Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
– Milchhygiene –
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Einfluss von Magermilch auf phänotypische und funktionelle Eigenschaften boviner Blutleukozyten
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Astrid Sulzer
aus Ostfildern-Ruit
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Jörn Hamann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Jörn Hamann
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Martina Hoedemaker
Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2005
Diese Arbeit wurde dankenswerterweise durch Mittel der Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH gefördert.
Für meine Eltern und Großeltern In Liebe und Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
Astrid Sulzer: Einfluss von Magermilch auf phänotypische und funktionelle Eigenschaften boviner Blutleukozyten
1 Einleitung ...1
2 Literatur ...3
2.1 Mastitis ... 3
2.1.1 Ursache ... 3
2.1.2 Definition ... 4
2.1.3 Verlaufsformen ... 5
2.1.4 Verfahren zum Entzündungsnachweis ... 5
2.1.4.1 Somatische Zellen (SCC) ...5
2.1.4.2 Elektrische Leitfähigkeit ...8
2.1.4.3 NAGase ...9
2.2 Abwehr im Euter ... 9
2.2.1 Zelluläre Abwehr im Euter ... 10
2.2.1.1 Zellarten...10
2.2.1.2 Zelldifferentialbild...11
2.2.1.3 PMN...12
2.2.1.4 Makrophagen...13
2.2.1.5 Lymphozyten ...13
2.2.2 Humorale Abwehr im Euter... 14
2.2.2.1 Mediatoren (Zytokine)...14
2.2.2.2 Opsonine ...16
2.2.2.3 Lösliches CD14...17
2.3 Phänotypische und funktionelle Eigenschaften boviner PMN... 18
2.3.1 Phänotyp und Oberflächenantigene ... 18
2.3.2 Pathogenabwehr durch PMN ... 19
2.3.2.1 Margination...19
2.3.2.2 Migration...20
2.3.2.3 Phagozytose...20
2.3.2.4 Respiratory burst und Degranulation ...21
2.4 Vergleich der Funktionalität von Blut- und Milchzellen ... 22
2.4.1 Unterschiede der Zellfunktionalitäten von Blut- und Milchzellen... 22
2.4.2 Einfluss von Mastitiden auf Zellfunktionalität von Blut- und Milchzellen ... 23
2.4.3 Einfluss von Frühlaktation und Stoffwechsel auf Zellfunktionalität von PMN aus Blut und Milch ... 25
2.5 Magermilch... 26
2.5.1 Magermilch- und Milchserumgewinnung ... 26
2.5.2 Zellgehalt in Magermilch ... 29
2.5.3 Milchoriginäre Einflussfaktoren auf funktionelle und phänotypische Eigenschaften boviner PMN ... 29
2.5.3.1 Casein ...29
2.5.3.2 Laktoferrin...30
2.5.3.3 Lysozym ...30
2.5.3.4 Lactoperoxidase ...31
2.5.4 Änderung der Funktionalität boviner Blutleukozyten nach Inkubation in Milch ... 31
2.5.4.1 Lymphozytenproliferation...31
2.5.4.2 Expression von Oberflächenantigenen ...32
2.5.4.3 Zytotoxizität ...32
2.5.4.4 Phagozytose...32
2.5.4.5 Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen ...34
2.6 Labordiagnostische Methoden... 34
2.6.1 Zellisolation aus Blut... 34
2.6.1.1 Leukozyten ...34
2.6.1.2 PMN...36
2.6.2 Zelldifferentialbild... 37
2.6.2.1 Mikroskopische Zelldifferenzierung...37
2.6.2.2 Durchflusszytometrie ...38
2.6.3 Zellvitalität ... 39
2.6.3.1 Mikroskopische Bestimmung ...39
2.6.3.2 Durchflusszytometrie ...39
2.6.4 Phagozytoseaktivität ... 40
2.6.4.1 Durchflusszytometrie ...40
2.6.4.2 Szintillationsspektrometrie ...40
2.6.4.3 Kultivierung...41
2.6.5 Respiratory burst... 41
2.6.5.1 ROS-Bildung...41
2.6.5.2 Chemilumineszenz (CL) ...42
2.6.5.3 Nitroblau-Tetrazolium-Reduktionstest...43
2.7 Folgerungen und daraus abgeleitete Zielsetzung der eigenen Untersuchungen... 43
3 Material und Methoden...44
3.1 Versuchstiere ... 44
3.1.1 Betrieb 1 ... 44
3.1.2 Betrieb 2 ... 45
3.1.3 Tiere für die Blutentnahme ... 45
3.2 Material ... 45
3.2.1 Geräte ... 45
3.2.2 Glas- und Einmalartikel... 48
3.2.3 Reagenzien... 50
3.2.4 Medien, Puffer und Lösungen ... 53
3.2.4.1 Probenahme ...53
3.2.4.2 Allgemeine Probenanalyse ...53
3.2.4.3 Zellisolierung und Magermilchgewinnung...53
3.2.4.4 Durchflusszytometrie ...55
3.2.4.5 Membranimmunfluoreszenz ...55
3.2.4.6 Phagozytose...58
3.2.4.7 ROS...60
3.2.4.8 Chemilumineszenz ...61
3.3 Methoden ... 63
3.3.1 Probenahme ... 63
3.3.1.1 Entnahme ...63
3.3.2 Allgemeine Probenanalyse ... 64
3.3.2.1 Blut ...64
3.3.2.2 Milch ...65
3.3.3 Zellisolierung und Magermilchgewinnung ... 69
3.3.3.1 Blutzellen ...69
3.3.3.2 Milchzellen...70
3.3.3.3 Einstellung der Konzentration von Blut- und Milchzellsuspension ...71
3.3.3.4 Magermilchgewinnung...71
3.3.3.5 Caseinfällung mit Lab ...71
3.3.4 Durchflusszytometrie ... 72
3.3.4.1 Prinzip...72
3.3.4.2 Membranimmunfluoreszenz ...74
3.3.4.3 Phagozytose...81
3.3.4.4 Reaktive Sauerstoffmetaboliten (ROS)...85
3.3.5 Chemilumineszenz ... 89
3.3.5.1 Funktionsweise des Luminometers...89
3.3.5.2 Prinzip...89
3.3.5.3 Durchführung...90
3.3.5.4 CL mit Magermilch...91
3.3.5.5 Auswertung...91
3.4 Verlaufsuntersuchung... 92
3.4.1 Versuchstiere ... 92
3.4.2 Probenahmeraster ... 92
3.4.2.1 Proben ...92
3.5 Statistische Auswertungen... 92
4 Ergebnisse ...97
4.1 Versuch 1: Zellgehalt in Magermilch... 98
4.1.1 Bestimmung von Wiederholbarkeit und Präzision der Zellgehaltsbestimmung im DCC... 98
4.1.2 Vergleichende Bestimmung des Zellgehaltes aus Voll- und
Magermilch mit dem DCC und der Fossomatic ... 100
4.1.2.1 Zellgehalt in den Milchfraktionen ...101
4.1.2.2 Reduktion des Zellgehaltes von Vollmilch zu Magermilch ...103
4.1.2.3 Methodenvergleich DCC und Fossomatic ...104
4.2 Versuch 2: Einfluss von Magermilch auf Oberflächenantigene boviner Blutleukozyten... 104
4.2.1 Methodische Versuche... 104
4.2.1.1 Expression verschiedener Oberflächenantigene nach Inkubation in Magermilch ...105
4.2.1.2 Wiederholbarkeit...109
4.2.1.3 PMN und Gesamtleukozyten ...111
4.2.1.4 Einfrieren ...112
4.2.2 Zellgehaltsgruppen... 113
4.2.3 Nachgemelke... 114
4.2.4 Vergleich der Expression der von IL-A110 erkannten Oberflächenstruktur auf Blut- und Milchzellen ... 115
4.3 Versuch 3: Einfluss von Magermilch auf die Phagozytosekapazität boviner Blut-PMN ... 117
4.3.1 Methodische Versuche... 117
4.3.1.1 Vergleich verschiedener Phagozytosetechniken ...117
4.3.1.2 Wiederholbarkeit und Präzision ...120
4.3.1.3 Magermilchverdünnungen ...122
4.3.2 Kuhvergleich ... 123
4.3.3 Zellgehaltsgruppen... 124
4.4 Versuch 4: Einfluss von Magermilch auf den Respiratory burst boviner Blut-PMN... 126
4.4.1 Chemilumineszenz (CL) ... 126
4.4.1.1 Methodische Versuche ...126
4.4.1.2 Zellgehaltsgruppen ...131
4.4.1.3 Nachgemelke...132
4.4.2 ROS... 133
4.4.2.1 Methodische Versuche ...133
4.4.2.2 Zellgehaltsgruppen ...138
4.5 Versuch 5: Verlaufsuntersuchung ... 141
4.5.1 Eutergesundheit ... 141
4.5.2 Eutergesunde Viertel... 145
4.5.2.1 Eutergesundheitsparameter ...146
4.5.2.2 Expression von IL-A110...148
4.5.3 Euterkranke Viertel ... 149
4.5.3.1 Eutergesundheitsparameter ...150
4.5.3.2 Expression von IL-A110...154
4.5.3.3 Signifikanzen ...156
5 Diskussion...159
5.1 Versuch 1: Zellgehalt in Magermilch... 159
5.1.1 Wiederholbarkeit und Präzision ... 159
5.1.2 Vergleichende Bestimmung des Zellgehaltes aus Voll- und Magermilch mit dem DCC und der Fossomatic ... 161
5.1.2.1 Zellgehalt in den Milchfraktionen ...161
5.1.2.2 Reduktion des Zellgehaltes von Vollmilch zu Magermilch ...162
5.1.2.3 Methodenvergleich ...163
5.2 Versuch 2: Einfluss von Magermilch auf Oberflächenantigene boviner Blutleukozyten... 164
5.2.1 Methodische Versuche... 164
5.2.1.1 Expression verschiedener Oberflächenantigene ...164
5.2.1.2 Wiederholbarkeit und Präzision ...165
5.2.1.3 PMN und Gesamtleukozyten ...166
5.2.1.4 Einfrieren ...166
5.2.1.5 Zusammenfassende Beurteilung der Vorversuche ...166
5.2.2 Zellgehaltsgruppen... 167
5.2.3 Nachgemelke... 167
5.2.4 Expression von IL-A110 auf Blut- und Milchzellen ... 168
5.2.5 Folgerungen ... 169
5.3 Versuch 3: Einfluss von Milch auf die
Phagozytosekapazität boviner Blut-PMN ... 170
5.3.1 Methodische Versuche... 170
5.3.1.1 Phagozytosetechniken...170
5.3.1.2 Wiederholbarkeit und Präzision ...172
5.3.1.3 Magermilchverdünnung ...173
5.3.1.4 Zusammenfassende Beurteilung der Vorversuche ...173
5.3.2 Kuhvergleich ... 173
5.3.3 Zellgehaltsgruppen... 174
5.3.4 Folgerungen ... 175
5.4 Versuch 4: Einfluss von Magermilch auf den Respiratory burst boviner Blut-PMN... 176
5.4.1 Chemilumineszenz ... 176
5.4.1.1 Methodische Versuche ...176
5.4.1.2 Zellgehaltsgruppen ...179
5.4.1.3 Nachgemelke...179
5.4.2 ROS... 180
5.4.2.1 Methodische Versuche ...180
5.4.2.2 Zellgehaltsgruppen ...181
5.4.3 Vergleich der Methoden zur Messung des Respiratory burst ... 182
5.5 Versuch 5: Verlaufsuntersuchung ... 182
5.5.1 Eutergesundheit ... 182
5.5.2 Eutergesunde Viertel... 182
5.5.2.1 Eutergesundheitsparameter ...182
5.5.2.2 Inkubationsversuche...183
5.5.3 Euterkranke Viertel ... 183
5.5.3.1 Eutergesundheitsparameter ...184
5.5.3.2 Inkubationsversuche...185
5.5.4 Folgerungen ... 186
5.6 Folgerungen der eigenen Untersuchungen ... 186
6 Zusammenfassung ...187
7 Summary ...190
8 Literaturverzeichnis...193
9 Tabellenanhang ...224
Abbildungsverzeichnis
Abb. 3-1 Fluoreszenz von spezifischem Antikörper und Isotypkontrolle ...76
Abb. 3-2 Ermittlung des Anteils fluoreszenzpositiver Zellen...78
Abb. 3-3 Ermittlung der mittleren Fluoreszenzintensität...80
Abb. 3-4 Ermittlung der Phagozytosekapazität ...84
Abb. 3-5 Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies...88
Abb. 4-1 Expressionsdichte von IL-A110 auf bovinen Blut-PMN einer Kuh nach Inkubation in 10 Magermilchproben und Nährmedium...105
Abb. 4-2 Expressionsdichte von Bo116 auf bovinen Blut-PMN einer Kuh nach Inkubation in 10 Magermilchproben und Nährmedium ...106
Abb. 4-3 Expressionsdichte von CD11b auf bovinen Blut-PMN einer Kuh nach Inkubation in 10 Magermilchproben und Nährmedium ...107
Abb. 4-4 Expressionsdichte von Bo139 auf bovinen mononukleären Zellen einer Kuh nach Inkubation in 10 Magermilchproben und Nährmedium ..107
Abb. 4-5 Anteil Bo139 exprimierender mononukleärer Zellen einer Kuh nach Inkubation in 10 Magermilchproben und Nährmedium ...108
Abb. 4-6 Expressionsdichte von CD4 und CD8 auf bovinen mononukleären Zellen einer Kuh nach Inkubation in 10 Magermilchproben und Nährmedium ...109
Abb. 4-7 Relative MFI von IL-A110 auf Blut-PMN nach Inkubation in Magermilch aus verschiedenen Zellgehaltsgruppen...114
Abb. 4-8 Expressionsdichte von IL-A110 auf Blut- und Milch-PMN (3 Kühe) ...116
Abb. 4-9 Expressionsdichte von IL-A110 auf Milch-PMN aus 20 Vierteln mit unterschiedlichem Zellgehalt ...117
Abb. 4-10 Relativer Anteil phagozytierender PMN und deren MFI in Ansatz 1 (Waschen), PMN einer Kuh, 20 Magermilchproben...118
Abb. 4-11 Relativer Anteil phagozytierender PMN und deren MFI in Ansatz 2 (Präinkubation der Zellen), PMN einer Kuh, 20 Magermilchproben...118
Abb. 4-12 Relativer Anteil phagozytierender PMN und deren MFI in Ansatz 3 (Präinkubation der Bakterien), PMN einer Kuh, 20 Magermilchproben ..119
Abb. 4-13 Relativer Anteil phagozytierender PMN und deren MFI nach Inkubation in 20 Magermilchproben in verschiedenen Verdünnungen, PMN von zwei Kühen ...122
Abb. 4-14 Relativer Anteil aktiver Phagozyten an den PMN und MFI nach Inkubation in 20 Magermilchproben, PMN von neun Kühen...123
Abb. 4-15 Relativer Anteil phagozytierender PMN nach Inkubation in 40
Magermilchproben, PMN von vier Kühen ...125 Abb. 4-16 Relative MFI der PMN nach Inkubation in 40 Magermilchproben,
PMN von vier Kühen...125 Abb. 4-17 CL von PMN einer Kuh in 20 Magermilchproben und von Magermilch...127 Abb. 4-18 Relative CL von PMN einer Kuh in Magermilch und labgefällter
Magermilch (20 Magermilchproben) ...129 Abb. 4-19 CL von PMN von 2 Kühen in 2 Magermilchproben nach
Zentrifugation oder Labfällung ...130 Abb. 4-20 CL von PMN einer Kuh in 20 Magermilchproben: Labfällung oder
Präinkubation und Waschen der Platte...131 Abb. 4-21 Relative CL von PMN von vier Kühen mit 40 Magermilchproben ...132 Abb. 4-22 ROS-Bildung von PMN in Nährmedium oder Magermilch (Wasch-
Technik), PMN von 2 Kühen, 10 Magermilchproben ...134 Abb. 4-23 ROS-Bildung von PMN in Nährmedium oder Magermilch (Standard-
Technik), PMN von 2 Kühen, 10 Magermilchproben ...134 Abb. 4-24 ROS-Bildung von PMN in Nährmedium oder Magermilch (Schnell-
Technik), PMN von 2 Kühen, 10 Magermilchproben ...135 Abb. 4-25 ROS-Bildung von PMN von 4 Kühen nach Inkubation in 40
Magermilchproben ...139 Abb. 4-26 ROS-Bildung von PMN von 3 Kühen nach Inkubation in Magermilch...140 Abb. 4-27 Zellgehalt im VAG im Laktationsverlauf von 23 gesunden
Eutervierteln ...146 Abb. 4-28 Verteilung der Zellarten im Kieler Sedimentausstrich in der Milch von
23 gesunden Eutervierteln, dargestellt in Laktationswochen ...148 Abb. 4-29 Relative Expressionsdichte von IL-A110 auf Blut PMN nach
Inkubation in Magermilch aus 23 eutergesunden Vierteln, dargestellt
nach Laktationswochen ...149 Abb. 4-30 Mikroskopisches Zelldifferentialbild, Studie 1 (Neuerkrankung) nach
Beobachtungswochen ...153 Abb. 4-31 Mikroskopisches Zelldifferentialbild, Studie 2 (Heilung) nach
Beobachtungswochen ...154 Abb. 4-32 Relative Expressionsdichte von IL-A110 auf PMN nach Inkubation in
Magermilch, aufgeteilt nach Beobachtungswochen, Studie 1
(Neuerkrankung)...155 Abb. 4-33 Relative Expressionsdichte von IL-A110 auf PMN nach Inkubation in
Magermilch, aufgeteilt nach Beobachtungswochen, Studie 2
(Heilung) ...155
Tabellenverzeichnis
Tab. 2-1 Beurteilung zytologisch-mikrobiologischer Befunde im Rahmen der
Mastitis-Kategorisierung ...4
Tab. 2-2 Morphologie von Milchzellen (nach SCHRÖDER 2003) ...11
Tab. 2-3 Mikroskopisches Zelldifferentialbild in Milch einer gesunden Milchdrüse ...12
Tab. 2-4 Vorkommen von Zytokinen in Kolostrum (Kol.), Milch gesunder (ges.) und erkrankter (er.) Euterviertel (EV)...15
Tab. 2-5 Methoden der Milchserumgewinnung ...26
Tab. 2-6 Methoden der Magermilchgewinnung...28
Tab. 2-7 Einfluss von Fett und Casein auf die Phagozytosekapazität von PMN...33
Tab. 2-8 Methoden der Leukozyten-Gewinnung aus bovinen Vollblutproben ...35
Tab. 2-9 Methoden der PMN-Gewinnung aus bovinen Vollblutproben ...36
Tab. 3-1 An bovine Leukozyten bindende monoklonale Antikörper ...56
Tab. 3-2 Isotypkontrollen...57
Tab. 3-3 Eingesetzte Sekundärantikörper...57
Tab. 3-4 Probengewinnung, –lagerung und –untersuchung ...65
Tab. 3-5 Überblick über das Volumen verwendeter Antikörper...75
Tab. 3-6 Fluoreszenz von spezifischem Antikörper und Isotypkontrolle ...77
Tab. 3-7 Anteil fluoreszenzpositiver Zellen und deren MFI ...79
Tab. 3-8 Mittlere Fluoreszenzintensität ...81
Tab. 3-9 Phagozytosekapazität: Anteil aktiver PMN und deren MFI ...85
Tab. 3-10 ROS von PMN ...89
Tab. 3-11 Berechnungen ...93
Tab. 4-1 Zellgehaltsklassen der Vollmilchproben (VAG)...98
Tab. 4-2 Mittelwert, Standardabweichung und VK für die Zellgehaltsbestimmung im DCC aus 10 VGH, je 10 Wiederholungen ...99
Tab. 4-3 Mittelwert, Standardabweichung und VK für die Zellgehaltsbestimmung im DCC aus 6 Magermilchproben ...100
Tab. 4-4 Einteilung der Proben in Zellgehaltsklassen (VAG, Foss) ...101
Tab. 4-5 Vergleich der Mittelwerte von log10 der Zellzahl in den Zellgehaltsklassen im DCC und der Fossomatic ...102
Tab. 4-6 Mittelwert und Standardabweichung der durchschnittlichen Anzahl von benötigten Messkassetten pro Probe zur Zellgehaltsbestimmung im DCC ...102 Tab. 4-7 Signifikanzen für den Vergleich VGH – Magermilch in
Zellgehaltsgruppen ...103 Tab. 4-8 Einfluss der Zellgehaltsklasse des VAG auf den log10 des
Zellgehaltes der Magermilch...103 Tab. 4-9 Signifikanzen für den Vergleich DCC und Fossomatic in
Zellgehaltsgruppen ...104 Tab. 4-10 Mittelwerte, Standardabweichung und Signifikanzen der relativen
MFI zwischen den Versuchstagen, PMN einer Kuh, 20
Magermilchproben ...110 Tab. 4-11 Mittelwert, Standardabweichung und Variationskoeffizient der
Wiederholungsmessung der MFI von IL-A110 auf PMN nach
Inkubation in Magermilch, PMN einer Kuh...111 Tab. 4-12 Mittelwerte, Standardabweichung und Signifikanzen der relativen
MFI von IL-A110 zwischen auf Gesamtleukozyten und PMN von 2
Kühen nach Inkubation in 20 Magermilchproben...112 Tab. 4-13 Mittelwerte, Standardabweichung und Signifikanzen zwischen
eingefrorener und frisch aufgetauter Platte, Leukozyten einer Kuh ...113 Tab. 4-14 Zellgehaltsgruppen für die Bestimmung von IL-A110 auf Blut-PMN
nach Inkubation in Magermilch ...113 Tab. 4-15 Mittelwerte, Standardabweichung und Signifikanzen der Parameter
zwischen den Gemelksfraktionen ...115 Tab. 4-16 Zellgehaltsgruppen für die Bestimmung von IL-A110 auf Milchzellen...116 Tab. 4-17 Signifikanzen zwischen den verschiedenen Phagozytosetechniken,
PMN einer Kuh, 20 Magermilchproben...120 Tab. 4-18 Mittelwert, Standardabweichung und Variationskoeffizient der
Wiederholungsmessung für die Bestimmung der
Phagozytosekapazität...121 Tab. 4-19 Mittelwert, Standardabweichung und Variationskoeffizient der
Phagozytosekapazität über die PMN von 9 Kühen...124 Tab. 4-20 Zellgehaltsgruppen für die Phagozytose...124 Tab. 4-21 Signifikanzen des relativen Anteils phagozytierender PMN und der
relativen MFI zwischen den Zellgehaltsgruppen, PMN von 4 Kühen...126 Tab. 4-22 Mittelwert, Standardabweichung und Variationskoeffizient der
Wiederholungsmessung der CL von PMN mit Magermilch...128 Tab. 4-23 Zellgehaltsgruppen für die CL von PMN in Magermilch...131
Tab. 4-24 Mittelwerte, Standardabweichung und Signifikanzen der Parameter
zwischen den Gemelksfraktionen ...133
Tab. 4-25 Signifikanzen zwischen den verschiedenen ROS-Techniken, nach PMA-Konzentrationen getrennt, PMN von 3 Kühen...136
Tab. 4-26 Mittelwert, Standardabweichung und Variationskoeffizient der Wiederholungsmessung der ROS-Bestimmung von PMN einer Kuh nach Inkubation in Magermilch ...137
Tab. 4-27 Wiederholbarkeit der ROS-Bestimmung an verschiedenen Tagen...138
Tab. 4-28 Zellgehaltsgruppen für die ROS-Versuche ...138
Tab. 4-29 Zellgehaltsgruppen für die ROS-Versuche ...140
Tab. 4-30 Laktationsnummern der Tiere auf den Betrieben Ruthe und Meldau...141
Tab. 4-31 DVG-Diagnosen aller Viertel in den ersten 10 Laktationswochen ...142
Tab. 4-32 Kategorisierung der Eutergesundheit auf Viertelebene nach DVG (1994) ...145
Tab. 4-33 Einteilung der Daten der gesunden Viertel nach Laktationswochen (W)...145
Tab. 4-34 Entzündungsparameter im Laktationsverlauf von 23 gesunden Eutervierteln ...147
Tab. 4-35 Zuordnung der Beobachtungswochen und Anzahl erkrankter Euterviertel in den verschiedenen Studien nach Mastitiskategorien getrennt ...150
Tab. 4-36 Eutergesundheitsparameter und Laktationstage im Verlauf von Studie 1 ...151
Tab. 4-37 Eutergesundheitsparameter im Verlauf von Studie 2...152
Tab. 4-38 Signifikanzen der einzelnen Wochendifferenzen für Eutergesundheits- und Inkubationsparameter, Studie 1 (Neuerkrankung in B1.4)...157
Tab. 4-39 Signifikanzen der einzelnen Wochendifferenzen für Eutergesundheits- und Inkubationsparameter, Studie 2 (Heilung in B2.2) ...158
Tab. 5-1 Variationskoeffizienten der Zellgehaltsbestimmung im DCC, Vergleich DeLaval – Sulzer ...160
Tab. 5-2 Vergleich des Zellgehaltes in der Magermilch ...162
Tab. 5-3 Vergleich der Methoden PAAPE – Sulzer: Bestimmung der Phagozytosekapazität von PMN nach Inkubation in Milchbestandteilen ...171
Tab. A-1 SCC in 1000/ml im Verlauf der Frühlaktation...224
Tab. A-2 eLF in mS/cm im Verlauf der Frühlaktation...226 Tab. A-3 NAGase in nmol x ml-1 x min-1 im Verlauf der Frühlaktation ...228 Tab. A-4 relative MFI IL-A110 im Verlauf der Frühlaktation ...230
Abkürzungsverzeichnis
% PMN n Prozentsatz aktiver Zellen der nicht opsonisierten Proben bei der Phagozytose
% PMN o Prozentsatz aktiver Zellen der opsonisierten Proben bei der Phagozytose
2 x PBS doppelt konzentriertes PBS A. monodest. Aqua monodestillata
A. tridest. Aqua tridestillata
Abb. Abbildung AK Antikörper AO Akridinorange
B Beobachtungswoche
BAL Bronchoalveoläre Lavage
Bo116, Bo139 Bezeichnung für subklonierte Hybridome und die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper
BSA Bovines Serumalbumin
C Komplementkomponente
CAT Clot Activator
CCD (Charged Coupled Devices) ladungsgekoppeltes Bauelement
CD Cluster of differentiation, System zur Bezeichnung zellulärer Differenzierungsantigene
CL Chemilumineszenz CL-Aktivität CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
CMFDA Carboxydimethylfluoresceindiacetat CR Komplement-Rezeptor
DCC DeLaval Zellzahl-Messgrät DCC®
DCF Dichlorofluorescin DCFH 2´,7´-dichlorofluorescin
DCFH-DA 2´,7´-dihydrochlorofluoreszindiacetat DHE Dihydroethidium
DHR Dihydrorhodamin 123
DICC Differential inflammatory cell count DMSO Dimethylsulfoxid
Priorität Desoxyribonucleinsäure
DPBS Dulbecco´s PBS
DVG Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft E. Escherichia
E. coli Escherichia coli
EB Ethidiumbromid EDTA Ethylendiamintetetraessigsäure
EGF Epidermal Growth Factor
eLF elektrische Leitfähigkeit in mS / cm EPI Epithelzellen er. Erkrankt EV Euterviertel
FACSCalibur Durchflusszytometer der Firma Becton Dickinson Fc-Rezeptor Rezeptor für den Fc-Teil eines Antikörpers
FCS Fetales Kälberserum
FITC Fluoresceinisothiocyanat FL 1-4 Detektoren des Durchflusszytometers
Foss Fossomatic®
FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht)
G-CSF Granulozyten Wachstumsfaktor
ges. gesund
GM-CSF Granulozyten-Makrophagen-Wachstumsfaktor h Stunde
HBSS Hanks Balanced Salt Solution IDF International Dairy Federation IFN Interferon
Ig Immunglobulin IGF Insulin Like Growth Faktor
IL Interleukin
IL-A110 Bezeichnung für Hybridzellklone und die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper
KNS Koagulase-negative Staphylokokken
Kol. Kolostrum
LBP LPS-bindendes Protein
LEDs Licht emittierende Dioden
lg Logarithmus zur Basis 10
LI Latente Infektion
LPS Lipopolysaccharid LYM Lymphozyten M molare MA Mastitis MAK Makrophagen
mAK monoklonale Antikörper
MDM Monocyte Derived Macrophages
MFI Mittlere Fluoreszenzintensität
MFI n mittlere Fluoreszenzintensität (geometrisches Mittel) der nicht opsonisierten Proben bei der Phagozytose
MFI o mittlere Fluoreszenzintensität (geometrisches Mittel) der opsonisierten Proben bei der Phagozytose
MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
MIF Membranimmunfluoreszenz min Minuten
MLP Milchleistungsprüfung MM Magermilch
mS Milli-Siemens
n Stichprobengröße
n Nicht opsonisiert
NAGase N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase
NK-Zellen Natürliche Killerzellen
ns nicht signifikant
o opsonisiert
p.p. Post partum
PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PE Phycoerythrin PJ Propidiumjodid
PMA Phorbol-Myristat-Acetat PMN Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
R10F+ Zellkulturmedium RPMI 1640 mit L-Glutamin, HEPES- Puffer und NaHCO3 mit Zusatz von Penicillin,
Streptomycin und 10 % FCS
RLU Relative Light Units
ROS Reaktive Sauerstoffspezies
S. Staphylococcus S. Streptococcus S. aureus Staphylococcus aureus
SCC Somatic Cell Count: Anzahl somatischer Zellen / ml Milch
sCD14 Lösliches CD14
sd Standardabweichung spp. Spezies
SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht) Tab. Tabelle
TGF Transforming Growth Factor
TNF Tumornekrose-Faktor TSP Tryptische Soja Boullion
u.a. Unter anderem
UV Ultraviolett
VAG Viertelanfangsgemelk
VGH Viertelgemelk Hand
Vk Variationskoeffizient VL Euterviertel vorne links
VNG Viertelnachgemelk VR Euterviertel vorne rechts
VVG Viertelvorgemelk W Laktationswochen WBC Leukozytenzahl in 106/ml
x g Vielfaches der Erdbeschleunigung
arithmetischer Mittelwert
Zeichenerklärung
< kleiner
> größer
≤ kleiner gleich
≥ größer gleich
% prozentuale Bindungsrate (Durchflusszytometrie) + positiv = Antigen auf der Zelloberfläche nachgewiesen - negativ = Antigen auf der Zelloberfläche nicht
nachgewiesen
* p < 0,05
** p < 0,01
*** p < 0,001
1 Einleitung
Mastitiden stellen weltweit den ökonomisch bedeutungsvollsten Krankheitskomplex der bovinen Milchdrüse dar. Eine möglichst unmittelbare Erfassung subklinischer Mastitiden ist Voraussetzung für langfristige ökonomisch vertretbare Verbesserungen der Eutergesundheit. Der Bekämpfungserfolg dieser multifaktoriellen Infektions- krankheit ist bisher nur mäßig, Gründe sind vor allem die schwierige Diagnostik subklinischer Mastitiden, aber auch prädisponierende Einflüsse, wie Leistungshöhe, Melktechnik und ganzjährige Stallhaltung. Aufgrund der steigenden Bedeutung der Lebensmittelsicherheit ist es wünschenswert, anstelle einer antibiotischen Mastitistherapie die körpereigene Abwehr im Euter zu unterstützen.
Es ist bekannt, dass Milchleukozyten gegenüber Blutleukozyten eine geringere funktionelle Kapazität besitzen. Abwehrzellen erreichen nach Passage der Blut- Euter-Schranke das Kompartiment der Milch. Hier treffen sie bei einem niedrigen pH- Wert auf hohe Konzentrationen an Fett, Protein, Laktose und Mineralstoffen und auf immunologisch wirksame Bestandteile wie Antikörper, Zytokine, Komplementfaktoren und Prostaglandine. Die funktionellen Eigenschaften der Abwehrzellen werden durch die Milchinhaltsstoffe beeinflusst. PMN phagozytieren z.B. Fettkügelchen und verlieren so Abwehrpotential gegen eindringende Mikroorganismen.
Um zu effizienten Mastitis-Therapieformen zu gelangen, die sich auf die Unterstützung körpereigener Abwehrprozesse richten, ist es notwendig, die Regulation von PMN während und nach ihrer Wanderung aus dem Blut in die Milch sowie ihre funktionellen und phänotypischen Eigenschaften zu kennen. Die Inkubation von Blutleukozyten in Magermilch bietet die Möglichkeit, den Einfluss der Milch auf funktionelle und phänotypische Parameter der Abwehrzellen in vitro genauer zu untersuchen.
Vor diesem Hintergrund wurden mir im Rahmen der Mitarbeit in der Arbeitsgruppe Mastitis der AG Hygiene und Technologie der Milch des Institutes für Lebensmittelqualität und Sicherheit am Zentrum für Lebensmittelwissenschaften der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover folgende Aufgaben im Rahmen der Anfertigung meiner Dissertation übertragen:
1) Bestimmung des Zellgehaltes von Magermilch mit zwei verschiedenen Messverfahren
2) Etablierung der im Institut angewendeten funktionellen Analysen an die Inkubation von bovinen Blutleukozyten in Magermilch
3) Evaluierung und Interpretation der immunmodulierenden Wirkung von Magermilch auf bovine Blutleukozyten
Diese überwiegend laboranalytisch ausgelegten Fragestellungen wiesen nicht nur ein anspruchsvolles wissenschaftliches Niveau auf, sondern können auch zu einer Verbesserung der Diagnostik und evtl. Prävention subklinischer Mastitiden beitragen.
2 Literatur
2.1 Mastitis
Die Mastitis als infektiöse Erkrankung des Euters hat vielfältige Ursachen. Eine eindeutige Differenzierung zwischen gesund und krank ist für die bovine Milchdrüse ebenso wenig möglich, wie für jedes andere Organ. Es ist anzunehmen, dass es des Zusammenwirkens mehrerer auslösender Faktoren (infektiöses Agens, Stress, Haltungs- und Fütterungsmängel, mangelnde Melkhygiene etc.) bedarf, um eine Mastitis zu verursachen (TOLLE 1975; HAMANN u. FEHLINGS 2002).
Die Zusammensetzung der Milchinhaltsstoffe ändert sich während einer Mastitis.
Milchleistung und Fettgehalt sinken, auch die Konzentration von Elektrolyten verschiebt sich (KITCHEN 1981; GRABOWSKI 2000). Dies und der vorzeitige Abgang von erkrankten Tieren führt zu erheblichen wirtschaftlichen Einbußen in der Milchproduktion (HAMANN u. FEHLINGS 2002). Die Vermeidung von Mastitiden hat in der modernen Milchkuhhaltung oberste Priorität.
2.1.1 Ursache
Die Ursachen einer Mastitis sind vielfältig, häufig werden Bakterien nachgewiesen, aber auch Hefen und Pilze kommen in Betracht (TOLLE 1975).
Unter den bakteriellen Mastitiserregern zählen Staphylococcus (S.) aureus, Streptococcus (S.) agalactiae, S. dysgalactiae sowie Mycoplasma spp. zu den kuhassoziierten Keimen. Von Bedeutung als umweltassoziierte Erreger sind S. uberis, Enterococcus spp., Escherichia (E.) coli, Klebsiellen sowie sonstige Enterobacteriaceae (HAMANN u. FEHLINGS 2002). Als dritte Gruppe von Mastitiserregern werden zunehmend Koagulase-negative Staphylokokken (KNS) nachgewiesen (FEHLINGS 2001; SCHÄLLIBAUM 2001).
2.1.2 Definition
Eine Kategorisierung vier verschiedener Stadien der Eutergesundheit für die Beurteilung zytologisch-mikrobiologischer Befunde aus Viertelanfangsgemelken wurde von der DVG (1994) wie folgt vorgeschlagen (Tab. 2-1):
Tab. 2-1 Beurteilung zytologisch-mikrobiologischer Befunde im Rahmen der Mastitis-Kategorisierung
Euterpathogene Mikroorganismen Zellgehalt pro ml Milch
Nicht nachgewiesen Nachgewiesen
< 100.000 Normale Sekretion Latente Infektion
> 100.000 Unspezifische Mastitis Mastitis
Die Festlegung des Grenzwertes für die Zellzahl erfolgte durch Untersuchung des Zellgehaltes aus Viertelanfangsgemelken (VAG) ungeschädigter Euter von Erstkalbinnen (DOGGWEILER u. HESS 1983).
Gesunde Euterviertel mit normaler Sekretion zeigen keine äußerlichen pathologischen Veränderungen und ihre Milch weist keine euterpathogenen Mikroorganismen sowie einen normalen Zellgehalt auf.
Werden Mastitiserreger nachgewiesen, der Zellgehalt bewegt sich jedoch in der Norm, spricht man von einer latenten Infektion.
Eine unspezifische Mastitis liegt vor, wenn sich ein erhöhter Zellgehalt ergibt, ohne dass pathogene Bakterien nachgewiesen werden.
Es handelt sich um eine Mastitis, wenn gleichzeitig Mastitiserreger und erhöhte Zellgehalte in Viertelanfangsgemelken festgestellt werden.
2.1.3 Verlaufsformen
Euterentzündungen in Form einer unspezifischer Mastitis oder Mastitis treten in unterschiedlichen Verlaufsformen und in Verbindung mit verschiedenartigen klinischen Symptomen auf (HAMANN u. FEHLINGS 2002).
Subklinische Mastitiden sind Entzündungen des Euters ohne äußerlich erkennbare Symptome, sie zeichnen sich durch erhöhte Zellgehalte und einen bakteriologisch positiven Befund aus.
Klinische Mastitiden sind durch Entzündungssymptome wie Flocken in der Milch, Schwellung, Rötung, Schmerzhaftigkeit, Wärme des Euterviertels und evtl. Fieber gekennzeichnet. Der Milchcharakter kann völlig verloren gehen. Je nach Schwere wird zwischen gering-, mittel- und hochgradigen Mastitiden unterschieden.
Die zeitliche Dauer der Erkrankung wird durch die Begriffe subakut, akut und chronisch beschrieben.
2.1.4 Verfahren zum Entzündungsnachweis
Es gibt eine lange Reihe von Parametern, die sich in Milch im Zusammenhang mit einer Mastitis messbar verändern (GRABOWSKI 2000). Im Folgenden sind die in den eigenen Untersuchungen eingesetzten Parameter näher beschrieben.
2.1.4.1 Somatische Zellen (SCC)
Der Gehalt somatischer Zellen (SCC = Somatic Cell Count) im Viertelanfangsgemelk hat eine hohe Aussagefähigkeit über den Gesundheitszustand eines Euterviertels.
Eingedrungene Mikroorganismen führen zu einer Abwehrreaktion mit Zufluss von Entzündungszellen in das Euterviertel.
Zellgehalte von 20.000 bis 50.000 Zellen/ml, unter Einbeziehung der doppelten Standardabweichung bis 100.000 Zellen/ml, werden als physiologisch angesehen (DOGGWEILER u. HESS 1983; HAMANN u. REICHMUTH 1990; HAMANN 1992;
HAMANN 1996; HAMANN u. FEHLINGS 2002). Oberhalb des Zellgehaltes von 100.000 Zellen/ml Milch liegt ein Entzündungsgeschehen vor, die chemische Milchzusammensetzung ändert sich und die Milchleistung der Kuh sinkt (TOLLE 1970; SHOSHANI u. MERMAN 1977; WOOLFORD 1985; KNIGHT u. PEAKER 1991; HAMANN 1995; SCHÜTTEL 1999; GRABOWSKI 2000).
Einfluss auf den Zellgehalt haben außer Entzündungsvorgängen auch Rasse, Alter, Laktationsstadium und Laktationsnummer (BLACKBURN 1966; REICHMUTH 1975;
DOGGWEILER u. HESS 1983; BURVENICH et al. 1994; LABOHM et al. 1998).
Stress in Form von Weideaustrieb, Impfung oder Brunst führt nur dann zu einer Erhöhung des Gehalts somatischer Zellen in der Milch, wenn die Milchdrüse bereits vorgeschädigt ist, in gesunden Eutervierteln bleibt der Zellgehalt konstant (HAMANN u. REICHMUTH 1990; HAMANN 1992).
2.1.4.1.1 Zellgehalt in den Milchfraktionen
Charakteristisch für den Verlauf des Zellgehaltes in Viertelgemelksfraktionen ist ein erhöhter Gehalt im Viertelvorgemelk, der während des Melkens zu einem Minimum in der Hauptmelkphase abfällt und zum Endgemelk und Nachgemelk wieder ansteigt.
(PAAPE u. TUCKER 1966; ÖSTENSSON et al. 1988; HAMANN und GYODI 1999).
2.1.4.1.2 Fluoreszenzoptische Messverfahren 2.1.4.1.2.1 Fossomatic® (Foss)
Es handelt sich um ein fluoreszenzoptisches Verfahren, in dem die Milchproben mit Ethidiumbromid versetzt werden. Ethidiumbromid färbt die DNS der Zellkerne an und fluoresziert unter UV- oder Laseranregung. Neuere Geräte arbeiten nach dem Prinzip der Durchflusszytometrie. Jedes fluoreszierende Partikel wird als elektrischer Impuls empfangen. Der Zellgehalt wird vom Gerät in Tausend pro ml angegeben.
Bakterien und Fettpartikel können ebenfalls fluoreszieren, werden aber aufgrund einer anderen Amplitude von der Zählung ausgeschlossen. Der Variationskoeffizient dieser Methode liegt zwischen 2 und 5 % (SCHMIDT MADSEN 1975).
2.1.4.1.2.2 DeLaval Zellzahl-Messgerät DCC® (DCC)
Das DCC ist ein tragbares, batteriebetriebenes Zellzahlmessgerät. Die Milchproben werden in die zum Gerät gehörenden Kassetten aufgezogen, innerhalb der Kassetten sind alle für die Messung notwendigen Chemikalien vorgelegt. Das Gerät arbeitet nach dem fluoreszenzoptischen Prinzip mit Propidiumjodid, das an die DNS der Zellkerne bindet. Die Zellen werden von einem ladungsgekoppelten Bauelement- (Charges Coupled Devices, CCD) Sensor gezählt. Die Emissionswellenlänge der Light Emitting Diodes (LEDs) beträgt 540 nm, die Absorptionswellenlänge liegt bei 620 nm. Ein Absorptionsfilter zwischen LEDs und dem Sensor lässt nur emittiertes Licht passieren (DeLAVAL 2003; HAMANN et al. 2004; LIND et al. 2005).
Das in die Kassette aufgezogene Volumen kann von Charge zu Charge variieren, wird aber auf der Kassette codiert und während der Messung ausgelesen. Der Messbereich beträgt 10.000 bis 4.000.000 Zellen/ml. Der Variationskoeffizient im Bereich zwischen 100.000 und 400.000 Zellen/ml liegt zwischen 7 und 12 %. Da das gemessene Volumen nur etwa 1 µl beträgt, werden etwa 100 bis 400 Zellen gezählt.
82 % der Proben mit einem Zellgehalt zwischen 100.000 und 2.500.000 haben einen Variationskoeffizienten von weniger als 10 % (DeLAVAL 2003; HAMANN et al. 2004, LIND et al. 2005; RØNTVED et al. 2005).
2.1.4.2 Elektrische Leitfähigkeit
Die elektrische Leitfähigkeit der Milch wird bestimmt durch die Konzentration und Beweglichkeit der dissoziierten Ionen (v.a. Chlorid-, Kalium- und Natrium-Ionen) in der Milch. Milch aus eutergesunden Vierteln hat eine höhere Kaliumionen- konzentration und einen niedrigen Gehalt an Natrium- und Chloridionen als das Blut.
Dieses Konzentrationsgefälle wird von der Blut-Euterschranke aufrechterhalten. Wird diese durch eine Euterentzündung geschädigt, gleichen sich die Ionen- konzentrationen in der Milch denen des Blutes an und die Leitfähigkeit steigt (HAMANN u. ZECCONI 1998).
Die elektrische Leitfähigkeit wird von vielen Faktoren beeinflusst, darunter Laktationsstadium, Laktationsnummer, Rasse, Melkintervall und Gemelksfraktion.
Auch der Fettgehalt der Milch spielt eine Rolle, da Fettmicellen die Ionenbeweglichkeit herabsetzten. Die Werte gesunder Viertel können sich daher mit denen erkrankter überschneiden (HAMANN u. ZECCONI 1998).
Wegen ihrer Variabilität sollte die elektrische Leitfähigkeit nur als orientierende Information oder in Kombination mit anderen Parametern zur Mastitisdiagnostik verwendet werden (HAMANN u. ZECCONI 1998; GRABOWSKI 2000). Eine weitere Möglichkeit zur Bewertung des Parameters ist der Vergleich der einzelnen Euterviertel untereinander, da von allen Einflussfaktoren wahrscheinlich nur eine intramammäre Infektion einzelne Viertel betrifft (SCHULTZE 1985; HAMANN et al.
2004).
Die elektrische Leitfähigkeit kann mit Handgeräten („Cow side test“) oder durch in die Melkeinheit integrierte Sensoren erfolgen (SCHULTZE 1985). Die Milch gesunder Viertel weist eine Leitfähigkeit von 4,8 – 6,2 mS/cm auf (HAMANN u. FEHLINGS 2002).
2.1.4.3 NAGase
Die N-Acetyl-β-D-Glucosaminidase (NAGase) ist ein intra- und extrazellulär wirksames lysosomales Enzym, das überwiegend von epithelialen Zellen und polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) freigesetzt wird. Eine gesteigerte Aktivität im Rahmen der Infektionsabwehr, u.a. im Zusammenhang mit Mastitiden, konnte nachgewiesen werden (SANDHOLM u. MATTILA 1985;
SCHÜTTEL 1999; GRABOWSKI 2000). Die Aktivität des Enzyms in der Milch kann um das zehnfache ansteigen und korreliert eng mit dem Zellgehalt (SCHULTZE 1985). Ihre Aussagefähigkeit kann deshalb in der Mastitisdiagnostik mit derjenigen des Zellgehaltes gleichgestellt werden (HAMANN et al. 1999). Ein weiterer Vorteil des Entzündungsparameters besteht darin, dass dieser Indikator nicht von Allgemeinerkrankungen beeinflusst wird (KRÖMKER et al. 1999). Die NAGase- Aktivität steigt vom Vorgemelk zum Maschinengemelk an (ZECCONI et al. 2003).
Die Messung der NAGase-Aktivität erfolgt fluoreszenzoptisch im Mikrotiterplatten- verfahren. Das Ergebnis wird in nmol x ml-1 x min-1 angegeben. Als Referenzbereich für die Aktivität dieses Enzyms in Milch gelten 1,1 bis 2,8 nmol x ml-1 x min-1 (SCHÜTTEL 1999).
2.2 Abwehr im Euter
Die erste Barriere des bovinen Euters ist der Zitzenkanal, den die Bakterien überwinden müssen, um in die Zitzenzisterne zu gelangen. Hier treffen sie auf die residente Zellpopulation, Lymphozyten, PMN und Makrophagen der gesunden Milchdrüse. Diese Zellen initiieren die Immunantwort, die zur Elimination der Bakterien notwendig ist (BURTON u. ERSKINE 2003).
Die Abwehr im Euter wird allgemein in zwei Gruppen eingeteilt: die zelluläre und die humorale Abwehr (CRAVEN u. WILLIAMS 1985; ZECCONI et al. 1994). Die zelluläre Abwehr besteht aus den Immunzellen, die humorale Abwehr aus nicht-zellulären Komponenten, u.a. Immunglobuline, Komponenten des Komplementsystems und Mediatoren (Zytokine) (SORDILLO et al. 1997).
Milch hat durch sein Volumen und die Fett- und Caseinbestandteile einen verdünnenden und blockierenden Effekt auf die rekrutierten Immunfaktoren. Um diesen Effekt der Milch zu überwinden, müssen mehr Zellen rekrutiert werden als in den meisten anderen Geweben, die Blockierung der Abwehrzellen durch Fett und Casein kann nur durch einen ständigen Nachschub frischer Immunzellen in der akuten Phase der Entzündung kompensiert werden (BURTON u. ERSKINE 2003).
2.2.1 Zelluläre Abwehr im Euter
Lokale Rekrutierung und Aktivität von somatischen Zellen sind die wichtigsten Immunmechanismen gegen Infektionen der bovinen Milchdrüse (BURTON u.
ERSKINE 2003).
2.2.1.1 Zellarten
In Milch finden sich verschiedene Zellarten, deren Morphologie im mikroskopischen Zellausstrich in der Dissertation von SCHRÖDER (2003) ausführlich beschrieben wurde. In Tab. 2-2 sind Größe und Aussehen der Zellen kurz dargestellt.
Tab. 2-2 Morphologie von Milchzellen (nach SCHRÖDER 2003)
Zellart Größe Kern Zytoplasma
PMN 10 – 14 µm intensiv gefärbt, stabförmig oder gelappt
dichte neutrophile Granula; 0,5 – 1,5 µm Eosinophile
Granulozyten
10 – 14 µm intensiv gefärbt, stabförmig oder gelappt
eosinophile Granula;
0,5 – 1,5 µm Basophile
Granulozyten
9 – 12 µm intensiv gefärbt, stabförmig oder gelappt
basophile Granula;
1,5 µm Lymphozyten/
Blasten
5 – 10 µm bis 25 µm
intensiv gefärbt, rund bis oval
sehr wenig, intensiv gefärbt
Makrophagen 8 – 30 µm schwach gefärbt, vielfältige Formen
schwach gefärbt, oft farblose Vakuolen Epithelzellen 10 – 14 µm intensiv gefärbt, groß
und rund
schwach gefärbt, farblose Vakuolen
2.2.1.2 Zelldifferentialbild
Tab. 2-3 fasst die unterschiedlichen Literaturangaben für mikroskopisch ermittelte Zelldifferentialbilder gesunder Euterviertel zusammen (SCHRÖDER 2003; KÖß 2004). Der Anteil der Zellpopulationen variiert von Tier zu Tier und ist abhängig von Eutergesundheit und Laktationsstadium (BURVENICH et al. 1995).
Makrophagen stellen in gesunden Eutervierteln den größten Anteil der Zellpopulation (PAAPE et al. 1981; KURZHALS et al. 1985; WEVER u. EMANUELSON 1989).
Nach einer bakteriellen Infektion des Euterviertels kommt es zu einem Influx von PMN (BLACKBURN 1966; BURVENICH et al. 1994; BURTON u. ERSKINE 2003).
Dies führt zu einem allgemeinen Anstieg des Zellgehaltes und zu einem veränderten Zelldifferentialbild.
Tab. 2-3 Mikroskopisches Zelldifferentialbild in Milch einer gesunden Milchdrüse PMN [%] LYM [%] MAK [%] EPI [%]
95 Färse 5 Färse 0 Färse PAAPE et al. (1979)
75 Kuh 22 Kuh 3 Kuh
LEE et al. (1980) 3 16 80 1
FOX et al. (1985) 37 12 51
CONCHA (1986) 12 28 60
WEVER u. EMANUELSON (1989) 37 15 48
MILLER et al. (1991) 26 24 30 19
LEITNER et al. (2000) 29 11 13 45
SCHRÖDER (2003) 34 25 39
PMN = neutrophile Granulozyten, LYM = Lymphozyten, MAK = Makrophagen, EPI = Epithelzellen
2.2.1.3 PMN
Die Haupteffektoren der mammären Immunabwehr gegen die meisten Mastitiserreger sind PMN und opsonisierende Antikörper (BURVENICH et al. 1994;
KEHRLI u. SHUSTER 1994; KEHRLI u. HARP 2001). Kernaufgaben von PMN in Milch sind die Phagozytose von eingedrungenen Mikroorganismen und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies. Es wird zwischen sauerstoffabhängigen und sauerstoff- unabhängigen Reaktionen unterschieden. Das sauerstoffunabhängige System besteht aus verschiedenen mikrobiziden Proteinen, z.B. Lysozym, Laktoferrin, Lactoperoxidase, Säuren und kationischen Proteinen (TARGOWSKI 1983; CRAVEN u. WILLIAMS 1985; PAAPE et al. 1985; SORDILLO et al. 1997). Die sauerstoff- abhängigen Reaktionen werden als „Respiratory burst“ in Abschnitt 2.3.2.4 näher beschrieben.
Innerhalb der ersten 12 bis 18 Stunden einer Mastitis kommt es zu einem massiven Einstrom von PMN und Antikörpern in die Milch. Es besteht ein inverser Zusammenhang zwischen Einstrom von PMN und Euterinfektionen (SMITH 1994).
PMN phagozytieren eingedrungene Erreger am effektivsten, wenn diese mit Immunglobulinen (Ig), insbesondere der Subklasse IgG2, opsonisiert sind (HILL et al.
1983; BURVENICH et al. 1995).
2.2.1.4 Makrophagen
Makrophagen stellen in gesunden Eutervierteln den größten Anteil der Zellpopulation (LEE et al. 1980; FOX et al. 1981; CONCHA 1986; WEVER u. EMANUELSON 1989). Sie gehören zusammen mit den PMN zu den funktionellen Phagozyten (PAAPE et al. 1979; PAAPE et al. 1981; BURVENICH et al. 1994). Sie phagozytieren eingedrungene Mikroorganismen, prozessieren deren Antigene und präsentieren sie dann in MHC-Klasse-II-Molekülen auf ihrer Zelloberfläche. Aktivierte Makrophagen setzen chemotaktische Faktoren (Zytokine) frei, welche PMN rekrutieren (TARGOWSKI 1983; HOLMBERG u. CONCHA 1985; VECHT 1985;
BURVENICH et al. 1994; SORDILLO et al. 1997).
2.2.1.5 Lymphozyten
Lymphozyten modulieren die Immunantwort auf ein Antigen. Sie sind die einzigen Zellen des Immunsystems, die mit Membranrezeptoren spezifisch Antigene von eingedrungenen Erregern erkennen. Bekommt ein Lymphozyt Kontakt zu diesem Antigen, so wird eine Reihe von immunologischen Reaktionen in Gang gesetzt, u.a.
die Produktion von Immunglobulinen. Plasmazellen (B-Zellen) produzieren Antikörper, während T-Zellen in die zelluläre Abwehr eingebunden sind und immunregulatorische Aufgaben zur Steuerung der humoralen Abwehr haben. Milch enthält etwa 50 % T-Lymphozyten und ca. 20 % B-Lymphozyten (CONCHA et al.
1978; TARGOWSKI 1983), wobei diese Zahlen stark variieren.
Wie bei den PMN besteht auch die gerichtete Migration der Lymphozyten, die durch Oberflächenstrukturen, den Homing-Rezeptoren, gesteuert wird, aus Adhäsion an und Diapedese durch das Gefäßendothel (PAAPE et al. 2000). T-Lymphozyten werden selektiv in das infizierte Euter rekrutiert, der dominierende Subtyp (CD4+-, CD8+-, γδ-T-Zellen) hängt vom infizierenden Agens ab (BURTON u. ERSKINE 2003).
2.2.2 Humorale Abwehr im Euter
2.2.2.1 Mediatoren (Zytokine)
Der inflammatorische Prozess einer Euterentzündung ist von der Balance zwischen pro- und antiinflammatorischen Zytokinen gekennzeichnet (PAAPE et al. 2002).
Euterentzündungen, induziert durch verschiedene Bakterien, sind durch unterschiedliche Zytokinprofile gekennzeichnet (RIOLLET et al. 2000b). CD4+, CD8+,T-Zellen und Makrophagen partizipieren in der Produktion und Regulation von proinflammatorischen Zytokinen. Akute-Phase Zytokine sind TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IFN-γ, G-CSF und GM-CSF (RAINARD u. POUTREL 2000; RIOLLET et al. 2000a,b).
In Tab. 2-4 sind Nachweise von Zytokinen in Kolostrum (Kol.) und Milch erkrankter (er.) und gesunder (ges.) Euterviertel (EV) zusammengestellt. Normale Milch von der Mittel- bis zur Spätlaktation enthält wenig bis keine Zytokine. Es besteht die Vermutung, dass diese chemotaktischen Faktoren vom Epithel der Milchdrüse erst mit dem Beginn des Rückganges der Milchproduktion sezerniert werden, um für die spätere Involution PMN und T-Zellen zu rekrutieren. In der Milch mastitiskranker Euterviertel werden insbesondere erhöhte Konzentrationen der Zytokine TNF-α, IFN – γ und IL-8 gefunden (RIOLLET et al. 2000, 2001). Kolostralmilch enthält vermehrt IGF-1, IGF-2, IL-1β, IL-6, IL-1α, TNF-α und IFN-γ (PAKKANEN u. ALTO 1997; HAGIWARA et al. 2000).
Tab. 2-4 Vorkommen von Zytokinen in Kolostrum (Kol.), Milch gesunder (ges.) und erkrankter (er.) Euterviertel (EV)
Autor Zytokine Kol. Ges. EV er. EV
KANDEFER- SZERSZEN et al. 1995
IL-6, TNF-α, IFN-γ + ↑
SHUSTER et al. 1996 TNF-α, IL-1, IL-8 + ↑
IGF-1, IGF-2, TGF-β1, TGF-β2, EGF
+ PAKKANEN u. ALTO
1997
IGF-1, IGF-2 +
TNF-α, IL-8, GM-CSF + ↑
PERSSON WALLER et
al. 1997 IFN-γ, IL-1β + +
IL-1β, IL-6, IL-1α, TNF-α ↑ +
HAGIWARA et al. 2000
IFN-γ + +/-
HISAEDA et al. 2000 IFN-γ, TNF-α + ↑
HOEBEN et al. 2000a TNF-α + ↑
IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF
+ LEUTENEGGER et al.
2000
IL-2 -
IL1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL- 10, IL-12, TNF-α, IFN-γ
- ↑
IL-2, IL-4 - -
RIOLLET et al. 2000, 2001
TNF-α
TNF-α, GM-CSF, IFN-γ +
ALLUWAIMI u.
CULLOR 2002 IL-12, IL-6 und IL-2 +/-
+ = nachgewiesen, - = nicht nachgewiesen, +/- = nur in einigen Proben nachgewiesen, ↑ = Anstieg
2.2.2.2 Opsonine
Opsonine sind Botenstoffe, die PMN oder Makrophagen in der Phagozytose von Bakterien unterstützen. Zu ihnen gehören Immunglobuline und bestimmte Komponenten des Komplementsystems (BURVENICH et al. 1995).
2.2.2.2.1 Immunglobuline
Antikörper, alleine oder mit aktiviertem Komplement, sind notwendig für die Opsonisierung von Pathogenen und deren Phagozytose (TARGOWSKI 1983).
Antikörper der IgG2-Subklasse benötigen kein Komplement für ihre opsonisierende Aktivität und sind deshalb das Haupt-Opsonin für die neutrophile Phagozytose (WATSON 1975; HILL et al. 1983; RAINARD et al.1988). Im Gegensatz dazu benötigt IgM Komplement (siehe 2.2.2.2.2) zur effektiven Opsonisierung (NONNECKE u. HARP 1989). Während der Migration von PMN in infiziertes Gewebe werden Fc-Rezeptoren für pathogengebundenes IgG2 heraufreguliert (PAAPE et al.
2000). Fc-Rezeptoren für IgG1 und IgA werden auf bovinen PMN normalerweise nicht exprimiert und IgM-Rezeptoren während der Migration abgestoßen (BURTON u. ERSKINE 2003).
Immunglobuline sind stets in der Milch vertreten. Die Konzentration von Immunglobulinen variiert mit dem Laktationsstadium und der Eutergesundheit. In normaler Milch ist die Konzentration gering und steigt im Rahmen einer Entzündung auf 2 bis 3-fache. Ebenfalls erhöht ist der Immunglobulingehalt im Kolostrum (LASCELLES 1977).
2.2.2.2.2 Komplement
Komplement hat drei wichtige Aufgaben in der Immunabwehr: Opsonisierung, Lyse von Bakterien und Attraktion von Phagozyten. Die Rolle von Komplement als Opsonin in Milch ist nicht klar, da auch während einer Mastitis die Konzentration sehr variabel ist.
Milch scheint die Aktivität von aktiviertem Komplement zu maskieren (RAINARD u.
POUTREL 2000; RIOLLET et al. 2000b). Hohe Konzentrationen von Komplement finden sich in Kolostrum, in Trockenstehersekreten und in Milch aus entzündeten Eutervierteln (SORDILLO et al. 1997; RAINARD 2002).
In Milch ist, außer im Falle von Mastitiden, aufgrund des Mangels der Komplementkomponente C1q der klassische Weg der Komplementaktivierung nicht möglich (RAINARD 2002). Die Komplementkomponente C3b fördert die Phagozytoseaktivität von PMN (PAAPE et al. 1985; RAINARD 2002), während die Komplementkomponente C5a als Chemoattraktant für PMN wirkt (RAINARD u.
POUTREL 2000; RAINARD 2002).
2.2.2.3 Lösliches CD14
Bovine PMN exprimieren meist kein CD14 auf ihrer Oberfläche, besitzen aber zytoplasmatische Granula, in denen diese Moleküle vorrätig gehalten werden (PAAPE et al. 2002).
PMN und Makrophagen geben an der Oberfläche eine lösliche Form von CD14 (sCD14) ab, dieses kann in größeren Mengen in Milch und Kolostrum vorkommen (WANG et al. 2002). sCD14 neutralisiert freie Endotoxine und Lipoproteine aus Bakterien (SOLER-RODRIGUEZ et al. 2000). Geringe Konzentrationen von Lipopolysaccharid (LPS) und sCD14 verstärken die akute inflammatorische Antwort von bovinen Epithelzellen und die Rekrutierung von PMN in die Milch (WANG et al.
2002).
Die direkte Bindung von LPS an sCD14 ist gering, sie wird verstärkt durch die Anwesenheit von LPS-binding-protein (LBP). Der Komplex aus LPS und LBP führt zur Freisetzung von Zytokinen aus Makrophagen. Es wird vermutet, dass lösliches CD14 vor intramammären Infektionen schützt (LEE et al. 2003).
2.3 Phänotypische und funktionelle Eigenschaften boviner PMN
2.3.1 Phänotyp und Oberflächenantigene
PMN exprimieren an ihrer Oberfläche zahlreiche Moleküle, die entsprechend ihrer Antigenstruktur und Funktion bezeichnet werden. Die Expressionsdichte von Oberflächenantigen wird durchflusszytometrisch mit Hilfe der Mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) gemessen.
CD11b bildet zusammen mit CD18 den Komplementrezeptor-3 (CR-3). Dieser ist an der Extravasation, aber auch an der Vermittlung der Phagozytose und der ROS- Bildung der PMN beteiligt (SMITH 1993). Ein Anstieg der Expressionsdichte von CD11b auf Milchzellen erkrankter Euterviertel wird von mehreren Autoren beschrieben (DOSOGNE et al. 1997; RIVAS et al. 2001a; WINTER u. COLDITZ 2002; DIEZ-FRAILE 2003; KÖß 2004). Die Inkubation von Blut-PMN in Fragmenten von Arcanobacterium pyogenes und E. coli führt zu einer erhöhten Expressionsdichte von CD11b (OßADNIK 1999; ZERBE et al. 2001).
Das vom monoklonalen Antikörper (mAk) Bo116 spezifisch gebundene Epitop wird auf allen bovinen PMN sowie auf einer kleinen Monozytensubpopulation exprimiert.
Es konnte bisher nicht weiter charakterisiert werden (RÖNSCH 1992). Das PMN- spezifische Antigen, an das der monoklonale Antikörper IL-A110 bindet, wurde ebenfalls bisher nicht genauer bestimmt.
Auf bovinen uterinen PMN wird IL-A110 stärker exprimiert als auf Blut-PMN (ZERBE 1994; ZERBE et al. 1998, 2000; KÖNIG 2003). Nach Inkubation boviner Blut-PMN in Fragmenten oder löslichen Produkten von Arcanobacterium pyogenes und E. coli oder in mit diesen Pathogenen infizierten Lochialsekreten nimmt die Expressionsdichte deutlich zu (OßADNIK 1999; ZERBE et al. 2001, 2002). Die Inkubation boviner Blut-PMN in Überständen PMA-aktivierter PMN führt zu einer gesteigerten Exprimierung von IL-A110 (ZERBE et al. 2002). Auch auf Milchzellen erkrankter Euterviertel wird IL-A110 verstärkt exprimiert (KÖß 2004)
2.3.2 Pathogenabwehr durch PMN
PMN haben fünf Kernfunktionen, um intramammäre Pathogene abzuwehren:
Margination, Migration, Phagozytose, Respiratory burst und Degranulation.
2.3.2.1 Margination
Zirkulierende PMN müssen ständig mit dem Endothel kleiner Blutgefäße in Kontakt kommen, um dieses auf Zeichen von Beschädigungen oder Infektion des darunterliegenden Gewebes zu untersuchen (Margination). Zirkulierende PMN nutzen dafür Moleküle aus der Selektin-Familie. L-Selektin wird auf zirkulierenden PMN exprimiert, während E-Selektin (CD62E) und P-Selektin (CD62P) im Verlauf von Entzündungen auf vaskulären Endothelzellen vorkommt (KEHRLI et al. 1999).
Bakterielle Besiedlung von Eutervierteln führt zur Aktivierung von Makrophagen durch Phagozytose der Bakterien, bakterielle Toxine oder Metaboliten und zur Produktion verschiedene Zytokine, welche PMN rekrutieren (RIOLLET et al. 2000b).
2.3.2.2 Migration
Detektieren PMN während der Margination CD62E, CD62P oder andere inflammatorische Moleküle auf der Oberfläche von Endothelzellen, heften sie sich mit den Selektinen fest an das betroffene Endothel und migrieren zwischen den Endothelzellen zum Fokus der Infektion. Die Migration besteht aus drei Schritten:
Hyperadhärenz, Diapedese und Chemotaxis (BURTON u. ERSKINE 2003).
Proinflammatorische Moleküle, die durch chemotaktische Wirkung Migration fördern, sind: LPS aus gramnegativen Bakterien, Chemokine und Zytokine (IL-8, Metaboliten des Arachidonsäurezyklus) aus beschädigten Endothelzellen, Zytokine und Komponenten des Komplementsystems (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-γ, C5a und C3a) von Makrophagen, PMN und T-Lymphozyten (RIOLLET et al. 2000a,b).
2.3.2.3 Phagozytose
Phagozytose ist die effektivste Abwehrform gegen bakterielle Infektionen des Euters (PAAPE et al. 2002). Phagozytose wird durch eine Reihe spezialisierter Rezeptoren auf der Oberfläche von PMN, die durch proinflammatorische Signale im Verlauf der Diapedese und Chemotaxis heraufreguliert wurden, ermöglicht. Diese Rezeptoren werden in zwei Gruppen geteilt: Eine Gruppe erkennt lösliche Komponenten in der Zellwand von Bakterien (LPS), die zweite Gruppe identifiziert lösliche Komponenten des eigenen Immunsystems (Immunglobuline), die an Bakterien gebunden haben (Opsonisierung, siehe 2.2.2.2) (MORK 1993; SOLER-RODRIGUEZ 2000). Einige Bakterienarten müssen opsonisiert sein, bevor sie als körperfremd erkannt und phagozytiert werden können, andere Bakterien, Pilze, Hefen, Latex- und Carbonpartikel werden auch ohne Opsonisierung phagozytiert (TARGOWSKI 1983).
PMN, Monozyten und Makrophagen besitzen Fc- und C3b-Rezeptoren und können Pathogene, die mit Komplement oder Immunglobulinen opsonisiert sind, binden (TARGOWSKI 1983). Kann die Adhäsion der Partikel nicht über Opsonine ablaufen, binden sie an unspezifische Rezeptoren auf der Oberfläche der PMN.
Pseudopodien bilden sich bis zur vollständigen Umhüllung durch die Zellmembran um den Partikel herum aus. Die entstehende Vakuole wird Phagosom genannt. Das Phagosom wird in das Innere der Zelle verbracht und fusioniert dort mit den lysosomalen Vesikeln zum Phagolysosom. Dieser Vorgang wird Degranulation genannt. Zur Abtötung der Mikroorganismen stehen sauerstoffabhängige und sauerstoffunabhängige Mechanismen zur Verfügung (siehe Abschnitte 2.2.1.3 und 2.3.2.4) (TARGOWSKI 1983; BURTON u. ERSKINE 2003).
Es wird vermutet, dass Antikörper- und Komplementrezeptoren durch Milchbestandteile blockiert und inaktiviert werden. Komplement, IgG1, IgG2, IgM und IgA kommen in Milch aus gesunden Eutervierteln nur in geringen Konzentrationen vor, die Konzentration steigt aber in mastitisinfizierten Vierteln an (siehe 2.2.2.2.1 und 2.2.2.2.2) (LASCELLES 1977; BURTON u. ERSKINE 2003).
2.3.2.4 Respiratory burst und Degranulation
Verschiedene Aktivierungsmechanismen, u.a. rezeptorvermittelte Phagozytose, können zu einer erhöhten Aktivität der membranständigen NADPH-Oxidase der PMN führen, woraufhin das Superoxidanion O2- gebildet wird. In dem auch als „Respiratory burst“ bezeichneten kaskadenartig ablaufenden Prozess wird O2- in Verbindung mit weiteren Substraten und Enzymen des Myeloperoxidasesystems zu stärker toxischen Sauerstoffverbindungen wie Wasserstoffperoxid (H2O2), Hydroxyradikalen, Peroxidanionen und hypochlorigen Säuren umgebildet. Diese wiederum entfalten eine stark mikrobizide Wirkung (CLIFFORD u. REPINE 1982; TARGOWSKI 1983;
GOODMAN et al. 1995).
Die für diese Vorgänge benötigten Enzyme werden in den Granula der PMN vorrätig gehalten. Die primären azurophilen Granula enthalten die Myeloperoxidase und hydrolytische Enzyme, wie β-Glucuronidase, Esterasen, Phosphatasen, Lysozym und kationische Proteine (COORAY et al. 1993; ZECCONI et al. 1994).
In den sekundären, spezifischen Granula werden Laktoferrin und alkalische Phosphatase gespeichert (BAINTON et al. 1971). Zusätzlich gibt es eine dritte Gruppe von Granula, die die Enzyme für die sauerstoffunabhängigen Reaktionen enthalten (GENNARO et al. 1983).
2.4 Vergleich der Funktionalität von Blut- und Milchzellen
2.4.1 Unterschiede der Zellfunktionalitäten von Blut- und Milchzellen
Die Vitalität von aus Blut isolierten PMN ist meist deutlich höher als die von aus Milch isolierten Zellen. Blut-PMN sind zu über 95% vital, während die Vitalität von Milch PMN geringer ist und stärker schwankt (MEHRZAD 2002; MERLE 2003;
SCHRÖDER 2003). Der Anteil vitaler Zellen in der Milch aus gesunden Eutervierteln bewegt sich zwischen 40 und 80 % (PICCINI et al. 1999).
Bovine Blut-PMN enthalten drei verschiedene Granula: azurophile Granula, spezifische Granula und eine dritte Gruppe von Granula, die Laktoferrin und sauerstoffunabhängige bakterielle Bestandteile enthält (GENNARO et al. 1983;
PAAPE et al 2002). Milch-PMN enthalten hauptsächlich azurophile Granula. Das Fehlen der spezifischen Granula wird durch ihre Fusion mit Phagosomen oder ihre Migration außerhalb der Zellen erklärt (BAINTON et al. 1971; PAAPE u. WERGIN 1977).
Milchzellen weisen gegenüber Blutzellen einen erhöhten Anteil CD4- und CD8- positiver Lymphozyten auf, für CD8 ist auch die Expressionsdichte erhöht. Der Anteil Bo116 und Bo139 exprimierender Zellen dagegen ist in Blutzellen höher als in Milchzellen (SCHRÖDER 2003).
Die Phagozytosekapazität und die Chemilumineszenz (CL) von Milch-PMN sind im Vergleich zu Blut-PMN geringer (DULIN et al. 1988; MEHRZAD et al. 2002; MERLE 2003). Milchbestandteile wie Fett und Casein werden von den Milch-PMN aufgenommen und reduzieren die Phagozytosekapazität (PAAPE et al. 1975, 1979;
RUSSELL et al. 1977). Sowohl der Anteil phagozytierender PMN, als auch die Menge der aufgenommenen Bakterien ist für Milch-PMN signifikant geringer als für Blut-PMN. Phagozytosekapazität von Blut- und Milch-PMN desselben Tieres korrelieren (SAAD 1987), während zwischen verschiedenen Tieren erhebliche Schwankungen bestehen (PAAPE et al. 1978).
Über die CL von Blut- und Milch-PMN gibt es widersprüchliche Aussagen. Die meisten Autoren berichten, dass Blut-PMN gegenüber Milch-PMN desselben Tieres höhere Werte in CL-Messungen haben. Das Verhältnis der CL von Milch und Blutzellen ist innerhalb eines Tieres relativ konstant, während zwischen verschiedenen Tieren große Unterschiede bestehen (WEBER et al. 1983; MERLE 2003). Es wird vermutet, dass die Ingestion von Fettkügelchen und Caseinmicellen mit anschließender Degranulation zu einer Aktivierung führt (DULIN et al. 1988). Als Konsequenz der Voraktivierung sind Milch-PMN weniger reaktionsfähig auf Zellaktivatoren wie z.B. PMA (PAAPE et al. 2000). Andere Untersuchungen zeigen, dass Milch-PMN eine höhere CL als Blut-PMN aufweisen (MEHRZAD et al. 2001).
2.4.2 Einfluss von Mastitiden auf Zellfunktionalität von Blut- und Milchzellen
In S. aureus infizierten Eutervierteln ist die Vitalität der Milchzellen höher als in gesunden Eutervierteln (PICCINI et al. 1999). Auch in Vierteln mit mittelgradig erhöhtem Zellgehalt steigt die Zellvitalität (SCHRÖDER 2003).
Die Expressionsdichte der Oberflächenantigene CD11b und IL-A110 auf Milch-PMN erhöht sich beim Auftreten einer Mastitis und sinkt mit Rückkehr des Zellgehaltes unter 100.000 Zellen/ml langsam wieder ab (KÖß 2004).
Auf Blut- und Milch-PMN euterkranker Tiere werden die Oberflächenantigene Bo116 und Bo139 verstärkt exprimiert (SCHRÖDER 2003).
Gegenteilige Untersuchungen gibt es über die Phagozytosekapazität von Milch-PMN aus erkrankten Eutervierteln. Meist wird eine stark erhöhte Phagozytosekapazität von PMN aus Mastitismilch, durch vermehrte Anwesenheit von Opsoninen, beschrieben (JAIN u. LASMANIS 1978; GUIDRY et al. 1980; PAAPE et al. 1981).
Auch nach experimenteller Infektion mit S. aureus wird ein Anstieg des Anteils an phagozytierenden Zellen beobachtet (DALEY et al. 1991). Andere Untersuchungen beschreiben eine reduzierte Phagozytoseaktivität durch Mastitiserkrankungen. Im Verlauf einer Mastitis wird in erkrankten Eutervierteln ein geringerer Anteil phagozytierender PMN, aber eine erhöhte Anzahl an phagozytierten Bakterien pro Zelle beobachtet (MERLE 2003). Nach Heilung einer Mastitiserkrankung ist der Anteil aktiver PMN geringer (KÖß 2004). Die unterschiedliche Potenz von Milch zur Unterstützung der Phagozytose wird mit der Mastitisprävalenz in Verbindung gebracht (PAAPE et al. 1978).
Auch über die CL von Milch-PMN aus erkrankten Eutervierteln gibt es differierende Aussagen. Neuere Untersuchungen zeigen, dass die CL von PMN aus erkrankten Eutervierteln im Verlauf einer Mastitis stets niedriger als von PMN aus gesunden Vierteln ist. Die CL-Aktivität im Blut sinkt ebenfalls im Verlauf der Erkrankung (MERLE 2003). Weitere Untersuchungen stellten einen Anstieg der CL bei E.coli- Infektionen fest (MEHRZAD 2002). Außerdem wurde eine Korrelation zwischen dem Zellgehalt und der CL-Aktivität beobachtet, die CL in infizierten Eutervierteln stieg bis auf das 25-fache an (LILIUS u. PESONEN 1990). Nach einer LPS-Injektion in das Euter wurde ein Anstieg der CL von Blut- und Milch-PMN festgestellt. Die Werte der Milch-PMN übertrafen sogar die der Blut-PMN (MEHRZAD 2002).
2.4.3 Einfluss von Frühlaktation und Stoffwechsel auf Zellfunktionalität von PMN aus Blut und Milch
In der Frühlaktation ist die Chemilumineszenzaktivität von Milch-PMN signifikant geringer als in der Mittellaktation (VANGROENWEGHE et al. 2001; MEHRZAD 2002) und erreicht an Tag 2 p.p ihr Minimum (MEHRZAD et al. 2002).
Untersuchungen zur Zellfunktionalität (CL, Migration und antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität) im Peripartalzeitraum von Blut-PMN ergeben eine Aktivitätserhöhung zwei Wochen vor der Geburt und einen starken Abfall in der Woche post partum (KEHRLI et al. 1989). Die CL Aktivität von Blut-PMN erreicht 2 Wochen p.p. ihr Minimum, steigt ab Woche 3 p.p. wieder an, um 6 Wochen p.p.
wieder ihre Ursprungswerte zu erreichen (HOEBEN et al. 2000a). Auch die Expressionsdichte von CR-3, CR-4 und Bo116 auf Blut-PMN ist postpartal reduziert, während die Expressionsdichte von IL-A110 erhöht ist (ZERBE et al. 2000).
Ketonkörper führen zu einer eingeschränkten Phagozytoseaktivität von Milch- und Blutmakrophagen, weniger von PMN (KLUCIŃSKI et al. 1988). Auch β- Hydroxybuttersäure in subketotischen Konzentrationen senkt die Aktivität von Milch- PMN. Dieses mag zu einer vermehrten Mastitisempfänglichkeit in der Frühlaktation führen (HOEBEN et al. 1997). Progesteron behindert mit steigender Konzentration ebenfalls die Bildung freier Sauerstoffradikale im Nitroblau-Tetrazolium- Reduktionstest. Blut-PMN von Kühen mit hohem Triacyl-Glycerol-Gehalt der Leber weisen eine reduzierte ROS-Bildung und antikörperunabhängige und –abhängige zelluläre Zytotoxizität auf (ZERBE et al. 2000).
2.5 Magermilch
2.5.1 Magermilch- und Milchserumgewinnung
Es wird unterschieden zwischen der Gewinnung von Magermilch und Milchserum.
Zur Gewinnung von Magermilch werden durch Zentrifugation der Fettüberstand und das Zellsediment entfernt. Die Gewinnung von Milchserum beinhaltet einen zusätzlichen Arbeitsschritt, wie Labfällung oder Hochgeschwindigkeitszentrifugation zur Entfernung der Eiweißfraktion. Tab. 2-5 und Tab. 2-6 geben einen Überblick über die verschiedenen Methoden zur Gewinnung von Milchserum und Magermilch.
Tab. 2-5 Methoden der Milchserumgewinnung
Autor Methodik
PAAPE et al. 1975 Magermilchgewinnung; Einstellen des pH auf 4,6 mit HCl;
Zentrifugation 46.000 x g, 30 min; Einstellen des pH auf 7,4 GUIDRY et al. 1979 Magermilchgewinnung; Einstellen des pH auf 4,6 mit 1 N
HCl; Neutralisation des pH auf 7,4 mit 1 N NaOH GUIDRY et al. 1980 Magermilchgewinnung; Einstellen des pH auf 4,6 mit 1 N
HCl; Zentrifugation 46.000 x g, 30 min, 4 °C; Einstellen des pH auf 7,0 mit 1 N NaOH; Zentrifugation
HILL et al. 1983 Zentrifugation 60.000 x g, 30 min; Filtration 0,45 µm Porengröße
TARGOWSKI u.
KLUCIŃSKI 1985
Magermilchgewinnung; Eiweissfällung mit 1 N Eisessig;
Neutralisation mit 1 N NaOH LEBLANC u.
PRITCHARD1988
Gewinnung von Magermilch; Zugabe von Ammoniumsulfat;
1 h Inkubation bei 4°C; Zentrifugation 10.000 x g, 10 min, 4°C; z.T. Hitzeinaktivierung
