Für die Analysen wurden Tiere der Rasse Holstein-Friesian unterschiedlichen Alters ausgewählt. Folgend werden die Tiergruppen dargestellt, welche für die Probenentnahme genutzt wurden. Bei der Auswahl der Tiergruppen wurde darauf geachtet, dass Tiere einer Gruppe wesentliche Merkmale gemein haben. Zur Bestimmung des allgemeinen Gesundheitsstatus und der Gesundheit des Geschlechtstraktes im Speziellen wurden unterschiedliche Untersuchungen herangezogen (s. u.).
3.1.1 Gesunde, mittlaktierende Kühe
Es handelt sich bei diesen Kühen um 8 Tiere, welche im Schlachthof Lübbecke getötet wurden. Die Tiere befanden sich zum Zeitpunkt der Tötung in Laktation. Bei der Probennahme wiesen diese Tiere weder Anzeichen einer klinischen Allgemeinerkrankung noch Anzeichen einer Erkrankung des Uterus wie eitriges Sekret, Schwellung oder Rötung der Schleimhaut auf. Diese Tiergruppe wurde gewählt, um Unterschiede in der Zusammensetzung und Funktion der Leukozytenpopulationen im Uterusgewebe im Vergleich zu uterusgesunden, nicht mittlaktierenden Kühen sowie klinisch oder subklinisch an Endometritis erkrankten Tieren aufzuzeigen.
3.1.2 Gesunde, frühträchtige Färsen
Aus der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule stammten 30 Färsen, denen zum Zeitpunkt der Ovulation (Tag 0), nach dem Einsetzen des Embryos (Tag 7) und zum Zeitpunkt des Herausspülens des Embryos (Tag 18) gerinnungsgehemmtes Blut (Na-Heparin) abgenommen wurde. Dieser Zyklus wurde zweimalig wiederholt. Kein Tier befand sich zum Zeitpunkt der Probenentnahme in Laktation. Während der Blutentnahme ließen sich vorberichtlich und makroskopisch keine Hinweise auf eine Erkrankung erkennen. Aus dem Blut isolierte mononukleäre Zellen wurden mittels Membranimmunfluoreszenz phänotypisiert und quantifiziert (s. u.). Dabei wurden trächtige Tiere mit Tieren, bei denen eine Trächtigkeit ausblieb, hinsichtlich einer Variation innerhalb mononukleärer Zellpopulationen und Zellsubpopulationen verglichen. Diese Tiergruppe war Teil eines Versuches, der derzeit im
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Rahmen des EU-Projektes IPUD (integrated project of uterine disease) in der Klinik für Rinder stattfindet.
3.1.3 Gesunde Kühe im peripartalen Zeitraum
Diese Tiere (n=14) stammten aus dem Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Allen Tieren wurde zwischen Tag 45 und Tag 55 nach der Geburt 30 ml Blut und eine Biopsieprobe des Uterus entnommen. Zum Zeitpunkt der Probennahme wiesen diese Tiere weder Anzeichen einer klinischen Allgemeinerkrankung noch Anzeichen einer Erkrankung des Uterus, wie eitrigen Ausfluss, Schwellung oder Rötung der Schleimhaut auf. Die klinische Untersuchung wurde durch eine mikrobiologische, zytologische sowie pathohistologische Untersuchung, die vom Institut für Veterinär-Pathologie der Universität Leipzig durchgeführt wurde, unterstützt. Diese Tiergruppe wurde gewählt, um Unterschiede in der Zusammensetzung und Funktion der Leukozytenpopulationen im Uterusgewebe und peripheren Blut im Vergleich zu klinisch oder subklinisch an Endometritis erkrankten Tieren zu verdeutlichen.
3.1.4 Kühe mit postpartaler klinischer Endometritis/Metritis
Weiterhin wurden vier Tiere, die in der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus verschiedenen Gründen im Zeitraum bis 21 Tage p. p. euthanasiert wurden, beprobt. Die Kühe wiesen sowohl Merkmale einer klinischen Allgemeinerkrankung als auch Anzeichen einer akuten Entzündung der Gebärmutter wie übelriechenden, purulenten Ausfluss auf. Die pathologischen Veränderungen nach der Entnahme des Uterus zeigten ein entzündliches Geschehen. In allen Fällen war die Gebärmutterwand stark verdickt, die Schleimhaut gerötet oder bräunlich verfärbt und reichlich grau-braunes, stinkendes Sekret durchsetzt mit nekrotischem Material im Uteruslumen vorhanden. Bei zwei von vier Tieren (Tier-Nr.: 795 und 773) wurden die Uteri gewogen, vermessen und das Sekret klassifiziert.
Von diesen Tieren wurde sowohl Blut (vor der Tötung) wie auch Gebärmuttergewebe von beiden Hörnern und dem Korpus entnommen.
3.1.5 Kühe mit subklinischer Endometritis
Die Kühe (n=8) stammten aus dem Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Den Kühen wurde zwischen dem 45. und 55.Tag nach der Geburt Blut
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und eine Biopsieprobe entnommen. Zum Zeitpunkt der Probenentnahme wiesen diese Tiere weder Anzeichen einer klinischen Allgemeinerkrankung noch Anzeichen einer Erkrankung des Uterus wie eitrigen Ausfluss, Schwellung oder Rötung der Schleimhaut auf. Die klinische Untersuchung wurde durch eine mikrobiologische sowie zytologische Untersuchung mittels Ausstrich einer Cytobrush-Bürste auf einem Objektträger, welcher gefärbt wurde, unterstützt.
Die histologische Diagnose einer subklinischen Entzündung des Endometriums wurde zudem im Institut für Veterinär-Pathologie der Universität Leipzig gestellt (s. o.). Diese Tiergruppe wurde gewählt, um Zellen des Blutes und des uterinen Gewebes phänotypisch und quantitativ zu charakterisieren und mit denen uterusgesunder und klinisch erkrankter Tiere zu vergleichen.
3.1.6 Probennahme
Tiere aus dem Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden in dem Zeitraum 45 bis 55 Tage p. p. in einem Klauenpflegestand fixiert und klinisch allgemein untersucht. Weiterhin wurden die Kühe mithilfe eines Spekulums auf die Uterusgesundheit untersucht. Dabei wurde die Farbe und Beschaffenheit der Schleimhaut und des Sekretes sowie der Schließungsgrad des äußeren Gebärmuttermundes beurteilt. Weiterhin wurde eine Sonographie der Eierstöcke und der Gebärmutter durchgeführt, um den Zyklusstand der Tiere wie auch eventuelle pathologische Veränderungen zu ermitteln. Die klinischen Befunde wurden in den für die Untersuchung angefertigten Befundbögen vermerkt.
Des Weiteren wurden Cytobrush-Proben entnommen. Dazu wurde das Cytobrush-Bürstchen (9.2.1) auf 5 cm gekürzt und auf einen dünnen Metallstab geschraubt. Danach wurde es steril in einem autoklavierten Metallrohr (9.2.1) durch die Cervix in den Uterus eingeführt, dort aus dem Rohr hervorgeschoben und kräftig durch eine Drehbewegung über das Endometrium gestrichen. Anhaftende Zellen und Sekret wurden auf einem autoklavierten Objektträger (9.2.2) ausgestrichen und mit einer modifizierten Romanowsky-Färbung (9.2.3) gefärbt. Das Bürstchen selbst wurde in ein Probengefäß mit Amies-Medium sowie Kohle (9.2.2) eingetaucht, um zu einem späteren Zeitpunkt mikrobiologisch auf das Vorhandensein uterusrelevanter Keime untersucht zu werden. Außerdem wurden den Tieren jeweils zwei Biopsieproben mithilfe einer Biopsiezange (9.2.1) aus dem größeren, ehemals tragenden, Gebärmutterhorn entnommen. Eine der Gewebeproben wurde in Formol nach LILLIE (9.2.4)
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fixiert und in das Institut für Veterinär-Pathologie nach Leipzig versandt, um dort histologisch untersucht zu werden. Die zweite Probe wurde mit einem Skalpell in 2 Hälften geteilt, wobei eine Hälfte vorerst auf Trockeneis zum Transport schockgefroren wurde. Die Proben wurden unmittelbar nach Ankunft bei – 80°C gelagert, um die im Gewebe enthaltene RNA vor Degradation zu schützen. Die andere Hälfte wurde im Hinblick auf eine immunhistologische Analyse 48 h in Formol nach LILLIE fixiert.
Unmittelbar nach der Euthanasie wurde den Tieren aus der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover (Kühe mit postpartaler klinischer Endometritis/Metritis) der Uterus mithilfe eines scharfen Messers (9.1) entnommen. Pathologische Befunde nach Begutachtung der Uteri dieser Kühe wurden protokolliert. Die Uteri der im Schlachthof getöteten Tiere wurden vom Band entnommen. Geltend für beide Tiergruppen wurden mit dem Skalpell (9.2.1) Teile der Uteruswand aus den Bereichen Korpus, linkes und rechtes Horn herausgeschnitten. Diese Gewebestücke hatten eine Größe von etwa 3 cm x 3 cm x 2,5 cm. Es wurde darauf geachtet, dass beim Herausschneiden alle drei Schichten (Endometrium, Myometrium und Tunica adventitia) in situ erhalten blieben. Die Gewebeproben wurden dann für mindestens 48 h in vorbereitete Gläser mit neutral gepuffertem Formol nach LILLIE gegeben und beschriftet. Zudem wurden Gewebeproben, die zur Genexpressionsanalyse vorgesehen waren, zügig nach der Entnahme mit Parafilm (9.2.2) und Aluminiumfolie (9.2.2) umwickelt, zum Transport auf Trockeneis schockgefroren und unmittelbar nach Ankunft bei -80°C gelagert.
Weiterhin wurde allen Tieren mit Ausnahme der Tiere, welche im Schlachthof Lübbecke geschlachtet wurden, unter Zuhilfenahme eines Vacutainersystems (9.2.1) jeweils etwa 90mL Blut abgenommen. Davon wurden 20 mL mit Na-Heparin gerinnungsgehemmtem Blut für eine Membranimmunfluoreszenz von Immunzellen verwendet. Nicht gerinnungsgehemmtes Blut (30 mL) diente der Gewinnung von Serum, 30 mL mit EDTA gerinnungsgehemmtes Blut der Gewinnung von Plasma sowie 10 mL Blut, welches in PAXgene-Blutröhrchen (9.2.1) entnommen wurde, wurde zur mRNA-Analyse des Gesamtblutes verwendet.
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