Angeborene Immunität im bovinen Uterus:
Phänotypische und funktionelle Eigenschaften uteriner monozytärer Zellen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Janine Maaß aus Kühlungsborn
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth Arbeitsgruppe Immunologie
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. H.-J. Schuberth
2. Gutachter: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung: 24. 05. 2013
Gefördert durch Sachmittel im Rahmen des BMBF-Vorhabens 'EMIDA-Era-Net:
iPUD – integrierter systemischer Ansatz zur Verhinderung uteriner Erkrankungen beim Rind'.
FKZ 0315861.
Wer mit Ungeheuern kämpft, mag zusehʼn, dass er nicht dabei zum Ungeheuer wird. Und wenn du lange in einen Abgrund blickst, blickt der Abgrund auch in dich hinein.
Friedrich Nietzsche
In tiefer Zuneigung
meinen geliebten Freunden und meinem Hund Norah gewidmet.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Zielsetzung ... 9
2 Literaturübersicht ... 11
2.1 Metritis und Endometritis des Rindes ... 11
2.2 Immunzellen im bovinen Uterus ... 14
2.3 Relevante Antikörper zum Nachweis monozytärer Zellen im bovinen Uterusgewebe15 2.3.1 AM-3K ... 15
2.3.2 MAC387 ... 16
2.4 Immunabwehr im bovinen Uterus ... 17
2.5 Expression immunrelevanter Gene in der bovinen Gebärmutter ... 19
2.6 Phänotypische Eigenschaften mononukleärer Immunzellen des Blutes ... 20
2.6.1 Lymphoide Zellen ... 20
2.6.2 Monozytäre Zellen ... 22
2.7 Chemokine und Chemokinrezeptoren von Monozyten ... 23
2.7.1 CCL2 ... 25
2.7.2 CCL4 ... 26
2.7.3 CCL5 ... 26
2.8 Makrophagen und Fibrozyten monozytärer Abstammung ... 27
2.8.1 Zirkulierende Fibrozyten ... 27
2.8.2 Differenzierung aus peripheren Blutmonozyten ... 28
2.8.3 Phänotypische und funktionelle Eigenschaften ... 29
2.8.4 Immunstimulierende Eigenschaften und Expression immunrelevanter Gene ... 30
2.8.5 Bedeutung während der Wundheilung und im Krankheitsgeschehen ... 32
3 Material und Methoden... 34
3.1 Versuchstiere ... 34
3.1.1 Gesunde, mittlaktierende Kühe ... 34
3.1.2 Gesunde, frühträchtige Färsen ... 34
3.1.3 Gesunde Kühe im peripartalen Zeitraum ... 35
3.1.4 Kühe mit postpartaler klinischer Endometritis/Metritis ... 35
3.1.5 Kühe mit subklinischer Endometritis ... 35
3.1.6 Probennahme ... 36
3.2 Fixierung und Einbettung von Gewebeproben ... 38
3.2.1 Fixierung ... 38
3.2.2 Zuschneiden der Gewebeteile ... 38
3.2.3 Einbetten in Paraffin ... 38
3.3 Immunhistochemische Nachweise ... 39
3.4 Dokumentation und Auswertung der immunhistochemischen Befunde ... 42
3.5 Gewinnung einzelner Leukozytenpopulationen des Blutes ... 43
3.5.1 Gewinnung von mononukleären Zellen ... 44
3.5.2 Gewinnung von Monozyten ... 44
3.5.3 Phänotypische Charakterisierung boviner mononuklärer Zellen und deren Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie ... 45
3.6 Generierung von Makrophagen und Fibrozyten aus Blutmonozyten in vitro ... 52
3.6.1 Darstellung der Morphologie und Kernmorphologie von Fibrozyten ... 53
3.6.2 LPS-Stimulation von Makrophagen und Fibrozyten in vitro ... 54
3.7 Molekularbiologische Verfahren ... 54
3.7.1 Aufbereitung von RNA aus bovinem uterinem Gewebe für die real time PCR ... 54
3.7.2 Aufbereitung von mRNA aus bovinen Fibrozyten und Makrophagen für die real time PCR ... 55
3.7.3 Qualitative und quantitative Analyse der RNA mit dem Experion Automated Electrophoresis System ... 56
3.7.4 Synthese von cDNA durch Reverse Transkription ... 58
3.7.5 Quantitative Real-Time PCR (qrtPCR) ... 59
3.8 Statistische Auswertung ... 63
4 Ergebnisse ... 65
4.1 Analyse von immunhistochemisch angefärbten monozytären Immunzellen im Uterusgewebe ... 65
4.1.1 CD163+ Zellen im Uterus von Tieren mit subklinischer Endometritis ... 65
4.1.2 CD163+ Zellen im Uterus von Tieren ohne subklinische Endometritis ... 66
4.1.3 S100A8/A9+ Zellen im Uterus von Tieren mit subklinischer Endometritis ... 67
4.1.4 S100A8/A9+ Zellen im Uterus von Tieren ohne subklinische Endometritis ... 68
4.1.5 S100A8/A9+ Zellen im Uterus von Tieren mit klinischer Metritis ... 69
4.1.6 S100A8/A9+ Zellen im Uterus von mittlaktierenden Tieren ... 70
4.2 Phänotypische Charakterisierung boviner mononukleärer Zellen und deren
Subpopulationen mittels Membranimmunfluoreszenz ... 71 4.2.1 Tiere mit subklinischer Endometritis wiesen eine signifikant erhöhte Anzahl
lymphoider Zellen im Blut auf ... 71 4.2.2 Monozytäre Zellen des Blutes von Kühen mit subklinischer Endometritis waren in
ihrer Häufigkeit signifikant erhöht ... 73 4.2.3 Unterschiede zwischen fruchtbaren Tieren und Tieren, die wiederholt nicht
trächtig geworden sind ... 74 4.3 Expression ausgewählter Gene im bovinen Uterusgewebe ... 77 4.4 Analyse der In-vitro-Differenzierung boviner Fibrozyten und Makrophagen ... 78
4.4.1 UXT eignete sich als Referenzgen bei der Genexpressionsanalyse boviner MdF und MdM ... 79 4.4.2 Die LPS-induzierte Expression ausgewählter Gene unterschied sich zwischen
MdF und MdM ... 80 4.4.3 Das Primen mit IL-4 und IL-13 oder IFN-γ beeinflusste die Basisexpression
boviner in SFM oder I10F+ ausdifferenzierter Zellen ... 83 5 Diskussion ... 84
5.1 Immunhistologischer Nachweis verschiedener Makrophagensubtypen in bovinem Uterusgewebe ... 85 5.2 Expression ausgewählter Gene im bovinen Uterusgewebe ... 90 5.3 Phänotypische Charakterisierung boviner mononukleärer Zellen und deren
Subpopulationen mittels Membranimmunfluoreszenz ... 92 5.3.1 Tiere mit subklinischer Endometritis zeigten eine signifikant erhöhte Anzahl
lymphoider Zellen ... 92 5.3.2 Monozytäre Zellen von Kühen mit subklinischer Endometritis sind in ihrer
Häufigkeit signifikant erhöht ... 94 5.3.3 Unterschiede zwischen fruchtbaren Tieren und Tieren, die wiederholt nicht
trächtig geworden sind ... 95 5.4 Analyse der In-vitro-Differenzierung boviner Fibrozyten und Makrophagen ... 96
5.4.1 Die LPS-induzierte Expression ausgewählter Gene unterschied sich zwischen MdF und MdM ... 98 5.4.2 Das Primen mit IL-4 und IL-13 oder IFN-γ beeinflusste die Basisexpression von
ausgewählten Genen in SFM oder I10F+ ausdifferenzierten Zellen ... 100 6 Zusammenfassung ... 103
7 Summary ... 106
8 Literaturverzeichnis ... 109
9 Anhang ... 137
9.1 Geräte ... 137
9.2 Material ... 140
9.2.1 Klinikbedarf ... 140
9.2.2 Laborbedarf ... 141
9.2.3 Reagenzien ... 143
9.2.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ... 147
9.2.5 Genspezifische Primer für die qrtPCR ... 151
9.3 Abbildungsverzeichnis ... 152
9.4 Tabellenverzeichnis ... 154
9.5 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ... 155
9
1 Einleitung und Zielsetzung
Bovine Endometritiden und Metritiden gehören zu den häufigsten uterinen Erkrankungen des Rindes und besitzen weltweit eine große wirtschaftliche Bedeutung (SHELDON et al. 2006).
Während der Trächtigkeit ist die Zervix geschlossen und das Uteruslumen gewöhnlich steril.
Nach der Geburt können Keime durch die geöffnete Zervix eindringen und der Uterus ist fast immer durch ein breites Keimspektrum kontaminiert (SHELDON et al. 2009a). In der Regel existiert ein Gleichgewicht zwischen pathogenen Erregern und der Immunabwehr des Wirtes.
Wird dieses Gleichgewicht gestört, kann es zur Ausbildung einer klinischen Endometritis oder Metritis kommen, aus welcher eine chronische, subklinische Endometritis entstehen kann. Infektionen des Uterus haben verzögerte ovarielle Zyklen, verlängerte Lutealphasen sowie verminderte Fruchtbarkeitsraten zur Folge (SHELDON et al. 2009b). Weitere Folgen klinischer Endometritiden und Metritiden sind Schmerzen und Leiden der Tiere bis hin zum Tod durch Toxämie.
Die Behandlung stützt sich derzeit fast ausschließlich auf die Verwendung von Antibiotika und Hormonen. Für eine immunmodulierende Prophylaxe stehen keine geeigneten Strategien zur Verfügung. Neuere Überlegungen, basierend auf vertieften Erkenntnissen über die Bedeutung des angeborenen Immunsystems, zielen auf eine Modulation peripherer und residenter monozytärer Immunzellen ab, denen für die Entstehung und für den Verlauf solcher Infektionserkrankungen eine zentrale Rolle zugeschrieben wird. Monozyten des peripheren Blutes, die rasch nach Erregerkontakt in das Gewebe einwandern, differenzieren dort zu verschiedenen Effektorzellen aus, über deren Funktion beim Rind sehr wenig bekannt ist. Die sich aus den Monozyten differenzierenden Makrophagen stellen eine phänotypisch und funktionell sehr heterogene Population dar. Unter welchen Bedingungen sie, ausgehend von Monozyten, zu eher inflammatorischen Makrophagen oder eher zu regulatorischen Zellen und Wundheilungszellen ausdifferenzieren, ist nur zum Teil bekannt und für das Rind, zumal für den Uterus, nahezu unerforscht.
Es war Ziel in der vorliegenden Arbeit über immunhistochemische Analysen von Uterus- gewebeschnitten verschiedene Makrophagensubtypen in ihrer Detaillokalisation bei uterusgesunden, subklinisch und klinisch erkrankten Kühen im Peripartum nachzuweisen.
10
Über den Vergleich mit mittlaktierenden Kühen sollten Hinweise auf den Einfluss unterschiedlicher metabolischer und hormoneller Zustände auf die Verteilung dieser Zellen im uterinen Gewebe gefunden werden. Das mRNA-Expressionsprofil ausgewählter Chemokine, Rezeptoren und anderer Entzündungsmediatoren im Uterusgewebe sollte Aufschluss darüber geben, ob sich unterschiedliche Häufigkeiten von Makrophagensubtypen in einem veränderten Genexpressionsprofil widerspiegeln.
Da sich residente Makrophagenpopulationen aus dem Pool zirkulierender Monozyten speisen, sollten mononukleäre Zellpopulationen im peripheren Blut von uterusgesunden und subklinisch erkrankten Kühen näher charakterisiert werden. Ein besonderes Augenmerk sollte auf monozytären Subpopulationen liegen.
Neben Makrophagen können aus immigrierenden Monozyten auch spindelförmige sog.
monocyte-derived fibrocytes (MdF) entstehen. In-vitro-Differenzierungsstudien hatten zum Ziel, die Bedingungen, unter denen dies erfolgt, näher zu analysieren und das mRNA Expressionsprofil ausgewählter, entzündungsrelevanter Gene mit dem zu vergleichen, welches klassische, in vitro generierte Makrophagen nach Stimulation mit Erregerprodukten zeigen.
11
2 Literaturübersicht
2.1 Metritis und Endometritis des Rindes
Das Gebärmutterlumen ist nach der Kalbung oft durch eine Vielzahl verschiedener unspezifischer Keime aus der Umgebung kontaminiert. Jedoch führt nicht jede Kontamination zu einer Infektion des Uterus.
Grundsätzlich wird zwischen Kontamination und Infektion unterschieden. Bei einer ungestörten Immunlage des Tieres kommt es in der Regel zu einem schnellen Einstrom neutrophiler Granulozyten, welche pathogene Organismen zügig eliminieren können.
Allerdings ist die Funktion der neutrophilen Granulozyten im peripartalen Zeitraum häufig gestört (ZERBE et al. 2000), was die Ausbildung einer uterinen Infektion begünstigt. Kühe mit einer verminderten Neutrophilen-Funktion sind deutlich anfälliger für schwere uterine Infektionen (KIM et al. 2005b). Ovarielle und luteale Hormone, wie Progesteron, sowie metabolische Veränderungen scheinen peripartal die Phagozytoseleistung und die Genexpression von PMN (polymorphkernigen Leukozyten) zu beeinträchtigen (MADSEN et al. 2002; BURVENICH et al. 2007). So wurde eine verminderte PMN-Funktion bei hohen peripartalen 17β-Östradiol-Konzentrationen beschrieben (KEHRLI et al. 1989; CAI et al.
1994; DA SILVA et al. 1998; HOEBEN et al. 2000; WATSON u. GAMETCHU 2001;
LAMOTE et al. 2006). Andere Autoren beobachteten, dass die Funktion von uterinen PMN bei hohen Östrogen-Konzentrationen unbeeinflusst bleibt (CHACIN et al. 1990). Einige In- vitro-Studien lassen jedoch vermuten, dass Chemotaxis, Phagozytose und der Respiratory Burst von PMN durch 17β-Östradiol beeinflusst werden (HOEDEMAKER et al. 1992;
LAMOTE et al. 2004). Weiterhin wird davon ausgegangen, dass hohe Progesteron- Konzentrationen bakterielle Infektionen der Gebärmutter begünstigen. So reagierten Tiere mit hohen Progesteron-Gehalten anfälliger nach experimentellen Infektionen mit Escherichia coli (E. coli) und Trueperella pyogenes (T. pyogenes) (DEL VECCHIO et al. 1994) und weniger anfällig bei niedrigen Progesteron-Spiegeln (und hohen Östrogen-Konzentrationen) (SEALS et al. 2003). Progesteron vermittelt einen negativen Effekt auf die uterine Immunabwehr, da es die Synthese von Prostaglandinen und Leukotrienen hemmt (LEWIS 2004; HERATH et al.
2006). Weiterhin hemmt es die Lymphozyten-Proliferation (SEGERSON u. GUNSETT 1993;
LEWIS 2004), vermindert die Aktivität proinflammatorischer Moleküle und fördert die
12
Synthese von Prostaglandin E (PGE) (SLAMA et al. 1991; SZEKERES-BARTHO et al.
2001; AROSH et al. 2002; SEALS et al. 2002).
Auch die beteiligten Erreger einer Infektion können die Phagozytosefähigkeit von Zellen negativ beeinflussen. So hemmt Fusobakterium necrophorum (F. necrophorum) die Phagozytose durch PMN, indem es ein spezielles Leukotoxin produziert (ROBERTS 1967;
SHELDON 2004). KIM et al. (2005a) stellten fest, dass neutrophile Granulozyten von Tieren mit einer Endometritis signifikant schlechter Bakterien phagozytieren konnten.
Auch spielen bestimmte Risikofaktoren wie Nachgeburtsverhaltung, Dystokie, Zwillingsträchtigkeit oder Totgeburt um den Geburtszeitraum eine Rolle und können das Gleichgewicht zwischen Wirtsimmunität und Pathogenität der Erreger zugunsten der Erreger verschieben (GROHN u. RAJALA-SCHULTZ 2000; KIM u. KANG 2003). Ist dieses der Fall, können pathogene Keime persistieren und Endometritiden verursachen. Durchschnittlich erleiden 20 bis 40 Prozent der Hochleistungsrinder eine akute klinische Metritis innerhalb einer Woche nach der Kalbung. 20 Prozent der Tiere zeigen eine persistierende klinische Endometritis drei Wochen p. p. und etwa 30 Prozent entwickeln eine chronische subklinische Endometritis (MARKUSFELD 1987; BORSBERRY u. DOBSON 1989; OPSOMER et al.
2000; DRILLICH et al. 2001; SHELDON et al. 2006; LINCKE et al. 2007).
Zu den uteruspathogenen Bakterien zählen vor allem T. pyogenes und E. coli, aber auch F.
necrophorum und Prevotella spp. können in diesem Zusammenhang genannt werden (SHELDON et al. 2002; WILLIAMS et al. 2005). E. coli erfüllt dabei gehäuft die Funktion eines Wegbereiters für andere Erreger (DOHMEN et al. 2000; WILLIAMS et al. 2007;
DONOFRIO et al. 2008), indem es die ovarielle Funktion, die Hypophysen-Hypothalamus- Achse, das allgemeine Befinden des Tieres sowie die Uterusgesundheit im Speziellen negativ beeinflusst (WILLIAMS et al. 2007). Eine nachfolgende Infektion mit T. pyogenes führt dann i. d. R. zu schweren Läsionen des uterinen Gewebes (BONNETT et al. 1991). T. pyogenes verfügt über das Cholesterol-abhängige Zytotoxin Pyolysin, welches in der Lage ist an cholesterolreiche Strukturen in der Zellmembran zu binden, dort zu einem Komplex zu aggregieren und eine Pore zu formen. Die betroffene Zelle geht dann aufgrund der veränderten osmotischen Verhältnisse zugrunde (JOST u. BILLINGTON 2005).
13
Es lassen sich sowohl pathologisch als auch klinisch verschiedene Formen uteriner Entzündungen definieren.
Die puerperale Metritis ist eine schwere entzündliche Reaktion nach bakterieller Infektion, bei der alle Schichten des Uterus betroffen sind. Klinisch handelt es sich um eine akute systemische Erkrankung. I. d. R. tritt sie innerhalb von zehn Tagen (bis spätestens 21 Tage) p.
p. auf und führt zu einem übelriechenden, rot-braunen, wässrigen uterinen Ausfluss (SHELDON et al. 2006). Weiterhin tritt Fieber auf sowie in schweren Fällen eine verminderte Milchproduktion, Schwäche, Inappetenz, eine erhöhte Herzfrequenz sowie Dehydration.
Meist findet man einen großen, schlaffen Uterus vor, da die Involution verzögert ist. Einzelne Symptome können fehlen.
Die klinische Endometritis ist definiert als eine auf das Endometrium begrenzte Entzündung des Uterus, wobei die entzündlichen Prozesse nur bis in das Stratum spongiosum der Gebärmutter reichen. Bei der klinischen Endometritis kommt es zum Auftreten von purulentem (>50% Eiter) Ausfluss ab dem 21. Tag post partum (p. p.) oder mukopurulentem (etwa 50% Eiter und 50% Mukus) Ausfluss ab dem 26. Tag p. p. (SHELDON et al. 2006).
Dieses Exsudat kann zur Klassifikation des Schweregrades der Entzündung herangezogen werden und zeigt das Vorhandensein pathogener Erreger wie E. coli oder T. pyogenes an. I. d.
R. tritt diese Form der Erkrankung ab dem 21. Tag p. p. auf (SHELDON et al. 2006). In sehr schweren Fällen kann es zur Ausbildung einer Pyometra kommen. Als Pyometra bezeichnet man eine Ansammlung von eitrigem Material im Uteruslumen bei geschlossener Zervix und persistierendem Corpus luteum.
Die meisten Bakterien können innerhalb der ersten zwei bis vier Wochen nach der Geburt spontan eliminiert werden (ELLIOTT et al. 1968; BRETZLAFF 1987; HUSSAIN 1990).
Geschieht dies nicht, kann sich eine subklinische Endometritis entwickeln. Bei der subklinischen Endometritis fehlt jede klinische Symptomatik. Sie ist gekennzeichnet durch das Persistieren neutrophiler Granulozyten im betroffenen Gewebe. Dabei handelt es sich um eine subklinische Endometritis, sofern sich bei der zytologischen Untersuchung einer endometrialen Probe (beispielsweise einer Cytobrush-Probe) mehr als 18 Prozent neutrophile Granulozyten 20-33 Tage p. p. oder mehr als 10 Prozent neutrophile Granulozyten 34-47 Tage p. p. ermitteln lassen (KASIMANICKAM et al. 2004).
14
Entzündliche Erkrankungen der Gebärmutter nach bakterieller Infektion verursachen oft Störungen der ovariellen und uterinen Funktion, was nicht selten zu einer Sub- oder Infertilität der Tiere führt. Z. B. zeigen Schafe und offenbar auch Rinder ein gehemmtes Wachstum des ersten dominanten Follikels post partum, da LPS die Sekretion von GnRH (gonadotropine releasing hormone) aus dem Hypothalamus und von LH (luteinising hormone) aus der Hypophyse supprimiert (PETER et al. 1989; BATTAGLIA et al. 2000;
KARSCH et al. 2002). Diese hormonelle Veränderung vermindert die Chance einer Ovulation. Weiterhin zeigen erkrankte Tiere verlängerte Lutealphasen durch eine Störung der Luteolyse, da es zur vermehrten endometrialen Sekretion von PGE anstelle des erwünschten Prostaglandin F2α (PGF2α) kommt (HERATH et al. 2009). Außerdem sind die peripheren Plasma-Östradiolkonzentrationen der Tiere erniedrigt (HERATH et al. 2007).
2.2 Immunzellen im bovinen Uterus
Neben physiologischen und anatomischen Barrieren sowie humoralen Faktoren sind verschiedene Entzündungszellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems an der uterinen Immunabwehr beteiligt. Neutrophile Granulozyten werden als die wichtigsten Effektorzellen in der Abwehr bakterieller Infektionen des bovinen Uterus angesehen. Sie werden auf einen chemotaktischen Reiz hin aus dem peripheren Blut ins Gewebe gelockt. Ein wichtiges Chemokin bei der Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten stellt dabei Interleukin 8 (IL-8 oder CXCL8) dar (BAGGIOLINI et al. 1989), welches z. B. von Endothelzellen, Makrophagen und Epithelzellen sezerniert wird. IL-8 vermittelt seine Effekte über Bindung an die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren CXCR1 und CXCR2. Bei der Migration spielen außerdem Adhäsionsmoleküle wie β2-Integrine (z. B. Komplementrezeptor 3) und L-Selektine (z. B. CD62L) eine Rolle. Nach Erreichen des Entzündungsherdes sind PMN dann in der Lage bakterielle Erreger durch Phagozytose, Freisetzung antimikrobieller Substanzen (Degranulation) und Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zu eliminieren.
Einige wesentliche Funktionen der PMN, wie beispielsweise ihre Phagozytoseleistung, unterliegen metabolischen und hormonellen Einflüssen. Während der Trächtigkeit und peripartal kommt es zu enormen Veränderungen in der Stoffwechsellage und im Hormonhaushalt des Tieres. Peripartale hormonelle Veränderungen und Änderungen des
15
Immunstatus konnten bereits mit einer erhöhten Anfälligkeit für Mastitis und anderen Infektionserkrankungen assoziiert werden (CAI et al. 1994; GROHN et al. 1995).
Andere Zellen, die sich um den Geburtszeitraum im uterinen Gewebe befinden sind Lymphozyten, eosinophile Granulozyten, Mastzellen und Makrophagen.
Während der frühen und mittleren Trächtigkeit sind Lymphozyten und Makrophagen im bovinen Uterus zum Schutz des Fetus in ihrer Zahl reduziert (VANDER WIELEN u. KING 1984; HANSEN 1997). In der späten Phase einer Trächtigkeit beschränkt sich ihr Vorkommen ausschließlich auf die interkarunkulären Bereiche. Dies deutet darauf hin, dass manche Immunmechanismen auf diese Gewebeareale begrenzt sind (GOGOLIN-EWENS et al. 1989; LOW et al. 1990; WOODING 1992). Das subepitheliale Stroma enthält im Vergleich zu anderen Regionen des Endometriums oder Myometriums zudem mehr T- Helferzellen (Th-Zellen), B-Zellen und CD14+ Makrophagen (LEUNG et al. 2000).
Eosinophile Granulozyten und Mastzellen unterhalb des Endometriums besitzen Rezeptoren mit einer hohen Affinität für Immunglobulin (Ig) E. Aktivierte Mastzellen können degranulieren und inflammatorische Mediatoren (z. B. Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Histamin, Prostaglandine, Leukotrien B4) freisetzen (MILLER 1996). Auch eosinophile Granulozyten sezernieren inflammatorische Mediatoren, Superoxide, lytische Enzyme und Kallikrein (BONDURANT 1999).
2.3 Relevante Antikörper zum Nachweis monozytärer Zellen im bovinen Uterusgewebe
2.3.1 AM-3K
AM-3K ist ein Antikörper welcher das Molekül CD163 erkennt. CD163 ist ein Hämoglobin Scavenger Rezeptor, welcher Hämoglobin-Haptoglobin-Komplexe bindet und aus dem Blut entfernt. Durch diese Reinigungsfunktion wird dem CD163 eine Rolle in der späten antiinflammatorischen Phase einer Entzündungsreaktion zugesprochen (HOGGER et al.
1998; YAMATE et al. 2000; KRISTIANSEN et al. 2001). Zudem induzieren bestimmte antiinflammatorische Zytokine die Expression von CD163, wohingegen inflammatorische Moleküle wie Interferon-γ (IFN-γ), Lipopolysaccharid (LPS) und TNF-α die CD163- Expression vermindern (BUECHLER et al. 2000). CD163 soll spezifisch nur von Monozyten und Makrophagen exprimiert werden, was für Mensch, Maus, Hund, Rind und Affe gezeigt
16
werden konnte (VAN GORP et al. 2010). Gewebemakrophagen zeigen eine stärkere CD163- Expression als Monozyten. Die Expression scheint demnach mit fortschreitender Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen zuzunehmen (BACKE et al. 1991;
SANCHEZ et al. 1999; CHAMORRO et al. 2004). CD163+ Makrophagen spielen eine Rolle in der späten Phase einer akuten Entzündung, in chronischen Entzündungsgeschehen und bei Wundheilungsprozessen. Frisch eingewanderte, proinflammatorische Gewebemakrophagen sind hingegen CD163-negativ (ZWADLO et al. 1987; VERSCHURE et al. 1989).
2.3.2 MAC387
Der Antikörper MAC387 bindet den Heterokomplex Calprotectin (S100A8/A9), welcher aus den calciumbindenden S100-Proteinen S100A8 und S100A9 zusammengesetzt ist (BRANDTZAEG et al. 1988). Diese beiden Proteine zählen zu den damage-associated molecular patterns (DAMPs) und werden bei zellulärem Stress aus aktivierten oder geschädigten Zellen freigesetzt (ROTH et al. 2003). Vor allem in neutrophilen Granulozyten und Monozyten werden S100A8 und S100A9 intrazellulär exprimiert (ODINK et al. 1987;
LAGASSE u. CLERC 1988; ZWADLO et al. 1988; ROTH et al. 1992) In der akuten entzündlichen Phase geschieht dies aber auch in Keratinozyten und Epithelzellen (FROSCH et al. 2004; ZENZ et al. 2005). Geweberesidente Makrophagen sollen keine S100A8/A9- Expression aufweisen (ROTH et al. 1992). In humanen Monozyten wird die Expression von S100A8/A9 durch proinflammatorische Reize wie IL-1β, TNF-α und LPS induziert (STRIZ u.
TREBICHAVSKY 2004; KIDO et al. 2005). Wird S100A8 und S100A9 freigesetzt, bindet es an Endothelzellen und löst eine proinflammatorische Reaktion aus. Dieses führt dort zu einer gesteigerten Expression von Adhäsionsmolekülen wie vascular endothelial adhesion molecule 1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) und von proinflammatorischen Zytokinen (FOELL et al. 2007). Im Gewebe können zum Zeitpunkt einer akuten entzündlichen Reaktion verstärkt S100 Proteine detektiert werden (ODINK et al.
1987; ZWADLO et al. 1988). Daraus ist zu schließen, dass eine vermehrte S100A8/A9- Expression in Makrophagen unter proinflammatorischen Bedingungen auf das Vorhandensein frisch rekrutierter, Monozyten-ähnlicher Makrophagen hindeutet (STRIZ u.
TREBICHAVSKY 2004). Für die bovine Zitze konnte bereits dargestellt werden, dass in der Fürstenbergʼschen Rosette adulter, eutergesunder, laktierender Rinder subepithelial häufiger
17
MAC387+ Makrophagen vorkommen, während perivaskulär verstärkt AM-3K+
Makrophagen nachzuweisen sind (DUEVEL 2010).
2.4 Immunabwehr im bovinen Uterus
Zum Zeitpunkt der Trächtigkeit ist es erforderlich das Immunsystem des Muttertieres zu modifizieren, um das Überleben des semi-allogenen Fetus zu sichern. Zum einen werden Teile des Immunsystems gehemmt. Es kommt beispielsweise zur Dominanz einer Th2- Antwort, welche im Vergleich zu einer Th1-Antwort einen geringeren Schutz gegen eindringende pathogene Erreger bietet. Zum anderen ist es aber auch notwendig bestimmte Immunmechanismen zu fördern, ohne die eine erfolgreiche Trächtigkeit nicht stattfinden kann. Dazu gehört z. B. das Vorhandensein spezialisierter uteriner Natürlicher Killerzellen (NK Zellen).
Während der Gravidität stellt dieser veränderte Immunstatus kein Problem dar, denn der Gebärmutterhals des Tieres ist fest verschlossen und Erreger aus der Umwelt sind nicht in der Lage in den Uterus zu gelangen. Nach der Geburt aber ist die Zervix geöffnet und ein breites Spektrum an Keimen kann die Gebärmutter kontaminieren (SHELDON 2004). Besteht zu diesem Zeitpunkt weiterhin eine Immunsituation, welche zwar während der Trächtigkeit erforderlich war, post partum aber nur einen ungenügenden Schutz gegen Krankheitserreger bietet, können pathogene Erreger leichter eine Infektionserkrankung des uterinen Gewebes hervorrufen. Peripartal kommen im Vergleich zu anderen Zeitpunkten innerhalb des Sexualzyklus der Kuh die meisten uterinen Infektionen vor (BORSBERRY u. DOBSON 1989; REGASSA u. NOAKES 1999; WAGTER et al. 2000; SHELDON et al. 2002).
Eine besondere Rolle, vor allem in der frühen Phase einer Infektion, kommt dem angeborenen Immunsystem zu. Dazu zählen sowohl physiologische und anatomische Barrieren wie die Kollagenringe der Zervix und der cerviko-vaginale Mukus als auch zelluläre und lösliche Bestandteile des Immunsystems. Besonders die Phagozytose von Mikroorganismen durch professionelle Phagozyten wie PMN, Blutmonozyten und Makrophagen spielt eine große Rolle bei der initialen Abwehr uteriner Infektionen (STOSSEL 1975). Die Phagozytosefähigkeit kann dabei durch Komplement und Antikörper verbessert werden. Aber auch andere Zellen wie eosinophile Granulozyten und Mastzellen können peripartal im uterinen Gewebe detektiert werden. Mastzellen gelten als wichtige Sensor- und Effektorzellen
18
in der Abwehr bakterieller Infektionen. Welche Rolle sie bei einer peripartalen bakteriellen Kontamination der Gebärmutter spielen, ist jedoch noch weitestgehend unbekannt.
Bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen im bovinen Uterus haben zudem humorale Faktoren des angeborenen Immunsystems wie antimikrobielle Peptide oder Akute Phase Proteine eine Bedeutung. Unter den antimikrobiellen Peptiden ist hier vor allem die Gruppe der Defensine zu nennen. Im uterinen Gewebe von Rindern werden das linguale antimikrobielle Peptid (LAP), das tracheale antimikrobielle Peptid (TAP), bovine neutrophile β-Defensine (BNBD4, DEFB5) sowie bovine β-Defensine (BBD19, BBD123 und BBD124) exprimiert (DONOFRIO u. VAN SANTEN 2001). Auch Mucin 1 (MUC1) nimmt an der Abwehr peripartaler Infektionen teil (BRAYMAN et al. 2004).
Akute Phase Proteine werden direkt nach der Geburt, nach einem Gewebeschaden oder bei einer Entzündung in den Hepatozyten der Leber produziert (BAUMANN u. GAULDIE 1994). Diese Produktion wird durch Freisetzung proinflammatorischer Zytokine nach Erregerkontakt induziert. Die peripheren Plasmakonzentrationen der Akute Phase Proteine sind nach der Geburt bei Rindern erhöht, erreichen aber nach etwa zwei Wochen wieder ein basales Level (REGASSA u. NOAKES 1999; SHELDON et al. 2001). Akute Phase Proteine fördern nach einem Entzündungsprozess die Heilung des Gewebes (WILLIAMS et al. 2005).
In vitro konnten keine Akute Phase Proteine in Zellen des bovinen Endometriums nachgewiesen werden (DAVIES et al. 2008).
Auch das Komplementsystem spielt bei der bovinen Immunantwort eine Rolle. Es gelangt über Hämorrhagien oder vermehrt durchlässige Gefäße in den Uterus und kann über Bildung des Membran-attackierenden Komplexes (MAK) Bakterien lysieren. Endometriale Zellen sind vor der Lyse durch Expression eines membrangebundenen Komplement-regulierenden Proteins geschützt (MCLAUGHLIN et al. 1996; IBORRA et al. 2003).
Die Bedeutung von verschiedenen Ig-Isotypen für die lokale uterine Immunabwehr ist nicht sehr ausführlich erforscht, wird aber als eher gering eingeschätzt. Es ist denkbar, dass Immunglobuline in endometrialen Sekreten als Opsonine die Phagozytoseleistung professioneller Phagozyten verbessern (BLOBEL u. KATSUBE 1964; JAIN et al. 1967;
SCHALM 1968; BUTLER 1983). Je nach Lokalisation im Genitaltrakt scheinen außerdem unterschiedliche Ig-Isotypen vorzuherrschen. So kommt IgG vermehrt im Uteruslumen vor, während IgA hauptsächlich in der Vagina zu finden ist (CORBEIL et al. 1974; WATSON et
19
al. 1990; MESTECKY et al. 2005). Dabei wird ein Teil des IgG1 im Endometrium über residente Plasmazellen, der andere Teil sowie IgG2 aus dem Blut bereitgestellt (CURTAIN et al. 1971; BUTT et al. 1993).
Peripartal ändert sich die Zusammensetzung der Immunzellen in der Zirkulation.
Möglicherweise hat dies einen Einfluss auf die uterine Immunität. Beispielsweise finden sich während der Mittlaktation 45 Prozent, um den Geburtszeitraum aber nur 20 Prozent T-Zellen im peripheren Blut (SHAFER-WEAVER et al. 1996; SHAFER-WEAVER u. SORDILLO 1997). Außerdem erhöht sich gleichzeitig der Anteil der CD8+ Zellen an der Gesamtzahl der T-Zellen im Vergleich zu den CD4+ Th-Zellen.
2.5 Expression immunrelevanter Gene in der bovinen Gebärmutter
Vom Endometrium nicht tragender, gesunder Tiere werden die Toll-like-Rezeptoren (TLRs) 1 bis 10 exprimiert (DAVIES et al. 2008). Besonders dem Rezeptor-Komplex TLR4/CD14/LY96 kommt bei der Infektion mit E. coli eine wesentliche Bedeutung zu, da er LPS erkennt, welches ein Bestandteil der Zellmembran gramnegativer Bakterien ist. Dieser Rezeptorkomplex kommt sowohl auf endometrialen Epithel- als auch Stromazellen vor. Wird LPS über diesen Rezeptor gebunden, reagieren die beteiligten Zellen des Endometriums mit der Sekretion von PGE, welches nicht nur einen entscheidenden Einfluss auf die Fertilität der Tiere sondern auch auf die Regulation der Entzündungsreaktion hat. Außerdem werden nach der Detektion von Erregerbestandteilen auch proinflammatorische Zytokine wie TNFα, IL-6 und IL-8 freigesetzt. Auch Leukozyten, welche aus der peripheren Blutzirkulation während der Geburt in das Endometrium mobilisiert werden, tragen zur Produktion proinflammatorischer Zytokine bei (SAJI et al. 2000; SHELDON 2004). Diese Zytokine aktivieren und rekrutieren daraufhin weitere Entzündungszellen und sorgen für eine Bereitstellung von Akute Phase Proteinen aus der Leber. IL-6 vermittelt die Reifung und Aktivierung von neutrophilen Granulozyten. Außerdem stimuliert es die Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen sowie von NK-Zellen (ISHIKAWA et al. 2004). Weiterhin wirkt es als Wachstumsfaktor und erhöht die Expression von Oxytozin-Rezeptoren. Hohe Mengen von IL-6 im Uterus sind gehäuft mit einer Endometritis assoziiert, während niedrige Level oft mit einer Nachgeburtsverhaltung einhergehen.
20
Es ist zwar nicht sicher bekannt, ob IL-8 im Uterus infizierter Kühe generiert wird, aber die Zugabe von rekombinantem IL-8 führte zum verstärkten Influx von PMN in die Gebärmutter (ZERBE et al. 2003).
Während der Involution und der damit verbundenen Umstrukturierung von Gewebe werden außerdem Hydroxyprolin- und PGF2α-Metaboliten vermehrt sezerniert (KAIDI et al. 1991).
PGF2α fördert die Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten sowie die Ingestion von Bakterien durch diese Zellen. Es erhöht zudem die uterine Produktion von Leukotrien B4 (LEWIS 2004). Leukotrien B4 stimuliert Chemotaxis, die zufällige Migration und die Antikörper-unabhängige Zell-vermittelte Zytotoxizität (HOEDEMAKER et al. 1992).
Es konnte zudem ein Anstieg von Plasminogen-Aktivatoren bei entzündlichen Prozessen im Uterus gezeigt werden, welcher proportional zu dem Schweregrad der Entzündung ist (MORAITIS et al. 2004). Plasminogen kann durch diese spezifischen Serinproteasen zu Plasmin umgewandelt werden. Plasmin ist wiederum eine Serinprotease und spielt eine Rolle bei der Spaltung von Fibrin (Fibrinolyse).
2.6 Phänotypische Eigenschaften mononukleärer Immunzellen des Blutes
2.6.1 Lymphoide Zellen
Zu den lymphoiden Zellen gehören die B- und T-Lymphozyten sowie die NK-Zellen. B- Zellen exprimieren selektiv den B-Zellrezeptor (membrangebundener Antikörper) (MURPHY 2009). Außerdem exprimieren B-Zellen den CD21-CD19-CD81-Korezeptor-Komplex. CD21 (auch CR2) kann Komplementfaktoren auf einem Antigen binden (COOPER et al. 1990). Als Antigen-präsentierende Zellen exprimieren B-Zellen konstitutiv MHC-Klasse II- (MHC II) Moleküle (MURPHY 2009). Beim Rind ist die MHC II-Expression stärker als auf Monozyten und zirkulierenden, aktivierten T-Zellen (TAYLOR et al. 1993).
Zu den T-Zellen gehören die CD4+ Th-Zellen, die CD8+ zytotoxischen T-Zellen, die regulatorischen T-Zellen (Treg) (CD4+ oder CD8+), die T-Gedächtniszellen, NK-T-Zellen sowie T-Zellen, die statt einem αβ-Rezeptor einen Antigenrezeptor exprimieren, der aus einer Gamma- und einer Delta-Kette besteht (γδ-T-Zellen). Immunhistochemisch konnte gezeigt werden, dass γδ-T-Zellen der einzige Zelltyp im bovinen Organismus sind, welcher das Oberflächenmolekül WC1, dessen Funktion unbekannt ist, exprimiert. WC1+ γδ-T-Zellen
21
fehlt hingegen die Expression von CD2, CD4 und CD8. CD5 exprimieren sie nur geringfügig (CLEVERS et al. 1990). Der T-Zell-Antigenrezeptor von αβ-T-Zellen bildet einen Komplex mit dem Oberflächenmolekül CD3 (KRONENBERG et al. 1986). Reife αβ-T-Zellen exprimieren außerdem das Oberflächen-Glykoprotein CD2 (auch T11), welches eine Rolle in der Signalübertragung (Proliferation, Zytotoxizität) und als Adhäsionsmolekül spielt (SELVARAJ et al. 1987). Bei Antigen-stimulierten Effektor-Th-Zellen unterscheidet man funktionell zwischen Th1-, Th2-, Th9- und Th17-Zellen. Naive T-Zellen können sich unter dem Einfluss von Zytokinen zu unterschiedlichen Th-Zell-Subtypen entwickeln. So induzieren IL-12 und IFN-γ die Differenzierung zu Th1-Zellen, IL-4 und IL-6 dagegen fördern die Differenzierung zu Th2-Zellen. Unterschieden werden die T-Zell-Subtypen anhand eines unterschiedlichen Zytokinmusters, welches sie exprimieren. Th1-Zellen sezernieren vermehrt IFN-γ, IL-2 und TNF-β, während Th2-Zellen Zytokine wie IL-4, -5, -6, -10 und -13 freisetzen (CHERWINSKI et al. 1987; MOSMANN u. COFFMAN 1989;
FOWELL et al. 1991; ROMAGNANI 1991, 1994). Th1-Zellen sind angesichts ihres proinflammatorischen Charakters entscheidend an der Abwehr mikrobieller Erreger im Uterus beteiligt. Während der Trächtigkeit kommt es jedoch zu einer Dominanz einer Th2-Antwort im graviden Uterus, um eine maternale Toleranz gegenüber dem Fetus zu induzieren (WEGMANN et al. 1993).
NK-Zellen gehören zu den Lymphozyten, besitzen jedoch keinen Antigenrezeptor und sind daher Teil des angeborenen Immunsystems. Sie sind mit speziellen Rezeptoren ausgestattet (KIR-Rezeptoren), die der Erkennung von MHC-Klasse-I-Molekülen dienen und die NK- Zell-vermittelte Zytoxizität hemmen (WAGTMANN et al. 1995). Das Binden entsprechender Liganden an CD2 hingegen führt zur Aktivierung der NK-Zell-vermittelten Zytoxizität (SILICIANO et al. 1985; SCHMIDT et al. 1987; SEAMAN et al. 1987). Auch tragen NK- Zellen den Membran-assoziierten Fcγ-Rezeptor CD16 (auch FcγRIII) auf ihrer Oberfläche, welcher eine geringe Affinität für IgG besitzt (DAERON 1997) und eine ähnliche Funktion wie CD2 aufweist. Weiterhin exprimieren NK-Zellen den spezifischen NK-Zell-Rezeptor CD335 (auch NKp46 oder NCR-1), der die Zytotoxizität dieser Zellen stark aktiviert und ebenfalls auf bovinen NK-Zellen exprimiert wird (BOYSEN u. STORSET 2009).
22 2.6.2 Monozytäre Zellen
Monozyten sind eine heterogene Population innerhalb der Blutleukozyten. Alle Monozyten exprimieren das transmembrane Glykoprotein CD172a (auch SIRPα) (VAN BEEK et al.
2005). Sowohl humane und murine Monozyten als auch Monozyten von Schwein und Ratte konnten anhand phänotypischer sowie funktioneller Merkmale in verschiedene Subpopulationen, basierend auf ihrer differenziellen Expression der Oberflächenmoleküle CD14 und CD16 unterschieden werden (PASSLICK et al. 1989; GRAU et al. 2000;
GEISSMANN et al. 2003; CHAMORRO et al. 2004). Beim Menschen lassen sich klassische (CD14++CD16-), intermediäre (CD14+CD16+) und nicht-klassische Monozyten (CD14- CD16+) voneinander unterscheiden. Bei ca. 80 bis 90 Prozent der zirkulierenden Monozyten handelt es sich um klassische Monozyten (STRAUSS-AYALI et al. 2007).
Klassische Monozyten zeigen eine sehr starke Expression von Genen, die für antimikrobielle Funktionen notwendig sind, intermediäre Monozyten regulieren Gene für die Fcγ-Rezeptor- vermittelte Phagozytose hoch (ANCUTA et al. 2009; ZHAO et al. 2009) und gelten als proinflammatorische Zellen. Sie produzieren verglichen mit klassischen Monozyten kaum IL- 10 (ZIEGLER-HEITBROCK 2007). Nicht-klassische Monozyten sind kaum phagozytisch aktiv und produzieren weder TNFα noch IL-1 als Reaktion auf LPS (SKRZECZYNSKA- MONCZNIK et al. 2008).
In einer Studie von ZAWADA et al. (2011) konnte gezeigt werden, dass klassisch aktivierte Monozyten zwar die höchste Phagozytose-Kapazität, frisch isolierte intermediäre Monozyten aber die stärkste ROS-Produktion aufweisen. CROS et al. (2010) dagegen sprechen klassischen Monozyten die stärkste ROS-Produktion zu, dies allerdings nur nach Stimulation mit IgG-opsonisiertem BSA.
MOBLEY et al. (2007) sehen die Primärfunktion von klassischen Monozyten in der Beseitigung apoptotischer neutrophiler Granulozyten, während die CD16+ Monozyten eher an der peripheren Wirtsabwehr beteiligt sind, da sie zahlreiche Gene für antimikrobielle Proteine nach Aktivierung exprimieren. Doch auch bei Betrachtung der beiden CD16+
Subpopulationen fallen Unterschiede ins Auge. Beispielsweise zeigen die intermediären Monozyten eine signifikant höhere Expression von Genen, die für die Immunabwehr mikrobieller Keime von Bedeutung sind (z.B. S100A8 und CD14) und von Genen, welche für die Prozessierung und Präsentation von Antigenen notwendig sind. Nicht-klassische
23
Monozyten hingegen zeigen eine deutlich stärkere Genexpression zur Unterstützung MHC- Klasse-I-vermittelter Prozesse, der Migration und der transendothelialen Beweglichkeit sowie des Zellmetabolismus (ZAWADA et al. 2011).
Darüber hinaus können Unterschiede in der Expression von Zelloberflächenmolekülen beobachtet werden. Klassische Monozyten exprimieren Rezeptoren wie P-Selektin- Glykoprotein-Ligand-1 (PSGL1), CC-Chemokin-Rezeptor 2 (CCR2) und CCR6, um aus dem Blut ins Gewebe zu gelangen (SOEHNLEIN u. LINDBOM 2010). Nicht-klassische Monozyten gelangen dagegen CX3CL1-vermittelt ins Gewebe (ANCUTA et al. 2003).
Intermediäre Monozyten können anhand ihrer selektiven Expression von CCR5 (ANCUTA et al. 2003; ROGACEV et al. 2011) und CD143 (ULRICH et al. 2006) von den beiden anderen Subpopulationen unterschieden werden.
2.7 Chemokine und Chemokinrezeptoren von Monozyten
Das Chemokinsystem umfasst eine Familie kleiner Proteine, die über Rezeptorbindung Chemotaxis vermitteln können. Sie können Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems selektiv anhand eines Konzentrationsgefälles, dem sog. Chemokingradienten, rekrutieren (CALLEWAERE et al. 2007). Chemokine sind beteiligt an der Angiogenese, an der Reifung von Leukozyten sowie deren Transport zu Lymphorganen, an der Entwicklung des neuronalen Systems und an der Bildung von Lymphorganen (MOORE et al. 1998;
CUPEDO u. MEBIUS 2003; ONO et al. 2003; RANSOHOFF 2009). Sie beeinflussen die Anzahl und den Aktivierungszustand von Integrinen auf der Oberfläche von Endothelzellen und können so Migration vermitteln (SPRINGER 1994). Chemokine bestehen aus 60 bis 100 Aminosäuren mit vier konservierten Cysteinen, die zwei essenzielle Disulfidbrücken bilden (Cys1 – Cys3 und Cys2 – Cys4). Beim Menschen ist das Chemokinsystem bereits sehr gut erforscht, es beinhaltet etwa 50 verschiedene Chemokine, welche mithilfe der Reihenfolge und Anzahl aufeinander folgender Cysteine am N-Terminus in vier Kategorien eingeteilt werden: CXC, CC, CX3C und XC. Außerdem beinhalten Chemokine drei unterschiedliche Domänen: die flexible N-terminale Domäne, die große Schleife und die α-Helix.
Rezeptorbindung und -aktivierung wird beispielsweise vor allem durch die N-terminale Domäne vermittelt (CLARKLEWIS et al. 1991).
24
Chemokine einer Kategorie binden nur an spezialisierte Rezeptoren auf der Zelloberfläche, welche derselben Kategorie angehören (LEONARD u. YOSHIMURA 1990). Bei Chemokinrezeptoren handelt es sich um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), deren Aktivierung rasch die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration (BAGGIOLINI 1998) und eine Veränderung der Zellgestalt (shape change) durch Neuformation und Retraktion von Lamellipodien zur Folge hat.
Chemokine und ihre Rezeptoren zeichnet i. d. R. eine Promiskuität aus. So können mehrere Chemokine an denselben Rezeptor und ein Chemokin meist mehrere verschiedene Rezeptoren binden. Zudem ist das Chemokinsystem redundant. Das heißt, verschiedene Chemokine und Chemokinrezeptoren können dieselbe Funktion erfüllen. Der Ausfall eines Chemokins oder Rezeptors kann also durch ein anderes Chemokin oder einen anderen Rezeptor kompensiert werden (MANTOVANI 1999). Neuere Studien gehen davon aus, dass alle Chemokine durch Duplikation aus einem gemeinsamen Vorläufer hervorgegangen sind und dieser Prozess noch weiter andauert (DEVRIES et al. 2006; NOMIYAMA et al. 2010). Sowohl das humane als auch das murine Chemokinsystem sind mittlerweile gut ergründet, jedoch ist über das bovine System bisher nur wenig bekannt. I. d. R. orientiert man sich bei der funktionellen Einordnung boviner Chemokine und ihrer Rezeptoren an Aminosäure-Homologien zum humanen System. Diese Vorgehensweise ist jedoch riskant und kann zu Fehleinschätzungen führen. NOMIYAMA et al. (2010) versuchten einen initialen Vergleich des bovinen Chemokinsystems mit dem anderer Vertebraten. Es wurde festgestellt, dass zahlreiche Chemokine und Chemokinrezeptoren durch Tandemgenduplikation auf sog. Cluster-Regionen der Chromosomen lokalisiert sind. Diese Cluster-Chemokine zeigen oft speziesspezifische Unterschiede, was vermutlich auf die unterschiedliche Pathogenexposition verschiedener Spezies zurückzuführen ist.
Die CC-Liganden CCL2, CCL4 und CCL5 werden als Chemoattraktoren für Monozyten beschrieben (SOZZANI et al. 1993). Zusätzlich wird auch CCL3 als Vermittler der Chemotaxis von Monozyten erwähnt (DAVID 2000). Diese Liganden binden an diverse Chemokinrezeptoren auf Monozyten. Dabei sind vor allem CCR1, CCR2, CCR5 und CXCR4 von Bedeutung (SAMSON et al. 1996; SU et al. 1996; BLEUL et al. 1997; FRADE et al.
25
1997; XU et al. 2000). Genannt werden allerdings auch die Rezeptoren CCR7, CCR8, CXCR1, CXCR2 und CX3CR1(WIDDISON u. COFFEY 2011).
2.7.1 CCL2
Humanes CCL2 (Monocyte Chemoattractant Protein 1 = MCP-1) besteht aus 76 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 13 kDa (VAN COILLIE et al. 1999). CCL2 bindet an den Chemokinrezeptor CCR2 und ist in der Lage, mononukleäre Zellen zu aktivieren und rekrutieren. Insbesondere Monozyten werden nach CCL2-Freisetzung an den Ort akuter entzündlicher Prozesse gelockt (AJUEBOR et al. 1998). Es konnte gezeigt werden, dass CCL2- und CCR2-Knockout-Mäuse eine gestörte Rekrutierung von Monozyten sowie eine dysregulierte Zytokinproduktion aufwiesen (LU et al. 1998). Weiterhin kann CCL2 den Phänotyp von Fibroblasten und Endothelzellen modulieren und spielt möglicherweise eine große Rolle in der Wundheilung. Zum überwiegenden Teil wird CCL2 von Monozyten und Makrophagen gebildet (YOSHIMURA et al. 1989a; YOSHIMURA et al. 1989b). Aber auch Endothelzellen, Fibroblasten, Epithelzellen, glatte Muskelzellen, Mesangiozyten, Astrozyten und Mikrogliazellen sind in der Lage dieses Chemokin zu produzieren (CUSHING et al.
1990; STANDIFORD et al. 1991; BROWN et al. 1992; BARNA et al. 1994). Dabei erfolgt die Freisetzung aus den genannten Zellen entweder konstitutiv oder nach Induktion durch oxidativen Stress, Zytokine oder Wachstumsfaktoren. Im Zuge einer Th2-Antwort wird die CCL2-Expression hochreguliert (CHENSUE et al. 1995; HANDEL u. DOMAILLE 1996).
Außerdem stimuliert es verstärkt die IL-4-Ausschüttung aus T-Zellen (KARPUS et al. 1997).
Darüber hinaus konnte bei diversen Th2-vermittelten Immunerkrankungen wie Asthma (GONZALO et al. 1998) eine vermehrte Expression von CCL2 festgestellt werden. Auch konnte ein Zusammenhang zwischen der verstärkten Expression von CCL2 und einigen Herz- und Gefäßerkrankungen wie der Atherosklerose via Rekrutierung von Monozyten in das Subendothel gezeigt werden (DAWSON et al. 1999). Daneben wurde eine starke Expression von CCL2 in Tumorgeweben nachgewiesen, was i. d. R. mit der Infiltration Tumor- assoziierter Makrophagen, der Angiogenese und einer schlechten Überlebensrate bei Brustkrebs assoziiert war (VALKOVIC et al. 2002). ZACHARIAE et al. (1990) zeigten jedoch, dass CCL2 auch anti-tumorale Eigenschaften aufweist, da es die zytostatische Aktivität von Makrophagen gegen Tumorzellen in der Gewebekultur erhöhte und die
26
Apoptose von Zellen durch Expression von Fas-Liganden induzierte. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass CCL2 eine wichtige Rolle im Entzündungsgeschehen spielt, da es Monozyten und andere Immunzellen ins Gewebe rekrutiert und sowohl deren Zytokinproduktion als auch -sekretion steuert. CCL2 beeinflusst somit entscheidend den Fortgang entzündlicher Reaktionen.
2.7.2 CCL4
CCL4 (MIP-1β, macrophage inflammatory protein 1-β) ist wenig erforscht. Dieses Monozyten-aktivierende CC-Chemokin besteht aus 69 Aminosäuren (7,6 kDa) und bindet an den Chemokinrezeptor CCR5. CCL4 vermittelt die Chemotaxis von NK-Zellen, Monozyten und einer Vielzahl anderer Zellen (BYSTRY et al. 2001). Weiterhin aktiviert es neutrophile, basophile und eosinophile Granulozyten und induziert die Synthese und Freisetzung proinflammatorischer Zytokine wie IL-1, IL-6 und TNF-α aus Makrophagen und Fibroblasten (COLOBRAN 2007). Produziert wird es von Makrophagen, welche zuvor mit Endotoxinen stimuliert wurden. Ferner vermittelt es die Migration von Monozyten und IL-2-stimulierten T- Zellen durch Bindung an CCR5 (BAGGIOLINI 1998).
2.7.3 CCL5
CCL5 (RANTES = Regulated upon Activation Normal T cell Expressed and Secreted) setzt sich aus 68 Aminosäuren zusammen und hat ein Molekulargewicht von 7 kDa (APPAY u.
ROWLAND-JONES 2001). Es bindet die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren CCR1, CCR3, CCR4 und CCR5, wobei CCR1 und CCR5 auf Monozyten exprimiert werden (SAMSON et al. 1996) und induziert die Migration von Leukozyten wie T-Zellen und Monozyten, aber auch basophilen und eosinophilen Granulozyten, NK-Zellen, dendritischen Zellen und Mastzellen (SCHALL 1991). Die Hauptproduktion von CCL5 erfolgt durch CD8+ T-Zellen, es kann aber auch von Epithelzellen, Fibroblasten und Thrombozyten gebildet werden. CCL5 gilt als proinflammatorisches Chemokin und kann durch Induktion der NO-Produktion in Makrophagen antimikrobielle Eigenschaften aufweisen (VILLALTA et al. 1998). Aufgrund seiner proinflammatorischen Natur kann die Expression von CCL5 auch schädigend wirken, wie es für allogene Transplantatabstoßungen, Atherosklerose, Arthritis, atopische Dermatitis, Asthma, Überempfindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ, Glomerulonephritis,
27
Endometriose, Morbus Alzheimer und verschiedene Tumorerkrankungen gezeigt wurde (ROSSI u. ZLOTNIK 2000; APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). CCL5 soll zudem in der frühen Phase für die Induktion und Promotion eines Tumors und in der späten Phase für die Stimulation der Angiogenese und Metastasierung verantwortlich sein (APPAY u.
ROWLAND-JONES 2001). Manche Autoren sprechen CCL5 einen antiviralen Effekt zu (MCKENZIE et al. 1996; ZANUSSI et al. 1996; POLO et al. 1999). Beispielsweise wird CCL5 verstärkt von Epithelzellen der Lunge sezerniert, wenn diese mit dem Respiratorischen Synzytialvirus (RSV) befallen sind, was zur Rekrutierung der gewünschten Zellen und der Freisetzung antiviraler Zytokine führt (CULLEY et al. 2006). Dennoch wurde in anderen Studien auch eine Förderung von viralen Infektionen wie der HIV-Infektion beschrieben (SCHMIDTMAYEROVA et al. 1996; KINTER et al. 1998; YE et al. 2004). So waren Menschen mit einer Mutation des CCR5-Gens, welche die CCR5-Rezeptorexpression an der Zelloberfläche unterdrückte, trotz mehrfacher Exposition resistent gegen eine Infektion mit HIV (BERGER et al. 1999). Zusammenfassend spielt CCL5 eine entscheidende Rolle für die Entzündungskaskade, da es die Fähigkeit besitzt, Leukozyten an den Ort des Geschehens zu rekrutieren und sowohl pro- als auch antiinflammatorisch wirken kann.
2.8 Makrophagen und Fibrozyten monozytärer Abstammung
2.8.1 Zirkulierende Fibrozyten
Sog. zirkulierende Fibrozyten (begrifflich eine Kombination aus Fibroblast und Leukozyt) wurden zuerst 1994 beschrieben und machen etwa 0,5 Prozent der im Blut zirulierenden Leukozyten aus (BUCALA et al. 1994). Zirkulierende Fibrozyten entwickeln sich aus einer Subpopulation CD14+ Blutmonozyten (ABE et al. 2001; YANG et al. 2002; PILLING et al.
2003; PILLING et al. 2006). Bei dieser Subpopulation handelt es sich vermutlich um klassische Monozyten (GORDON et al. 2005; TACKE et al. 2006). Diese Vorläuferzellen werden chemotaktisch in das Gewebe gelockt, wo sie sich unter dem Einfluss profibrotischer Th2-Zytokine (IL-4, IL-13) zu Fibrozyten ausdifferenzieren. Fibrozyten exprimieren sowohl mesenchymale als auch hämatopoetische Oberflächenmoleküle. Eine bedeutende Rolle spielen sie in der Wundheilung und Angiogenese durch ihre Fähigkeit extrazelluläre Matrix und proangiogene Faktoren freizusetzen, sie sind aber auch an fibrotischen Krankheitsgeschehen beteiligt.
28
2.8.2 Differenzierung aus peripheren Blutmonozyten
Nach erfolgter Migration ins Gewebe können sich Monozyten dort zu Makrophagen ausdifferenzieren. Dabei hängt es vom Stimulus ab, welcher Makrophagensubtyp hervorgeht.
Es können funktionell drei Makrophagen-Subpopulationen unterschieden werden: klassisch aktivierte, proinflammatorische Makrophagen, Wundheilungsmakrophagen und regulatorische Makrophagen. Proinflammatorische Effektormakrophagen (klassisch aktivierte Makrophagen) entwickeln sich nach Stimulation mit IFN-γ und TNF. INF-γ wird von NK- Zellen rasch bei einer Infektion oder Stress produziert. Diese Produktion ist allerdings vorübergehend und wird anschließend durch Zellen der adaptiven Immunität (Th1-Zellen) übernommen, welche eine andauernde klassische Aktivierung gewährleisten (MOSSER u.
EDWARDS 2008). Unter Umständen können auch manche TLR-Liganden durch Induktion von TNF und IFN-β zu einer klassischen Aktivierung von Makrophagen führen (YAMAMOTO et al. 2003).
Wundheilungsmakrophagen differenzieren sich unter dem Einfluss von IL-4 aus Monozyten.
IL-4 wird bei der Verletzung von Gewebe hauptsächlich von basophilen Granulozyten und Mastzellen sezerniert (BRANDT et al. 2000). Auch Chitin, ein Bestandteil von einigen Pilzen und Parasiten, kann zur Ausbildung von Wundheilungsmakrophagen durch IL-4-Sekretion führen (REESE et al. 2007). Auch eine Th2-vermittelte Immunantwort, induziert durch Freisetzung der Zytokine IL-4 und IL-13, fördert die Differenzierung und Aktivierung von Wundheilungsmakrophagen. Eine Th2-Antwort wird induziert bei Störungen der Mukosa, vor allem in Darm und Lunge (REESE et al. 2007), sowie bei Helminthen-Infektionen (WILSON et al. 2007).
Die Differenzierung von Monozyten aus dem peripheren Blut zu regulatorischen Makrophagen kann durch stressbedingte Ausschüttung von Glucocorticoiden aus der Nebenniere induziert werden.
Wie Makrophagen, Osteoklasten und dendritische Zellen entwickeln sich auch zirkulierende Fibrozyten aus peripheren Blutmonozyten, welche aus dem Blut mithilfe verschiedener Chemokine in das Gewebe einwandern. Ohne eine Proliferation zu bewirken, wird die Differenzierung durch antiinflammatorische Zytokine wie TGF-β, Interleukin 4 und 13 gefördert, wohingegen sie durch proinflammatorische Zytokine wie IFN-γ und IL-12
29
gehemmt wird (SHAO et al. 2008). Die genannten Th1- und Th2-Zytokine können sich in ihrer Wirkung gegenseitig beeinflussen. Es ist also von Bedeutung, welcher Stimulus überwiegt. Bekannt ist, dass sowohl IL-4 und IL-13 als auch IFN-γ direkt auf die Vorläuferzelle wirken, während IL-12 offenbar indirekt, möglicherweise durch Stimulation von CD16+ NK-Zellen, zu einer Differenzierung führt (COOPER et al. 2001; SCHLEICHER et al. 2005; BOGDAN u. SCHLEICHER 2006; SHAO et al. 2008). Aber nicht nur durch Sekretion von regulierenden Zytokinen aktivierter CD4+ T-Zellen kann die Differenzierung von Fibrozyten gesteuert werden, auch der Zell-Zell-Kontakt zwischen Fibrozyten und CD4+
T-Zellen scheint unentbehrlich für die Differenzierung (ABE et al. 2001; NIEDERMEIER et al. 2009). Weiterhin vermindern auch der Serumbestandteil Serumamyloid P (SAP), ein Fcγ- Rezeptor-Antagonist, und aggregiertes IgG die Ausdifferenzierung zu Fibrozyten. Dabei überwiegt der negative Effekt von SAP den positiven Effekt der stimulierenden Zytokine IL-4 und IL-13 (SHAO et al. 2008). In der Regel treten diese Zellen in der späten Phase einer entzündlichen Reaktion in Erscheinung. Dieses geschieht vermutlich nachdem der Gehalt an SAP oder anderen hemmenden Faktoren, der in der frühen Phase einer Entzündung im Gewebe ansteigt, wieder abfällt, so dass eine Differenzierung monozytärer Zellen zu Fibroblast-ähnlichen Zellen nicht mehr gehemmt wird (BUCALA et al. 1994; ABE et al.
2001; SCHMIDT et al. 2003; PHILLIPS et al. 2004; MORI et al. 2005; HAUDEK et al. 2006;
PILLING et al. 2007). Zudem sind Fibrozyten dazu in der Lage sich unter dem Einfluss von TGF-β zu einem aktiveren Zelltyp, den Myofibroblasten, auszudifferenzieren, welche verstärkt α-smooth muscle actin (α-SMA), aber vermindert CD34 exprimieren.
2.8.3 Phänotypische und funktionelle Eigenschaften
Morphologisch handelt es sich bei Makrophagen um runde Zellen (Durchmesser: etwa 15 μm). Sie können aber auch viele Zytoplasmaausläufer ausbilden und eine Dendriten-ähnliche Form annehmen (DUEVEL 2012). Makrophagen besitzen einen hohen Zytoplasmaanteil und einen zentrierten, runden oder bohnenförmigen Zellkern.
Zirkulierende Fibrozyten sind etwa 50-200 µm groß, besitzen eine spindelförmige, Fibroblast- ähnliche Form und verfügen über einen ovalen Zellkern (PILLING et al. 2009). Sie verfügen über zytoplasmatische Ausläufer von einer Länge, welche etwa zwischen der von
30
Pseudopodien und Mikrovilli liegt (GRIEB 2012). Außerdem exprimieren sie sowohl Moleküle von Stromazellen wie beispielsweise Kollagen I und III sowie Fibronektin. Auch das hämatopoetische Stammzellen-Oberflächenmolekül CD34 und das Leukozytenmolekül CD45 konnten nachgewiesen werden. Weiterhin exprimieren Fibrozyten CD14 und CD11, es fehlen aber lymphozytäre Oberflächenstrukturen wie CD3, CD4, CD8, CD19 oder CD25 (BUCALA et al. 1994). CD16 ist kaum oder gar nicht auf der Zelloberfläche nachweisbar (PILLING et al. 2009). Es ist davon auszugehen, dass Fibrozyten einige phänotypische und funktionelle Eigenschaften mit den alternativ aktivierten M2-Makrophagen gemeinsam haben, welche auch der späten entzündlichen Reaktion und Wundheilung zugeordnet werden (MARTINEZ et al. 2008). Sie zeigen z. B. eine variable Expression des Hämoglobin- Scavenger-Rezeptors CD163. Allerdings wurde auch die Expression des calciumbindenden Komplexes S100A8/A9 beschrieben (PILLING et al. 2009). Durch den Nachweis einer Kombination verschiedener Zellmoleküle ist es möglich Fibrozyten von Monozyten, Makrophagen und Fibroblasten zu unterscheiden. Meist wird dazu die Ko-Expression von CD45 und CD34 sowie Kollagen I oder Prokollagen I genutzt (MOELLER et al. 2009).
Manche Studien empfehlen zur Unterscheidung eine Kombination von Antikörpern gegen CD45RO (niedrig molekulare Isoform von CD45), CD32 (FcγR), Kollagen und PM2K, wobei PM2K nur von reifen Makrophagen exprimiert wird (PILLING et al. 2009). Weiterhin exprimieren Fibrozyten das Oberflächenmolekül MHC II und costimulatorische Moleküle wie CD80 und CD86 (CHESNEY et al. 1997; BLAKAJ 2009).
2.8.4 Immunstimulierende Eigenschaften und Expression immunrelevanter Gene Klassisch aktivierte Makropagen zeigen eine starke Produktion proinflammatorischer Zytokine und Mediatoren (z.B. IL-1, IL-6 und IL-23) (MACKANESS 1977; O'SHEA u.
MURRAY 2008). Aus diesem Grund ist dieser Makrophagensubtyp effektiv an der Abwehr mikrobieller Infektionen in der frühen Phase einer Entzündung beteiligt.
Wundheilungsmakrophagen sezernieren nahezu keine proinflammatorischen Zytokine und deutlich weniger toxische Sauerstoff- und Stickstoffradikale als klassisch aktivierte Makrophagen (EDWARDS et al. 2006). Dafür zeigen Wundheilungsmakrophagen eine verstärkte Expression von Arginase und sind deshalb in der Lage, Komponenten der Extrazellulärmatrix zu sezernieren.
31
In regulatorischen Makrophagen ist die Transkription proinflammatorischer Zytokingene gehemmt (STERNBERG 2006). Nach Aktivierung von regulatorischen Makrophagen, welche zwei Signale benötigt, setzen diese IL-10 frei (EDWARDS et al. 2006), welches für diesen Makrophagensubtyp charakteristisch ist. Weiterhin ist bei diesen Zellen die Expression des proinflammatorischen Zytokins IL-12 herunterreguliert (GERBER u. MOSSER 2001). Im Gegensatz zu Wundheilungsmakrophagen kann diese Makrophagensubpopulation keine Extrazellulärmatrix produzieren. Allerdings können regulatorische Makrophagen naiven T- Zellen wirksam Antigen präsentieren, da sie anders als Wundheilungsmakrophagen MHC II- Moleküle und costimulatorische Moleküle (CD80 und CD86) exprimieren (EDWARDS et al.
2006).
Fibrozyten exprimieren ein besonderes Spektrum an Zytokinen und Chemokinen welches sich von dem anderer Zellen, wie Monozyten, Makrophagen, T-Zellen, dendritischen Zellen Fibroblasten und Endothelzellen, unterscheidet (PILLING et al. 2009). Sie sezernieren vor allem Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren, welche ein geeignetes Milieu für eine effiziente Wundheilung schaffen (GRIEB 2012). Während die Expression hämatopoetischer Marker wie CD34 und CD45 im Verlauf der fortschreitenden Differenzierung der Fibrozyten herunterreguliert wird, steigt die Expression von TGF-β an. TGF-β vermittelt die Differenzierung zu Fibroblasten und Myofibroblasten, welche aktiv extrazelluläre Matrix (Kollagen, Fibronektin, Vimentin) produzieren (MORI et al. 2005). Hohe Konzentrationen des proinflammatorischen Zytokins IL-1β veranlassen Fibrozyten TNF-α, macrophage colony stimulating factor (M-CSF), IL-6, IL-10, MIP-1α ( auch CCL3) und MIP-1β (auch CCL4) und Metalloproteinasen wie MMP-9 (Matrix-Metalloproteinase 9) zu sezernieren (HERZOG u. BUCALA 2010). Außerdem können MdF zahlreiche proangiogene Faktoren, wie VEGF, M-CSF, GM-CSF, FGF, TGF sowie IL-8 und IL-1β freisetzen, um die Gefäßbildung in geschädigtem Gewebe zu stimulieren (HERZOG u. BUCALA 2010). Schließlich exprimieren Fibrozyten eine Reihe verschiedener Chemokinrezeptoren, welche der gerichteten Rekrutierung dieser Entzündungszellen dienen. Für die Maus wurde die Expression der Rezeptoren CCR2, CCR7 und CXCR4 auf Fibrozyten beschrieben (PHILLIPS et al. 2004;
MOORE et al. 2006; SAKAI et al. 2006), beim Menschen kommen zudem CCR3 und CCR5 vor (QUAN et al. 2004).
32
2.8.5 Bedeutung während der Wundheilung und im Krankheitsgeschehen
Klassisch aktivierte Makrophagen sind von großer Bedeutung für die Immunabwehr. Bei fehlender IFN-γ-Aktiverung wird der Wirt deutlich anfälliger für verschiedene bakterielle, virale sowie Protozoeninfektionen (FILIPE-SANTOS et al. 2006). Sie sind aber auch an der Immunpathologie verschiedener Autoimmunerkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis (SZEKANECZ u. KOCH 2007) und der inflammatory bowel disease (ZHANG u. MOSSER 2008) beteiligt, welche oft mit einer übermäßigen Produktion proinflammatorischer Mediatoren einhergehen.
Wundheilungsmakrophagen hingegen zeigen eine erhöhte Arginaseaktivität. Arginase baut Arginin zu Ornithin, einem Vorläufer von Kollagen und von Polyaminen, um. Dies trägt zur Produktion extrazellulärer Matrix (KREIDER et al. 2007) und somit zur Wundheilung bei.
Dysregulierte Makrophagen der Wundheilung können aber auch schädigend wirken.
Exemplarisch soll angeführt werden, dass die bei chronischer Schistosomiasis auftretende Gewebefibrose durch eine unkontrollierte Aktivierung von Wundheilungsmakrophagen zustande kommt (HESSE et al. 2001).
Regulatorische Makrophagen gelten als Inhibitoren und Regulatoren von Entzündungen. Dies begründet sich in der verminderten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine wie IL-12 sowie der erhöhten Ausschüttung des antiinflammatorischen Zytokins IL-10.
Durch ihre Fähigkeit extrazelluläre Matrix und angiogene sowie fibrogene Zytokine zu sezernieren spielen zirkulierende Fibrozyten in der Wundheilung eine bedeutende Rolle.
Außerdem können sie durch Expression von α-SMA einen effektiven kontraktilen Wundverschluss gewährleisten (ABE et al. 2001; METZ 2003). Sie sind aber auch an vielen pathologischen fibrotischen Prozessen bei Mensch und Tier beteiligt. Beim Menschen konnte eine entscheidende Beteiligung von MdF an vielen Erkrankungen wie etwa der hypertrophen Narbenbildung, Tumorgenese, dem Asthma sowie der interstitiellen Lungen- oder Nierenfibrose bestätigt werden. In vielen dieser Läsionen konnte zudem ein erhöhter Spiegel der pro-fibrotischen Zytokine IL-4 und IL-13 festgestellt werden, der selbst die Wirkung der antifibrotischen Zytokine IFN-γ und IL-12 übertraf, wenn diese Zytokine am Entzündungsort
33
vorhanden waren (HUANG et al. 1995; MOLLER et al. 1996; HANCOCK et al. 1998;
SAKKAS et al. 1999). Außerdem werden Fibrozyten mittels verschiedener Chemokine, welche an passende Chemokinrezeptoren auf ihrer Oberfläche binden, im Laufe fibrotischer Erkrankungen in die unterschiedlichen Gewebe und Organe gelockt. Murine Fibrozyten exprimieren die Chemokinrezeptoren CCR2, CCR7 und CXCR4 (PHILLIPS et al. 2004;
MOORE et al. 2006; SAKAI et al. 2006), während humane Fibrozyten zusätzlich die Rezeptoren CCR3 und CCR5 aufweisen (QUAN et al. 2004). Auch im Tiermodel konnte ein Beitrag der MdF an diversen fibrotischen Veränderungen, wie der Lungen-, Leber- und Nierenfibrose oder der Bildung chronischer Granuloma, experimentell gezeigt werden (DIREKZE et al. 2003; EPPERLY et al. 2003; HASHIMOTO et al. 2004; PHILLIPS et al.
2004; QUAN et al. 2004; KISSELEVA et al. 2006; MOORE et al. 2006; SAKAI et al. 2006;
VARCOE et al. 2006) Fibrozyten sind weiterhin an diversen autoreaktiven Prozessen beteiligt. Dieses wird durch die Tatsache untermauert, dass sie T-Zellen sehr wirksam Antigen präsentieren können (CHESNEY et al. 1997). In den betroffenen Organen führt eine überschießende Reaktion der Fibrozyten zu persistierenden Entzündungen und einem Umbau der normalen Organstruktur, so dass eine physiologische Funktion des Organs meist nicht mehr gewährleistet ist. Zudem wurde festgestellt, dass sich die Anzahl der Fibrozyten im peripheren Blut im Alter erhöht (MATHAI et al. 2010). Jedoch ist nicht klar, ob diese vermehrte Zahl physiologisch dem Erhalt der Gewebeintegrität dient oder mit altersbedingten fibrotischen Erkrankungen im Zusammenhang steht.
34
3 Material und Methoden
3.1 Versuchstiere
Für die Analysen wurden Tiere der Rasse Holstein-Friesian unterschiedlichen Alters ausgewählt. Folgend werden die Tiergruppen dargestellt, welche für die Probenentnahme genutzt wurden. Bei der Auswahl der Tiergruppen wurde darauf geachtet, dass Tiere einer Gruppe wesentliche Merkmale gemein haben. Zur Bestimmung des allgemeinen Gesundheitsstatus und der Gesundheit des Geschlechtstraktes im Speziellen wurden unterschiedliche Untersuchungen herangezogen (s. u.).
3.1.1 Gesunde, mittlaktierende Kühe
Es handelt sich bei diesen Kühen um 8 Tiere, welche im Schlachthof Lübbecke getötet wurden. Die Tiere befanden sich zum Zeitpunkt der Tötung in Laktation. Bei der Probennahme wiesen diese Tiere weder Anzeichen einer klinischen Allgemeinerkrankung noch Anzeichen einer Erkrankung des Uterus wie eitriges Sekret, Schwellung oder Rötung der Schleimhaut auf. Diese Tiergruppe wurde gewählt, um Unterschiede in der Zusammensetzung und Funktion der Leukozytenpopulationen im Uterusgewebe im Vergleich zu uterusgesunden, nicht mittlaktierenden Kühen sowie klinisch oder subklinisch an Endometritis erkrankten Tieren aufzuzeigen.
3.1.2 Gesunde, frühträchtige Färsen
Aus der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule stammten 30 Färsen, denen zum Zeitpunkt der Ovulation (Tag 0), nach dem Einsetzen des Embryos (Tag 7) und zum Zeitpunkt des Herausspülens des Embryos (Tag 18) gerinnungsgehemmtes Blut (Na-Heparin) abgenommen wurde. Dieser Zyklus wurde zweimalig wiederholt. Kein Tier befand sich zum Zeitpunkt der Probenentnahme in Laktation. Während der Blutentnahme ließen sich vorberichtlich und makroskopisch keine Hinweise auf eine Erkrankung erkennen. Aus dem Blut isolierte mononukleäre Zellen wurden mittels Membranimmunfluoreszenz phänotypisiert und quantifiziert (s. u.). Dabei wurden trächtige Tiere mit Tieren, bei denen eine Trächtigkeit ausblieb, hinsichtlich einer Variation innerhalb mononukleärer Zellpopulationen und Zellsubpopulationen verglichen. Diese Tiergruppe war Teil eines Versuches, der derzeit im
