3.5 Gewinnung einzelner Leukozytenpopulationen des Blutes
3.5.3 Phänotypische Charakterisierung boviner mononuklärer Zellen und deren
Prinzip der Durchflusszytometrie
Bei der Durchflusszytometrie werden Einzelzellen in einem Probenführungssystem an einem Laserstrahl vorbeigeleitet. Bei dem für diese Versuche verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein BD Accuri C6® (9.1) mit zwei Lasern, die Licht einer Wellenlänge von 488 nm und 640 nm erzeugen. Das Gerät erfasst mit entsprechenden Detektoren Fluoreszenz-Emissionen in vier verschiedenen Wellenlängenbereichen (FL1 = Grünfluoreszenz: 530 ± 15 nm; FL2 = Orangefluoreszenz: 585 ± 20 nm; FL3 = Rotfluoreszenz: > 650 nm; FL4 = Violettfluoreszenz: 675 ± 12,5 nm). Gestreutes Licht wird zudem in Richtung des Strahls als sog. Vorwärtsstreulicht (forward scatter, FSC) oder orthogonal dazu als Seitwärtsstreulicht (side scatter, SSC) erfasst. Durch die Vorwärtsstreuung werden die Partikelgröße und deren Refraktionsindex, durch die Seitwärtsstreuung die Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) charakterisiert (RADBRUCH 1992). Jedes Messereignis wird durch sechs verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL1, FL2, FL3, FL4) gekennzeichnet und digital gespeichert.
Die computergestützte Auswertung der Daten erfolgte mit der Software BD Accuri CFlow®. Die Ergebnisse wurden mehrparametrisch als korrelierte Dichtediagramme oder Histogramme dargestellt. Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse (Events) wurden nach
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der Messung softwaregestützt elektronische Fenster (Gates) gesetzt und zum Teil mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft.
Direkte Membranimmunfluoreszenz
Mit der direkten Membranimmunfluoreszenz (MIF) wurden MNC hinsichtlich der Expression ausgewählter membranständiger Moleküle geprüft. Aus logistischen Gründen konnte im Schlachthof vor der Schlachtung kein Blut gewonnen werden und somit keine Membranimmunfluoreszenz durchgeführt werden.
Für die Analyse wurden entweder mononukleäre Zellen separiert oder es wurde mit Gesamtleukozyten nach hypotoner Lyse des Vollblutes gearbeitet. Die separierten Zellen der Tiere wurden in verschiedenen Ansätzen (Abbildung 1) in einer 96-Well-Mikrotiterplatte (9.2.2) mit monoklonalen Antikörpern (Tabelle 2) gegen entsprechende Oberflächenmoleküle angefärbt. Dazu wurden die Antikörperverdünnungen 30 Min. unter Lichtausschluss im Kühlschrank auf den Zellen belassen, dann in drei Waschschritten (4 Min., 350 x g, 4°C) mit 150 µL MIF-Puffer (9.2.4) in der Plattenzentrifuge (9.1) entfernt und zuletzt wurden die Zellen in 100 µL MIF-Puffer und 100 µL PBS-PJ (4 µg/ mL) oder TO-PRO®-3 Iodid (9.2.3) aufgenommen. Die Antikörper waren mit verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen markiert und in jedem Ansatz wurde eine Kombination unterschiedlicher Antikörper sowie ein Lebend/Tot-Farbstoff (Propidiumjodid, TO-PRO®-3 Iodid) verwendet. Dieser Lebend/Tot-Farbstoff diente der Erkennung nekrotischer Zellen, bei denen ein kationischer Farbstoff durch die nicht mehr intakte Zellmembran eindringt und mit der DNA interkaliert.
In jedem Ansatz wurde darauf geachtet, dass die Messbereiche der Fluorochrom-markierten Antikörper sich nicht überschnitten und dass der Anregungsbereich der genutzten Fluorochrome der Wellenlänge des Lasers entsprach.
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Tabelle 2: monoklonale Primärantikörper für die Membranimmunfluoreszenz
Bezeichnung Hersteller Spezifität1 Donor/Isotyp Verdünnung (v/v)2
CD2-FITC AbD Serotec boCD2 Mouse/IgG1 1:30
CD4-RPE AbD Serotec boCD4 Mouse/IgG2a 1:9
CD8- ALEXA FLUOR® 647
AbD Serotec boCD8 Mouse/IgG2a 1:90
CD25-FITC AbD Serotec boCD25 Mouse/IgG1 1:30
CD172a-RPE- FLUOR® 647
AbD Serotec boCD172a Mouse/IgG2b 1:90
CD21-RPE AbD Serotec boCD21 Mouse/IgG1 1:45
WC1-FITC AbD Serotec boWC1 Mouse/IgG2a 1:90
CD335-RPE AbD Serotec boCD335 Mouse/IgG1 1:6
CD163-RPE AbD Serotec poCD163 Mouse/IgG1 1:45
CD14-FITC AbD Serotec huCD14 Mouse/IgG2a 1:45
CD14-RPE AbD Serotec huCD14 Mouse/IgG2a 1:45
CD16-FITC AbD Serotec huCD16 Mouse/IgG2a 1:50
MHC II-FITC AbD Serotec ovMHC II Mouse/IgG2a 1:45 1) bo: bovin; hu: human; ov: ovin; po: porzin; 2) in MIF-Puffer
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Abbildung 1 Kombinationen direkt markierter Primärantikörper zum Nachweis zellulärer Subpopulationen in bovinen mononukleären Zellen des Blutes.
Ansätze 1 bis 5 dienten der Untersuchung lymphoider Zellpopulationen (T-Zellen, B-Zellen und NK Zellen), wobei die Ansätze 6 bis 9 zur Analyse monozytärer Subpopulationen genutzt wurden. Durch das Setzen von Quadranten konnten bestimmte Zellpopulationen prozentual ermittelt und dokumentiert werden.
Identifizierung der Zellpopulationen und –subpopulationen
Nach der Zellseparation und der Anfärbung durch spezifische monoklonale Antikörper wurden die verschiedenen Ansätze (Abbildung 1) im Durchflusszytometer analysiert. Für die Analyse lymphoider Zellpopulationen wurde zunächst auf vitale lymphoide Zellen gefenstert (Abbildung 2).
Abbildung 2: Strategie zur Identifizierung vitaler lymphoider Zellen nach durchflusszytometrischer Erfassung.
Nach der Erfassung leukozytärer Zellen wurde ein Fenster auf Propidiumjodid-negative Zellen gesetzt (A). In einem FSC/SSC-Dichteplot (B) wurden vitale mononukleäre Zellen (MNC) unter den Leukozyten identifiziert.
SSC
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In einem höher aufgelösten Dichteplot (FSC/SSC, C) wurden die lymphoiden Zellen anhand ihrer FSC/SSC-Eigenschaften ermittelt.
Gefensterte Zellen wurden in korrelierten Dichteplots auf die Verteilung von markierten Subpopulationen untersucht. Abbildung 3 zeigt die Bestimmung des Anteils CD4+ und CD8+
T-Zellen (Abbildung 1, Ansatz 1), den Anteil von CD25+ Zellen (Abbildung 1, Ansatz 2) und den Anteil WC1+ Zellen (Abbildung 1, Ansatz 4) unter den lymphoiden Zellen.
Abbildung 3: Identifizierung von T-Zellsubpopulationen.
Leukozyten wurden mit direkt-markierten Antikörpern gegen CD2 und CD4 (A), CD2 und CD8 (B), CD25 und CD4 (C) oder WC1 und CD14 (D) markiert. Nach Setzen eines Fensters auf vitale lymphoide Zellen wurden die erfassten Zellen in korrelierten (FITC/PE) Dichteplots dargestellt. Die Quadranten teilen die Zellen in einfach-positive (UL, LR), doppelt-einfach-positive (UR), und doppelt-negative Zellen (LL).
Über den Ansatz 3 (Abbildung 1) wurde die Anzahl der NK-Zellen festgestellt, die alle das Oberflächenmolekül CD335 exprimieren (Abbildung 4E), sich jedoch in der CD2-Expression unterscheiden. (Abbildung 4F). Mit dem Ansatz 9 (Abbildung 1) wurde zudem zwischen CD16- und CD16+ NK-Zellen differenziert nachdem ein Fenster auf vitale CD335+ Zellen
CD2 CD2
CD4
A) CD4+ T-Zellen B) CD8+ T-Zellen
CD8
C) CD25+ CD4+ T-Zellen
CD4
CD25
CD14
WC1
D) WC1+ γδ-T-Zellen
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(NK-Zellen) gesetzt wurde (Abbildung 4G). B-Zellen wurden im Ansatz 5 (Abbildung 1) anhand der gleichzeitigen Expression von MHC II und CD21 innerhalb der lymphoiden Zellen identifiziert (Abbildung 4H).
Abbildung 4: Identifikation von NK-Zellen, NK-Zell-Subpopulationen sowie B-Zellen.
Leukozyten wurden mit direkt-markierten Antikörpern gegen CD335 (E), CD335 und CD2 (F), CD335 und CD16 (G) oder MHC-Klasse II (MHC II) und CD21 (H) markiert. Nach Setzen eines Fensters auf vitale lymphoide Zellen wurden die erfassten Zellen in korrelierten (SSC/PE oder FITC/PE) Dichteplots dargestellt.
Zudem wurde ein Fenster um CD335+ Zellen gezogen und die erfassten NK-Zellen in einem korrelierten (SSC/
CD16 FITC) Dichteplot angezeigt (G). Die Quadranten teilen bei FITC/PE-korrelierten Dichteplots die Zellen in einfach-positive (UL, LR), doppelt-positive (UR), und doppelt-negative Zellen (LL).
Nachdem ein Gate um die MNC gezogen wurde und die Auswahl in einem neuen Fenster angezeigt wurde, war es möglich die Zahl der Monozyten im Ansatz 5 (Abbildung 1) zu bestimmen. Es wurde davon ausgegangen, dass alle Monozyten das Molekül CD172a aber nicht CD21 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Im nächsten Schritt wurden die Monozytensubpopulationen ermittelt. Dazu wurde zunächst ein Gate um alle lebenden
CD2 CD335
G) CD16+ NK-Zellen
CD335
SSCSSC CD21
MHC II CD16
H) CD21+ B-Zellen
E) CD335+ NK-Zellen F) CD2+ und CD2- NK-Zellen
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CD172a+ Zellen gezogen und in einem neuen Fenster dargestellt. Mithilfe der Expression von MHC II, CD14, CD163 und CD16 konnten in den Ansätzen 6 bis 8 (Abbildung 1) die verschiedenen monozytären Subpopulationen erfasst werden. Dabei wurde die Klassifizierung der Monozyten, wie bei der Maus beschrieben, anhand der Expression von CD14 und CD16 unternommen. Klassische Monozyten gelten als CD14++CD16-, intermediäre Monozyten als CD14+CD16+ und nicht-klassische Monozyten als CD14-CD16+.
Abbildung 5: Idenfizierung der Monozyten und Monozytensubpolulationen.
Leukozyten wurden mit direkt-markierten Antikörpern gegen CD21 und CD172a (I), CD172a, MHC II und CD14 (J), CD172a, CD14 und CD163 (K) oder CD172a, CD16 und CD14 (L) markiert. Nach Setzen eines Fensters auf vitale mononukleäre Zellen wurden die erfassten Zellen in einem korrelierten CD21/CD172a-Dichteplot dargestellt, um die Monozyten zu erfassen. Zudem wurde ein Fenster um CD172a+ Zellen gezogen und die erfassten Monozyten zur Darstellung der monozytären Subpopulationen in korrelierten (FITC/PE) Dichteplots angezeigt. Die Quadranten teilen dabei die Zellen in einfach-positive (UL, LR), doppelt-positive (UR), und doppelt-negative Zellen (LL).
CD163 CD14
CD21 MHC II
I) CD172a+ Monozyten J) MHC II/CD14 Monozyten
K) CD14/CD163 Monozyten L) CD16/CD14 Monozyten
CD172a CD14
CD14 CD16
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