist in seiner Gesamtheit als Chemoattraktivum für equine PMN vielfach beschrieben (s.
2.1.5).
