Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Zelldifferentialbild in Milch und Blut unter Berücksichtigung des Gesundheitsstatus der bovinen Milchdrüse
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Anke Schröder, geb. Heide aus Bonn
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Dr. Jörn Hamann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. Jörn Hamann
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Martina Hoedemaker, PhD.
Tag der mündlichen Prüfung: 04. Juni 2003
Diese Arbeit wurde durch Mittel der Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH gefördert.
Meinen Eltern
in Liebe und Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG
... 12. LITERATURÜBERSICHT
... 32.1 Mastitisdiagnostik... 3
2.1.1 Zellgehalt in normaler und in Mastitismilch... 3
2.1.2 Physiologische Einflüsse auf den Zellgehalt der Milch ... 4
2.1.3 Methoden zur Zellzählung ... 4
2.1.3.1 Prescott und Breed ... 4
2.1.3.2 Coulter Counter... 5
2.1.3.3 Fossomatic... 5
2.1.4 NAGase-Aktivität... 6
2.1.5 Elektrische Leitfähigkeit... 6
2.2 Mikroskopische Zelldifferenzierung... 8
2.2.1 Geschichte... 8
2.2.2 Methoden zur Herstellung von Milchausstrichen... 9
2.2.2.1 Kieler Sedimentausstrich ... 9
2.2.2.2 Cytospin ... 9
2.2.3 Zellmorphologie ... 10
2.2.3.1 Allgemeines... 10
2.2.3.2 PMN ... 10
2.2.3.3 Eosinophile Granulozyten ... 11
2.2.3.4 Basophile Granulozyten ... 11
2.2.3.5 Lymphozyten... 11
2.2.3.6 Monozyten ... 11
2.2.3.7 Makrophagen ... 12
2.2.3.8 Epithelzellen... 12
2.2.4 Zelldifferentialbild in Milch einer gesunden Milchdrüse... 13
2.2.5 Zelldifferentialbild in Milch einer erkrankten Milchdrüse ... 14
2.2.6 Zelldifferentialbild des Blutes ... 15
Inhaltsverzeichnis
2.3 Durchflußzytometrische Zelldifferenzierung... 15
2.3.1 Differenzierung aufgrund der Zellmorphologie ... 15
2.3.2 Differenzierung mit Hilfe monoklonaler Antikörper ... 16
2.3.2.1 Herstellung monoklonaler Antikörper ... 16
2.3.2.2 Cluster of Differentiation... 17
2.3.2.3 Haupthistokompatibilitätskomplex II ... 18
2.3.2.4 TCR1 ... 18
2.3.2.5 WC1 ... 19
2.3.2.6 CD4 ... 19
2.3.2.7 CD8 ... 19
2.3.2.8 CD14 (LPS-Rezeptor) ... 20
2.3.3 Zelldifferentialbild einer gesunden Milchdrüse ... 20
2.3.3.1 Phagozyten ... 20
2.3.3.2 Lymphozyten... 21
2.3.4 Zelldifferentialbild einer erkrankten Milchdrüse... 23
2.3.4.1 Phagozyten ... 23
2.3.4.2 Lymphoyzten... 24
2.3.5 Zelldifferentialbild des Blutes ... 24
2.3.5.1 Phagozyten ... 24
2.3.5.2 Lymphoyzten... 25
2.4 Zelluläre Abwehr der bovinen Milchdrüse... 26
2.4.1 Phagozytose ... 26
2.4.2 Makrophagen... 26
2.4.3 PMN ... 27
2.4.3.1 Lebenszyklus ... 27
2.4.3.2 Migration ... 27
2.4.3.3 Entzündung... 28
2.4.4 Lymphozyten ... 29
2.4.4.1 T-Lymphozyten ... 29
2.4.4.2 B-Lymphozyten ... 30
2.5 Folgerung... 30
3. MATERIAL UND METHODEN
... 313.1 Versuchstiere... 31
3.1.1 Betrieb 1 ... 31
Inhaltsverzeichnis
3.1.2 Betrieb 2 ... 31
3.1.3 Versuchsreihen ... 32
3.1.3.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer randomisierten Tierauswahl ... 32
3.1.3.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen ... 32
3.1.3.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer selektierten Tierauswahl ... 33
3.2 Geräte ... 33
3.3 Material ... 35
3.3.1 Verbrauchsmaterialien ... 35
3.3.2 Reagenzien ... 37
3.3.3 Antikörper und Nachweisreagenzien ... 38
3.3.3.1 Antikörper für den Einsatz in der Membranimmunfluoreszenz... 38
3.3.3.1.1 Monoklonale Primärantikörper ... 38
3.3.3.1.2 Sekundärantikörper... 40
3.3.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ... 40
3.3.4.1 Lösungen für die Zellanalytik... 40
3.3.4.1.1 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ... 40
3.3.4.1.2 Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer)... 40
3.3.4.2 Lösungen für die Durchflußzytometrie ... 41
3.3.4.2.1 Trägerflüssigkeit (Sheath fluid)... 41
3.3.4.2.2 Propidiumiodidlösung... 41
3.3.4.2.3 To-Pro-3-Lösung ... 41
3.3.4.2.4 Acridinorange-Lösung ... 41
3.3.4.3 Färbelösungen für die Mikroskopie ... 42
3.3.4.3.1 Hemacolor... 42
3.3.4.3.2 Toluidinblaulösung ... 42
3.3.4.4 Fixationslösung für Rohmilch ... 42
3.4 Probenahme... 42
3.4.1 Blut ... 42
3.4.2 Milch ... 43
3.4.2.1 Vorgemelk ... 43
3.4.2.2 Viertelanfangsgemelk (VAG)... 43
3.4.2.3 Viertelhandgemelk (VGH) ... 44
3.4.2.3.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer randomisierten Tierauswahl ... 44
3.4.2.3.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen ... 44
Inhaltsverzeichnis
3.4.2.3.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer
selektierten Tierauswahl ... 44
3.5 Probenanalyse... 45
3.5.1 Blut ... 45
3.5.1.1 Klinische Labordiagnostik ... 45
3.5.1.2 Leukozytenseparation ... 46
3.5.1.3 Bestimmung und Einstellung der Zellkonzentration in der Zellsuspension ... 46
3.5.2 Milch ... 47
3.5.2.1 Mastitisdiagnostik... 47
3.5.2.1.1 Mikrobiologische Untersuchung ... 47
3.5.2.1.2 Messung der NAGase - Aktivität ... 48
3.5.2.1.3 Bestimmung des Zellgehaltes im VAG ... 48
3.5.2.1.4 Bestimmung des Zellgehaltes im VGH... 49
3.5.2.2 Kieler Sedimentausstrich ... 50
3.5.2.3 Separation der somatischen Milchzellen... 50
3.5.2.3.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer randomisierten Tierauswahl ... 50
3.5.2.3.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen ... 51
3.5.2.3.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer selektierten Tierauswahl ... 51
3.5.2.4 Bestimmung und Einstellung der Zellkonzentration in der Zellsuspension ... 51
3.5.2.5 Ausstriche der ZSM („Kaffeemühle“)... 52
3.5.3 Durchflußzytometrische Analysen ... 52
3.5.3.1 Durchflußzytometrie ... 52
3.5.3.2 Durchflußzytometrische Beurteilung der Zellvitalität ... 54
3.5.3.2.1 Prinzip ... 54
3.5.3.2.2 Probenvorbereitung und Messung ... 55
3.5.3.2.3 Auswertung ... 55
3.5.3.3 Membranimmunfluoreszenz... 57
3.5.3.3.1 Prinzip ... 57
3.5.3.3.2 Durchführung ... 57
3.5.3.3.3 Auswertung ... 58
3.5.4 Datengruppierung und Statistik... 62
3.5.4.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer randomisierten Tierauswahl ... 62
3.5.4.1.1 Datengruppierung ... 62
3.5.4.1.2 Statistik ... 62
3.5.4.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen ... 63
3.5.4.2.1 Einfluß von Probenahmegefäß und Untersucher auf das mikroskopische Zelldifferentialbild... 63
Inhaltsverzeichnis
3.5.4.2.2 Einfluss von Probenahmegefäß und Antikörper auf das
durchflußzytometrische Zelldifferentialbild ... 63
3.5.4.2.3 Vergleich von Kieler Sedimentausstrich und Ausstrich der Zellsuspension ... 64
3.5.4.2.4 Überprüfung der Wiederholbarkeit verschiedener Parameter ... 65
3.5.4.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer selektierten Tierauswahl ... 65
4. ERGEBNISSE
... 664.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer randomisierten Tierauswahl... 66
4.1.1 Selektierte Kriterien der Eutergesundheit... 66
4.1.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild ... 69
4.1.3 Durchflußzytometrische Parameter... 71
4.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen... 75
4.2.1 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Untersuchers auf das mikroskopische Zelldifferentialbild ... 75
4.2.1.1 Einfluß des Probenahmegefäßes... 76
4.2.1.2 Einfluß des Untersuchers... 77
4.2.2 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Antikörpers auf das durchflußzytometrische Zelldifferentialbild... 78
4.2.2.1 Einfluß des Probenahmegefäßes... 79
4.2.2.2 Einfluß des Antikörpers ... 79
4.2.3 Vergleich von Kieler Sedimentausstrich und Ausstrich der Zellsuspension mit der „Kaffeemühle“ ... 79
4.2.4 Untersuchungen zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung ... 87
4.2.4.1 Wiederholbarkeit der Milchzelldifferenzierung... 87
4.2.4.2 Wiederholbarkeit der Blutzelldifferenzierung... 90
4.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer selektierten Tierauswahl... 92
4.3.1 Selektierte Kriterien der Eutergesundheit... 92
4.3.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild in Milch ... 94
4.2.3 Mikroskopisches Zelldifferentialbild des Blutes ... 96
4.2.4 Durchflußzytometrische Parameter der Milchzellsuspension ... 97
4.2.5 Durchflußzytometrische Parameter der Blutzellsuspension... 106
Inhaltsverzeichnis
5. DISKUSSION
... 1105.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchungen auf der Basis einer randomisierten Tierauswahl... 110
5.1.1 Selektierte Kriterien der Eutergesundheit... 110
5.1.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild ... 111
5.1.3 Durchflußzytometrische Parameter... 112
5.1.3.1 Zellvitalität ... 113
5.1.3.2 CD4 und CD8... 113
5.1.3.3 WC1 ... 114
5.1.3.4 MHC II ... 116
5.1.4 Folgerungen zu Versuch 1 ... 116
5.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen... 117
5.2.1 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Untersuchers auf das mikroskopische Zelldifferentialbild ... 117
5.2.1.1 Einfluß des Probenahmegefäßes... 117
5.2.1.2 Einfluß des Untersuchers... 118
5.2.2 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Antikörpers auf das durchflußzytometrische Zelldifferentialbild... 118
5.2.2.1 Einfluß des Probenahmegefäßes... 118
5.2.2.2 Einfluß des Antikörpers ... 119
5.2.3 Vergleich von Kieler Sedimentausstrich und Ausstrich der Zellsuspension mit der „Kaffeemühle“ ... 120
5.2.4 Untersuchungen zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung ... 122
5.2.5 Folgerungen zu Versuch 2 ... 123
5.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer selektierten Tierauswahl... 123
5.3.1 Selektierte Kriterien der Eutergesundheit... 123
5.3.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild in Milch ... 125
5.3.3 Mikroskopisches Zelldifferentialbild des Blutes ... 126
5.3.4 Durchflußzytometrische Parameter der Milchzellsuspension ... 127
5.3.4.1 Zellvitalität ... 127
5.3.4.2 CD4 und CD8... 127
5.3.4.3 TCR1 ... 128
Inhaltsverzeichnis
5.3.4.4 Bo 116 ... 129
5.3.4.5 MHC II ... 130
5.3.4.6 CD14 (LPS-Rezeptor) ... 130
5.3.5 Durchflußzytometrische Parameter der Blutzellsuspension... 131
5.3.5.1 Zellvitalität ... 131
5.3.5.2 CD4 und CD8... 132
5.3.5.3 TCR1 ... 133
5.3.5.4 Bo 116 ... 133
5.3.5.5 MHC II ... 134
5.3.5.6 CD14 (LPS-Rezeptor) ... 134
5.3.6 Folgerungen zu Versuch 3 ... 135
6. ZUSAMMENFASSUNG
... 1397. SUMMARY
... 1428. RESUME
... 1459. LITERATURVERZEICHNIS
... 14810. EPILOG
... 167Tabellen
TABELLEN
Tab. 1: Zellmorphologie von Milchzellen ... 12
Tab. 2: Zelldifferentialbild in Milch einer gesunden Milchdrüse ... 13
Tab. 3: Größe der CD4+ und CD8+ Lymphozytensubpopulationen in Blut und Milch ... 22
Tab. 4: Durchflußzytometrisches Zelldifferentialbild der Phagozyten in Blut und Milch vor und nach einer intrazisternalen LPS-Injektion (PAAPE et al. 1996) ... 23
Tab. 5: Verwendete monoklonale Antikörper zur Charakterisierung von zellulären Oberflächenstrukturen in der Membranimmunfluoreszenz ... 39
Tab. 6: Klinische Laborparameter zur Beurteilung der Allgemeingesundheit ... 45
Tab. 7: Histogramm Statistik zu FL3-H... 57
Tab. 8: Quadranten Statistik für die Auswertung der MIF... 61
Tab. 9: Gruppierung der Daten in Versuch 1... 62
Tab. 10: Gruppierung der Daten für den Vergleich der Ausstricharten KSA und ZSM, für die Untersuchung zur Wiederholbarkeit und für Versuch 3 ... 64
Tab. 11: Stichprobengröße n Viertel, Mittelwert X und Standardabweichung sd der selektierten Kriterien der Eutergesundheit in Versuch 1 ... 67
Tab. 12: Signifikanzen (p-Werte) der selektierten Kriterien der Eutergesundheit zwischen den Gruppen in Versuch 1... 68
Tab. 13: Korrelationskoeffizienten der selektierten Kriterien der Eutergesundheit mit SCC VAG ... 68
Tab. 14: Signifikanzen für die einzelnen Zellarten zwischen den Gruppen ... 70
Tab. 15: Korrelationskoeffizienten der einzelnen Zellarten mit SCC VAG... 70
Tab. 16: Stichprobengröße n Viertel, Mittelwert X und Standardabweichung sd der durchflußzytometrischen Parameter der ZSM in Versuch 1... 72
Tab. 17a: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter zwischen den Gruppen ... 73
Tab. 17b: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter zwischen den Gruppen ... 74
Tab. 18a: Korrelationskoeffizienten der durchflußzytometrischen Parameter mit SCC VAG ... 74
Tab. 18b: Korrelationskoeffizienten der durchflußzytometrischen Parameter mit SCC VAG ... 75
Tabellen
Tab. 19: Ergebnisse der mikroskopischen Zelldifferenzierung in Versuch 2:
Einfluß von Probenahmegefäß und Untersucher ... 76 Tab. 20: Signifikanzen des Gefäßvergleichs getrennt nach Untersucher... 77 Tab. 21: Signifikanzen des Untersuchervergleiches ... 77 Tab. 22: Ergebnisse der durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung in
Versuch 2: Einfluß von Probenahmegefäß und Antikörper ... 78 Tab. 23: Zelldifferentialbild getrennt nach Gruppen, Methode KSA ... 83 Tab. 24: Zelldifferentialbild getrennt nach Gruppen, Methode „Kaffeemühle“ ... 83 Tab. 25: Signifikanzen des Vergleichs der Ausstrichmethoden, getrennt nach
Zellart und Eutergesundheitsstatus... 84 Tab. 26: Mittelwert X und Standardabweichung sd der Differenz KSA - ZSM... 84 Tab. 27: Signifikanzen für die einzelnen Zellarten und Methoden zwischen den
Gruppen ... 86 Tab. 28a: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und
durchflußzytometrischen Milchzelldifferenzierung... 87 Tab. 28b: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und
durchflußzytometrischen Milchzelldifferenzierung... 88 Tab. 28c: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und
durchflußzytometrischen Milchzelldifferenzierung... 89 Tab. 29a: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und
durchflußzytometrischen Blutzelldifferenzierung ... 90 Tab. 29b: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und
durchflußzytometrischen Blutzelldifferenzierung ... 91 Tab. 30: Selektierte Kriterien der Eutergesundheit in Versuch 3, Gruppen A, B1
und C1 ... 93 Tab. 31: Korrelationskoeffizienten der selektierten Kriterien der Eutergesundheit
mit SCC VAG in Versuch 3 ... 94 Tab. 32: Signifikanzen (p-Werte) der Zellarten zwischen den Gruppen in
Versuch 3 ... 95 Tab. 33: Korrelationskoeffizienten der einzelnen Zellarten mit SCC VAG... 96
Tab. 34a: Durchflußzytometrisches Zelldifferentialbild in Versuch 3, Gruppen A, B1 und C1 ... 101 Tab. 34b: Durchflußzytometrisches Zelldifferentialbild in Versuch 3, Gruppen B2,
C2 und C3... 102 Tab. 35a: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter zwischen
den Gruppen in Versuch 3 ... 103
Tabellen
Tab. 35b: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter zwischen
den Gruppen in Versuch 3 ... 104 Tab. 36a: Korrelationskoeffizienten für die durchflußzytometrischen Parameter
in Versuch 3 ... 105 Tab. 36b: Korrelationskoeffizienten für die durchflußzytometrischen Parameter
in Versuch 3 ... 105 Tab. 36c: Korrelationskoeffizienten für die durchflußzytometrischen Parameter
in Versuch 3 ... 106 Tab. 37: Durchflußzytometrische Parameter der Blutzellsuspension in
Versuch 3 ... 108 Tab. 38a: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter des Blutes
zwischen den Gruppen in Versuch 3... 109 Tab. 38b: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter des Blutes
zwischen den Gruppen in Versuch 3... 109 Tab. 39: Vorkommen von γδ-T-Zellen in Milch ... 115 Tab. 40: Prozentuale Verteilung der Zellen in verschiedenen durch
Zentrifugation gewonnenen Milchfraktionen nach DILBAT 1967 ... 121 Tab. 41: Vergleichende Gegenüberstellung von Milchparametern in „gesunden“
(Referenz A, n = 50) und an Mastitis erkrankten Vierteln (n = 68) unter der Berücksichtigung der Analytik auf der Basis einer Signifikanz von
mind. p < 0,05 ... 136
Abbildungen
ABBILDUNGEN
Abb. 1: Untersuchungsschritte für VAG und VGH ... 47 Abb. 2: Auswertung der Vitalitätsmessung ... 56 Abb. 3: Auswertung der MIF am Beispiel der Lymphozyten ... 60 Abb. 4: Zelldifferentialbild unter Berücksichtigung der Eutergesundheit in
Versuch 1 ... 69 Abb. 5: Milchzellausstriche A - H, mikroskopiert bei 1000 –facher
Vergrößerung in Ölimmersion ... 81/82 Abb. 6: KSA – Zelldifferentialbild unter Berücksichtigung der Eutergesundheit.... 85
Abb. 7: ZSM („Kaffeemühle“) – Zelldifferentialbild unter Berücksichtigung der Eutergesundheit ... 85 Abb. 8: Zelldifferentialbild der Milch unter Berücksichtigung der Eutergesundheit
in Versuch 3 ... 95 Abb. 9: Zelldifferentialbild im Blut unter Berücksichtigung der Eutergesundheit
in Versuch 3 ... 97 Abb. 10: Veränderungen der prozentualen Bindungsrate von CD4 und Bo116
an Milchzellen unter Berücksichtigung der Eutergesundheit... 99
Abkürzungen und Termini technici
ABKÜRZUNGEN UND TERMINI TECHNICI
AO Akridinorange
Aqua (mono)dest. Aqua (mono)destillata (einfach destilliertes Wasser) Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) BASO B Basophile Granulozyten Blut
Bo116, Bo139 Bezeichnung für subklonierte Hybridome und die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper
C Complement (Komplement) CD Cluster of Differentiation DNS Desoxyribonukleinsäure
DVG Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft EOS B Eosinophile Granulozyten Blut
EPI Epithelzellen ER Eppendorf Reaktionsgefäß EV Events (Messereignisse) FITC Fluoresceinisothiocyanat
FL 1-4 Detektoren des Durchflußzytometers
FR FACS – Röhrchen
FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht) G-CSF Granulocyte-Colonystimulating factor
(Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor) hgr. hochgradig
IDF International Dairy Federation Ig Immunglobulin
IL Interleukin
k Korrelationskoeffizient KSA Kieler Sedimentausstrich LF elektrische Leitfähigkeit LOG Logarithmus zur Basis 10 LPS Lipopolysaccharid
LYM (B) Lymphozyten (Blut)
Abkürzungen und Termini technici
MAK Makrophagen
mAk monoklonaler Antikörper mgr. mittelgradig
MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) MIF Membranimmunfluoreszenz
min Minute
MNC Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen) MONO B Monozyten Blut
mS Milli-Siemens MT Mikrotiterplatte
n Stichprobengröße NAG(ase) N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase NK Natural Killer Zellen
ns nicht signifikant OL Oben links OR Oben rechts
PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PE Phycoerythrin
PE–Cy5 Phycoerythrin–Cytochrom 5 PI Propidiumiodit
PMN (B) Polymorphkernige Neutrophile Granzulozyten (Blut) s signifikant
SCC Somatic Cell Count (Somatische Zellzahl = Zellgehalt) sd Standardabweichung
SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht) Tab. Tabelle
TCR T-Zellrezeptor (T-Cell-Receptor) TMR Total Mixed Ration
TNF Tumor Nekrose Faktor
TSB Tryptic Soy Broth (Tryptische Soja Boullion) UL Unten links
UR Unten rechts
Abkürzungen und Termini technici
US Untersucher UV Ultraviolett
VAG Viertelanfangsgemelk VGH Viertelhandgemelk VIT Vitalität
WC Workshop Cluster
X Mittelwert, arithmetisch
xg Vielfaches der Erdbeschleunigung Xm Mittlere Fluoreszenzintensität ZSB Zellsuspension Blut
ZSM Zellsuspension Milch
% prozentuale Bindungsrate (Durchflußzytometrie)
+ positiv = Antigen auf der Zelloberfläche nachgewiesen
- negativ = Antigen auf der Zelloberfläche nicht nachgewiesen
Einleitung
1. EINLEITUNG
Der Zellgehalt der Milch ist ein wichtiges, wenn nicht das wichtigste Kriterium der Mastitisdiagnostik. Auch ist seit langem bekannt, daß sich durch eine Mastitis nicht nur die Zahl der Zellen in der Milch erhöht, sondern auch das Verhältnis der einzelnen Zellarten zueinander verändert wird. Vielfach wird der Zelldifferenzierung sogar eine größere Aussagefähigkeit als der Zellzählung zugebilligt. Für den Routineeinsatz ist das bisherige mikroskopische Differenzierungsverfahren jedoch zu zeitaufwendig und fehlerbehaftet, wie aus den bisher hierzu veröffentlichten Daten hervorgeht. Automatisierte Verfahren der Zelldifferenzierung auf der Basis der Impedanzmessung, die vor allem auf die Bestimmung des Anteils der PMN ausgerichtet waren, haben sich nicht durchsetzen können. Eine weitere Möglichkeit für die Zelldifferenzierung stellt die Durchflußzytometrie dar. Das bisher veröffentlichte Datenmaterial erlaubt keine Bewertung ihrer Eignung zur Differenzierung von Milch- oder Blutzellen und der Aussagekraft der so ermittelten Zelldifferentialbilder bezüglich der Eutergesundheit.
Die Durchflußzytometrie in Kombination mit der Membranimmunfluoreszenz hat sich in der Humanmedizin in den letzten Jahren als Verfahren in der Routinediagnostik etabliert. Sie ist in der Diagnostik von Immunschwächeerkrankungen sowie von Tumoren der Immunhistologie, die mikroskopisch ausgewertet wird, überlegen, da sie eine weitgehend untersucherunabhängige, schnellere und genauere Beurteilung des Untersuchungsmaterials ermöglicht. Ihr Einsatz beschränkt sich nicht nur auf aus Blut gewonnene Zellsuspensionen, sondern es können auch andere Proben, wie z.B.
Bronchoalveolarlavagen untersucht werden.
In der Veterinärmedizin findet diese Technik hauptsächlich im Rahmen der Forschung – auf dem Arbeitsgebiet der Kleintiermedizin seit einiger Zeit auch in der Diagnostik – Anwendung. Im Bereich der Milchkunde wird die Durchflußzytometrie zur Zählung der Zellen in der Milch eingesetzt.
Einleitung
Vor diesem Hintergrund wurde mir im Rahmen der Mitarbeit in der Arbeitsgruppe Mastitisfrüherkennung der Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch die Aufgabe übertragen, das Zelldifferentialbild in Milch und Blut unter Berücksichtigung der Eutergesundheit zu ermitteln, wobei neben mikroskopischen Verfahren die Durchflußzytometrie unter Einschluß der Membranimmunfluoreszenz Verwendung finden sollte.
Diese Fragestellung beinhaltet nicht nur einen hohen wissenschaftlichen Anspruch, sondern könnte zu einer Verbesserung der Mastitisdiagnostik unter Feldbedingungen beitragen. Diese praxisorientierte Feststellung ist insbesondere vor dem Hindergrund der häufig nicht befriedigenden Heilungsquoten nach Einsatz medikamentöser Behandlung hervorzuheben.
Für die analytische Auseinandersetzung mit der gewählten Thematik sollten mikroskopische und durchflußzytometrische Techniken für die Substrate Milch und Blut miteinander verglichen werden.
Literaturübersicht
2. LITERATURÜBERSICHT
2.1 Mastitisdiagnostik
Zur sicheren Diagnose erkrankter Milchdrüsen sollten immer mindestens zwei Kriterien (Erreger- und Entzündungsnachweis) herangezogen werden. Die DVG (1994) empfiehlt, den Gehalt somatischer Zellen im Viertelanfangsgemelk mit dem Nachweis mikrobiologischer Erreger zu kombinieren.
Nach GRABOWSKI (2000) sind u.a. die Parameter elektrische Leitfähigkeit, somatische Zellen und N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase für die Erkennung von Eutererkrankungen geeignet. Die zytomikrobiologische Untersuchung wurde kürzlich von der DVG (2000) ausführlich beschrieben.
2.1.1 Zellgehalt in normaler und in Mastitismilch
Die Zählung der somatischen Zellen in der Milch wird als verläßliche und spezifische Methode zur Mastitisdiagnostik angesehen (KITCHEN 1981, TOLLE 1970). 20.000 bis 50.000 Zellen pro ml Milch werden als der normale physiologische Zellgehalt von Milch aus gesunden Drüsenkomplexen mit einem oberen Grenzwert von 100.000 Zellen pro ml Milch bezeichnet (DOGGWEILER u. HESS 1983, HAMANN u.
REICHMUTH 1990, HAMANN 1992, SMITH 1996, DVG 2002). Oberhalb eines Zellgehaltes von mehr als 100.000 Zellen pro ml ändert sich die chemische Milchzusammensetzung und die Milchleistung der Kuh nimmt ab (TOLLE 1970, WOOLFORD 1985, SHOSHANI u. MERMAN 1977, KNIGHT u. PEAKER 1991).
Bakteriologisch positive Milchproben aus entzündeten Milchdrüsen enthalten einen signifikant erhöhten Zellgehalt von bis zu mehreren Millionen Zellen/ml Milch (BLACKBURN 1968, PAAPE et al. 1979, KEHRLI u. SHUSTER 1994, SMITH 1996, LABOHM et al. 1998).
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2.1.2 Physiologische Einflüsse auf den Zellgehalt der Milch
Zu Laktationsbeginn und –ende sowie mit zunehmender Laktationsnummer kann ein erhöhter Zellgehalt beobachtet werden (BLACKBURN 1968, LABOHM et al. 1998).
Nach der Kolostralphase gibt es jedoch keine physiologische Erhöhung der Zellzahl, vielmehr treten mit fortschreitender Laktation und steigender Laktationsanzahl vermehrt Mastitiden auf, die zu einer Zellzahlerhöhung führen (REICHMUTH 1975, DOGGWEILER u. HESS 1983, SMITH 1996).
Auch die Rasse hat einen signifikanten Einfluß auf den Zellgehalt der Milch. Die Schwankungsbreite gesunder Drüsenkomplexe ist aber mit < 5.000 Zellen/ml Milch so gering, daß sie bei der Diagnostik für praktische Belange außer acht gelassen werden kann (DOGGWEILER u. HESS 1983).
Streß in Form von Weideaustrieb, Impfung oder Brunst führt nur dann zu einer Erhöhung des Gehalts somatischer Zellen in der Milch, wenn die Milchdrüse bereits vorgeschädigt ist (HAMANN u. REICHMUTH 1990, HAMANN 1992).
Zur Beurteilung der Zellgehaltes spielt auch die Gemelksfraktion eine gewisse Rolle.
Innerhalb eines Melkvorganges sind das Anfangs- und das Endgemelk zellreicher als das Hauptgemelk (PAAPE u. TUCKER 1966, ÖSTENSSON et al. 1988, HAMANN u.
GYODI 1999).
2.1.3 Methoden zur Zellzählung
2.1.3.1 Prescott und Breed
Die Methode von Prescott und Breed aus dem Jahr 1910 wird als Referenzmethode angesehen. Es werden 0,01 ml Milch auf 1 cm2 ausgestrichen, fixiert, entfettet und mit Methylenblau gefärbt. Anschließend werden mindestens 400 Zellen mikroskopisch gezählt. Mit Hilfe der Anzahl der ausgezählten Felder wird der Zellgehalt pro ml errechnet. Diese Methode ist sehr arbeitsaufwendig und mit vielen
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Fehlerquellen behaftet. Die Verteilung der Zellen auf dem Objektträger ist meistens nicht homogen, und zur Ermittlung des Zellgehaltes pro ml muß mit einem relativ großen Faktor multipliziert werden. Zudem ist die Entscheidung, ob ein gefärbtes Objekt eine Zelle ist, subjektiv (TOLLE et al. 1971, HEESCHEN 1975, IDF 1984, KITCHEN 1981).
2.1.3.2 Coulter Counter
Die erste Automatisierung der Milchzellzählung erfolgte mit dem Coulter Counter, der mit dem Prinzip der Impedanzmessung arbeitet. Nach Fixierung der Zellen mit Formalin wird die Milch mit einem Detergenz verdünnt, so daß unter Hitzeeinwirkung die Fettmicellen zerstört werden. Die Zellen werden anschließend einzeln zwischen zwei Elektroden hindurchgeleitet. Die Zellen verdrängen dort eine hochleitende Flüssigkeit und vergrößern dadurch den elektrischen Widerstand. Es entstehen Spannungsimpulse in Abhängigkeit von der Partikelgröße. Die Anzahl der Impulse gibt die Anzahl der Partikel wieder, die die Elektroden passiert haben (TOLLE et al.
1968, HEESCHEN 1975, IDF 1984). Auch einige Blutanalysengeräte messen nach diesem Prinzip die Anzahl von Leukozyten, Erythrozyten und Thrombozyten im Blut.
2.1.3.3 Fossomatic
Dieses Verfahren beruht auf der Zählung fluoreszierender Partikel. Die Milchprobe wird dazu mit einem Puffer und einer Färbelösung vermischt. Als Farbstoff wird Ethidiumbromid eingesetzt, das die DNS der Zellen anfärbt und unter UV- oder Laseranregung fluoresziert. Ursprünglich wurde die Probe auf eine rotierende Scheibe aufgesprüht und vollautomatisch mikroskopisch ausgewertet. Die neueren Geräte arbeiten heute nach dem Prinzip der Durchflußzytometrie. Beiden Verfahren ist gemeinsam, daß jedes fluoreszierende Partikel in einen elektrischen Impuls umgewandelt wird, der nach Verstärkung registriert werden kann. Der Zellgehalt wird
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vom Gerät in Tausend pro ml angegeben (HEESCHEN 1975, IDF 1984, HEESCHEN et al. 1993, UBBEN et al. 1997).
2.1.4 NAGase-Aktivität
N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase (NAGase) ist ein intra- und extrazellulär wirksames lysosomales Enzym, für das eine gesteigerte Aktivität im Rahmen der Infektionsabwehr, u.a. im Zusammenhang mit Mastitiden, nachgewiesen wurde (SANDHOLM u. MATTILA 1985, SCHÜTTEL 1999, GRABOWSKI 2000). Als Hauptquelle in der Milch gelten vor allem Makrophagen, aber auch PMN. Die Aktivität des Enzyms im Substrat Milch kann im Falle einer Mastitis um das Zehnfache ansteigen und korreliert relativ eng mit der Zellzahl. Sie ist daher auch als Kriterium für das frühzeitige Erkennen einer subklinischen Mastitis geeignet und hier der Zellzahl evtl. sogar überlegen. Zumindest kann ihre Aussagefähigkeit in der Mastitisdiagnostik mit derjenigen der Zellzahl gleichgestellt werden (SCHULTZE 1985, HAMANN et al. 1999). Ein weiterer Vorteil dieses empfindlichen Indikators der Eutergesundheit ist, daß er nicht von Allgemeinerkrankungen beeinflußt wird (KRÖMKER et al. 1999).
Die Aktivitätsmessung erfolgt nach dem fluoreszenzoptischen Prinzip im Mikrotiterplattenverfahren. Die Aktivität wird zunächst in nmol x min–1 x ml–1 angegeben. Da die Werte ähnlich wie die Zellzahl nicht normalverteilt sind, werden sie für statistische Berechnungen logarithmiert (NOGAI et al. 1996, SCHÜTTEL 1999).
2.1.5 Elektrische Leitfähigkeit
Die elektrische Leitfähigkeit der Milch wird bestimmt durch die Konzentration und Beweglichkeit der dissoziierten Ionen (vor allem Chlorid-, Kalium- und Natrium-Ionen) in der Milch. Im physiologischen Gleichgewicht ist die Kaliumionenkonzentration in
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der Milch höher als im Blut, während es sich für Natrium- und Chloridionen umgekehrt verhält. Dieses Konzentrationsgefälle wird von der Blut/Euterschranke aufrechterhalten. Wird diese durch eine Euterentzündung geschädigt, so erhöht sich ihre Permeabilität, wodurch es zum Einstrom von Natrium- und Chloridionen in die Milch kommt (SCHULTZE 1985, HAMANN 1999).
Schon unter physiologischen Bedingungen wird die elektrische Leitfähigkeit maßgeblich von vielen Faktoren beeinflußt, darunter Laktationsstadium, Rasse und Melkintervall. Auch der Fettgehalt der Milch spielt eine Rolle, da die Fettmicellen die Ionenbeweglichkeit herabsetzen. Eine umfassende Literaturstudie zur Eignung der elektrischen Leitfähigkeit für die Mastitisdiagnostik wurde 1998 von HAMANN und ZECCONI veröffentlicht (IDF-Bulletin Nr. 334).
Die elektrische Leitfähigkeit ist zwar prinzipiell als Parameter für die Erkennung von Eutererkrankungen geeignet, und oberhalb eines Grenzwertes von 6,5 mS/cm besteht nur noch ein geringes Risiko für falsch positive Befunde. Aufgrund ihrer hohen physiologischen Variabilität ist ihre diagnostische Aussagefähigkeit jedoch als gering einzuschätzen. Die elektrische Leitfähigkeit sollte daher nur in Kombination mit weiteren Parametern zur Mastitisdiagnostik eingesetzt werden (HAMANN 1999, GRABOWSKI 2000, HAMANN u. ZECCONI 1998). Eine weitere Möglichkeit der Bewertung dieses Parameters ist der Vergleich innerhalb der Euterviertel, da der Wahrscheinlichkeit nach eine intramammäre Infektion die einzige Einflußgröße ist, die nur ein einzelnes Viertel befällt (SCHULTZE 1985).
Die elektrische Leitfähigkeit kann einerseits mit Handgeräten als sogenannter „Cow side test“, andererseits auch automatisch durch fest in die Melkeinheit integrierte Sensoren gemessen werden (SCHULTZE 1985). In automatischen Melksystemen wird diese Möglichkeit zur automatischen Überwachung der Eutergesundheit eingesetzt.
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2.2 Mikroskopische Zelldifferenzierung 2.2.1 Geschichte
Die Differenzierung von somatischen Milchzellen wird seit fast 100 Jahren durch- geführt. Bis 1926 wurden keine prozentualen Verteilungen angegeben. Die Unterscheidung erfolgte zwischen Leukozyten (heute PMN), Lymphozyten, Makrophagen und Epithelzellen. Dabei ist zu beachten, daß sich die Bedeutung des Begriffs „Leukozyten“ gewandelt hat: Heute bezeichnet er nicht mehr die Zellart der neutrophilen Granulozyten oder PMN, sondern ist eine Sammelbezeichnung für alle Abwehrzellen. Bis 1947 wurden fast alle großen Zellen den Makrophagen bzw.
Histiozyten zugerechnet, anschließend wurden sie fast ausschließlich als Epithelzellen eingeordnet. Seit 1977 werden aufgrund elektronenmikroskopischer Untersuchungen die mononukleären Zellen der Milch mit einer Größe von 8 – 30 µm als Makrophagen identifiziert (MIELKE u. KOBLENZ 1980, LEE et al. 1980, PAAPE et al. 1981). Auch der Anteil der PMN in normaler Milch schwankt in den Untersuchungen zwischen 1 % und 58 %, wobei normale Milch nicht genau definiert ist. Seit 1932 wurde bei der differenzierten Betrachtung der Milchzellen ein Unterschied in der Zusammensetzung zwischen normaler und Mastitismilch festgestellt, der sich in einem höheren Anteil PMN in Mastitismilch ausdrückt (MIELKE u. KOBLENZ 1980). Bei der Betrachtung derartiger Zahlen sollten aber die Schwankungen in der Definition normaler Milch bedacht werden. Der Grenzwert für die Anzahl somatischer Zellen in Milch aus gesunden Milchdrüsen, der seit 1970 mit 100.000 Zellen pro ml definiert ist (TOLLE et al. 1971, DOGGWEILER u. HESS 1983, DVG 1994), wird bis heute in vielen Untersuchungen nicht berücksichtigt.
Häufig wird auch Milch mit einer Zellzahl größer 100.000 Zellen pro ml als normal definiert (BLACKBURN 1968, LEE et al. 1980, MIELKE u. KOBLENZ 1980, KITCHEN 1981, KURZHALS et al. 1985, CONCHA 1986, PARK et al. 1992, LEITNER et al. 1995, LEUTENEGGER et al. 2000, SURIYASATHAPORN et al.
2000), oder es wird keine Definition der verwendeten Milch angegeben (LEE et al.
1980, HAGELTORN u. SAAD 1986, PAAPE et al. 1996)
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2.2.2 Methoden zur Herstellung von Milchausstrichen
Das Ziel der unter 2.1.3.1 beschriebenen Methode von PRESCOTT und BREED aus dem Jahr 1910, die auf dem direkten Ausstrich der Milch beruht, ist die reine Zellzählung. Für die Zelldifferenzierung wird zunächst durch Zentrifugation das zellreiche Sediment der Milch gewonnen und dann mit unterschiedlichen Techniken auf den Objektträger aufgebracht.
2.2.2.1 Kieler Sedimentausstrich
Dieses Ausstrichverfahren geht auf SELEMANN et al. (1936) zurück. Nach der ursprünglichen Methode wird die Milch zunächst auf 85°C erhitzt, dann für zehn Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment wird mit einer Öse auf einer Fläche von 3 cm2 ausgestrichen und nach Lufttrocknung für ca. 5 Sekunden mit Toluidinblau oder für ca. 10 Minuten mit Methylenblau gefärbt. In späteren Methodenbeschreibungen wurde die Erhitzung der Probe weggelassen. Hauptziel dieses Ausstrichverfahrens war die semiquantitative Zellzahlbestimmung. Durch die Automatisierung der Zellzählung in Milch hat es hier jedoch seine Bedeutung verloren (DILBAT 1963, KRAFT 1994, HAMANN et al. 2001).
2.2.2.2 Cytospin
DULIN et al. (1982) haben eine heute weit verbreitete Methode zum Ausstreichen des Milchsediments beschrieben. Cytospin ist eine Zentrifuge für Objektträger, auf denen eine Probenkammer fixiert ist. Durch saugfähiges Papier ist direkt unter der Kammer eine runde Fläche mit einem Durchmesser von ca. 5 mm begrenzt. Nur diese Fläche wird später mikroskopiert.
Zur Gewinnung des Sediments werden 1 ml Milch mit 8 ml eiskaltem PBS für 10 Minuten bei 180 xg zentrifugiert. Je nach Pelletgröße wurde das Pellet in nur 0,2 ml
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TSB oder zusätzlich 2 ml PBS resuspendiert. 0,2 ml der Zellsuspension wurden in die Cytospinkammer überführt und bei 225 xg für 10 Minuten zentrifugiert. Vor dem Färben nach Wright werden die Ausstriche luftgetrocknet.
2.2.3 Zellmorphologie
2.2.3.1 Allgemeines
Die Anfertigung von Milchausstrichen zur Zelldifferenzierung ist schwierig, und es ist unmöglich, die Qualität von Blutausstrichen zu erreichen (MIELKE u. KOBLENZ 1980, DULIN et al. 1982, MILLER et al. 1993). Entsprechend fehleranfällig ist die Zelldifferenzierung, was sicherlich ein Grund für die z.T. sehr unterschiedlichen Ergebnisse der einzelnen Forscher ist. Gerade Makrophagen und Epithelzellen sind so nur schwer zu unterscheiden, weil sie gleich groß sind und beide Fetteinschlüsse enthalten können. Des weiteren führt die Tatsache, daß nicht eindeutig differenzierbare Zellen aus dem Zelldifferentialbild ausgeschlossen werden, ebenfalls zu Verzerrungen (MIELKE u. KOBLENZ 1980, LEE et al. 1980). Diese Aspekte sind stark vom Untersucher abhängig, da er, selbst nach gründlicher Einweisung, letztendlich selber seine Kriterien für die Unterscheidung der Zellen festlegen muß.
Die folgende Beschreibung der unterschiedlichen Zellmorphologien basiert hauptsächlich auf licht- und elektronenmikroskopischen Analysen von Milch-, aber auch von Blutleukozyten (SCHÖNBERG 1956, PAAPE et al. 1979, MIELKE u.
KOBLENZ 1980, LEE et al. 1980, LUDEWIG 1996, LIEBICH 1993). In Tab. 1 sind die Zellmorphologien schematisiert zusammengefaßt.
2.2.3.2 PMN
Neutrophile Granulozyten oder auch PMN (Polymorphonuclear Neutrophils) sind an einem intensiv gefärbten, stabförmigen oder gelappten Kern und an kleinen dichten
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Granula im Zytoplasma zu erkennen. Ihre Größe beträgt 10 – 14 µm. Enthalten sie jedoch Fettvakuolen, können sie einen ähnlichen Umfang wie Makrophagen erreichen.
2.2.3.3 Eosinophile Granulozyten
Eosinophile Granulozyten haben die gleiche Zellgröße und Kernform wie PMN; sie enthalten jedoch eosinophile Granula, die mit 0,5 – 1,5 µm etwas größer als die neutrophilen Granula sind.
2.2.3.4 Basophile Granulozyten
Auch basophile Granulozyten haben einen gelappten Kern, sind mit 9 –12 µm durchschnittlich aber etwas kleiner als PMN. Ihr Zytoplasma enthält 1,5 µm große basophile Granula, die den Kern überlagern können.
2.2.3.5 Lymphozyten
Die 5 - 10 µm großen Lymphozyten zeichnen sich durch einen runden bis ovalen Kern mit wenig oder keinem umgebenden Zytoplasma aus. Kern und Zytoplasma sind dichter, d.h. intensiver gefärbt als bei kleinen Monozyten bzw. Makrophagen.
Aktivierte Lymphozyten können bis zu 25 µm groß werden. Obwohl Lymphozyten funktionell eine sehr heterogene Zellpopulation sind, können sie im Ausstrich nicht weitergehend unterteilt werden.
2.2.3.6 Monozyten
Monozyten sind 12 – 20 µm groß und haben einen runden bis nierenförmigen Kern.
Im schwach basophilen Zytoplasma liegen azurophile Granula.
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2.2.3.7 Makrophagen
Makrophagen kommen in einer Größe von 8 - 30 µm vor und ihr Zellkörper ist 0,5 - 10 mal größer als der Kern. Das Zytoplasma enthält häufig nicht angefärbte Vakuolen. Der Kern, der in sehr vielfältigen Formen vorkommt, besteht aus diffusem Chromatin und wird daher schwächer angefärbt als der Kern von PMN oder Lymphozyten. Ihre Größe nimmt mit der Menge phagozytierter (Fett-) Partikel zu und kann auch deutlich über 18 µm liegen.
2.2.3.8 Epithelzellen
Epithelzellen kommen meist als Klumpen von 4-16 Zellen vor. Ihre Zellkerne sind groß und rund; das Verhältnis zwischen Kern und Zytoplasma beträgt 1:2 - 3.
Tab. 1: Zellmorphologie von Milchzellen
Zellart Größe Kern Zytoplasma
PMN 10 – 14 µm intensiv gefärbt, stabförmig oder gelappt
dichte neutrophile Granula; 0,5 – 1 µm Eosinophile
Granulozyten
10 – 14 µm intensiv gefärbt, stabförmig oder gelappt
eosinophile Granula; 0,5 – 1,5 µm
Basophile Granulozyten
9 – 12 µm intensiv gefärbt, stabförmig oder gelappt
basophile Granula; 1,5 µm
Lymphozyten/
Blasten
5 – 10 µm bis 25 µm
intensiv gefärbt, rund bis oval
sehr wenig, intensiv gefärbt
Makrophagen 8 – 30 µm schwach gefärbt, vielfältige Formen
schwach gefärbt, oft nicht angefärbte Vakuolen Epithelzellen 10 – 14 µm intensiv gefärbt, groß und
rund
schwach gefärbt, nicht angefärbte Vakuolen
möglich
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2.2.4 Zelldifferentialbild in Milch einer gesunden Milchdrüse
Seit den 1980er Jahren ist bekannt, daß die Makrophagen die größte Zellfraktion in der Milch bilden, gefolgt von Lymphozyten, PMN und Epithelzellen. Wie aus Tab. 2 hervorgeht, herrscht noch keine Einigkeit darüber, wie groß der Anteil der einzelnen Zellpopulationen in normaler Milch genau ist. Das von PAAPE et al. (1981) veröffentlichte Zelldifferentialbild von 60 % Makrophagen, 28 % Lymphozyten, 10 % neutrophile Granulozyten (PMN) und 2 % Epithelzellen wird von anderen Autoren am häufigsten zitiert (CONCHA 1986, BURVENICH et al. 1995, KELLY et al. 2000).
Tab. 2: Zelldifferentialbild in Milch einer gesunden Milchdrüse Zellart
Quelle MAK LYM PMN EPI
0 %1) 5 %1) 95 %1) Paape et al. 1979
3 %2) 22 %2) 75 %2)
Lee et al. 1980 80 % 16 % 3 % 1 % Paape et al. 1981 60 % 28 % 10 % 2 % Kurzhals et al. 1985 63 % 1,5 % 34 % 2,4 % Wever u. Emanuelson
1989 48 % 15 % 37 %
Miller et al. 1991 30 % 24 % 26 % 19 % Östensson 1993 74 % 14 % 12 %
1) Kühe MAK = Makrophagen, LYM = Lymphozyten
2) Färsen PMN = neutrophile Granulozyten, EPI = Epithelzellen
Des weiteren wird eine Abhängigkeit der Zellzusammensetzung von Laktationsstadium und –nummer sowie der Gemelksfraktion beschrieben (BLACKBURN 1966, PAAPE u. Tucker 1966, ÖSTENSSON et al. 1988, MILLER et al. 1991, ÖSTENSSON 1993).
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So nimmt mit steigender Laktationsnummer der Gehalt somatischer Zellen in der Milch zu, wobei die PMN die Hauptträger dieses Anstiegs sind und sich ihr Anteil an der Gesamtzellzahl erhöht. (BLACKBURN 1966 u. 1968, BURVENICH et al. 1995, LABOHM et al. 1998). Diese Beobachtungen entsprechen dem Zelldifferentialbild der Milch während einer Euterentzündung (siehe 2.2.5), so daß der Einfluß der Laktationsnummer eigentlich auf eine erhöhte Infektionsrate älterer Tiere zurückzuführen ist (WEVER u. EMANUELSON 1989).
Ähnlich zu interpretieren ist die Darstellung, daß zu Laktationsbeginn der Anteil der Makrophagen am größten ist und gegen Laktationsende sowohl der absolute Milchzellgehalt als auch der PMN-Anteil ansteigen (BLACKBURN 1966, CONCHA 1986, BURVENICH et al. 1995). Die Dominanz der Makrophagen zu Laktationsbeginn ist unbestritten, gegen Laktationsende findet in gesunden Milchdrüsen jedoch ein gleich starker Anstieg von Lymphozyten und Epithelzellen statt (ÖSTENSSON et al. 1988). Der Anteil der Epithelzellen von im Mittel unter 2 % kann bei Färsen in den ersten 4 Laktationswochen auf bis zu 15 % steigen (MILLER et al. 1991, BURVENICH et al. 1995).
2.2.5 Zelldifferentialbild in Milch einer erkrankten Milchdrüse
Die Hauptreaktion der Milchdrüse auf eine Infektion ist das schnelle Einströmen von PMN, in weit geringerem Maß auch von Lymphozyten und Makrophagen, in die Milch, wodurch der Zellgehalt der Milch auf einige Millionen Zellen pro ml steigen kann. In der akuten Phase der Entzündung stellen die PMN bis zu 95 % der somatischen Milchzellen (BLACKBURN 1968, PAAPE et al. 1979, KURZHALS et al.
1985, ÖSTENSSON 1993, BURVENICH et al. 1995, LABOHM et al. 1998).
Die Höhe des Zellinflux in ein infiziertes Viertel ist u.a. von der Erregerart abhängig.
Ab dem siebten Tag post infectionem nimmt der Anteil der PMN ab und derjenige der Lymphozyten zu. Bei subklinischen und chronischen Mastitiden stellen auch die
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Makrophagen wieder einen größeren Anteil an den somatischen Zellen in der Milch (CONCHA 1986, ÖSTENSSON 1993, LEITNER et al. 1995, LABOHM et al. 1998).
2.2.6 Zelldifferentialbild des Blutes
Im Blut des Rindes kommen physiologischer Weise 25 – 35 % PMN (Neutrophile Granulozyten), 5 – 6 % Eosinophile Granulozyten, < 1 % Basophile Granulozyten, 55 – 65 % Lymphozyten und 5 – 10 % Monozyten vor. Die Morphologie der Zellen entspricht der Beschreibung unter 2.2.2 (LIEBICH 1993). In der akuten Phase einer bakteriellen Infektion sinkt zunächst der Anteil der PMN auf ca. 18 %, um nach sieben Tagen über das physiologische Maß hinaus auf ca. 80 % anzusteigen. Nach ca. zehn Tagen nimmt dann der Anteil der Lymphozyten zu, oft begleitet von einer Eosinophilie (BICKHARDT 1992, BURVENICH et al. 1994).
2.3 Durchflußzytometrische Zelldifferenzierung 2.3.1 Differenzierung aufgrund der Zellmorphologie
Wie unter 2.1.3.3 beschrieben, mißt ein Durchflußzytometer prinzipiell leuchtende Partikel. Ein auf die Zellanalytik ausgelegtes Gerät erfaßt zusätzlich zu verschiedenen Farben noch Größe und Struktur der Zellen.
Die Anfärbung der DNS und RNS mit einer 0,0004 %igen Acridinorangelösung kann genutzt werden, PMN, Lymphozyten, Makrophagen und Monozyten in Blut und Milch zu unterscheiden (HAGELTORN u. SAAD 1986). Für die Messung wird die Milch lediglich 1:200 mit der Färbelösung verdünnt. Im Gegensatz zu PMN und Lymphozyten konnte in einem Koordinatensystem, in dem Partikelgröße gegen Partikelstruktur dargestellt wurden, für Monozyten und Makrophagen keine Region festgelegt werden. Mit Hilfe einer Sortiereinrichtung am Durchflußzytometer wird die Zelldifferenzierung mikroskopisch bestätigt. Nach längerer Lagerung der Milchproben
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veränderte sich die Wolke der PMN derart, daß eine Abgrenzung gegen die Lymphozyten erschwert wurde.
Wird für die Zelldifferenzierung auf die mikroskopische Kontrolle verzichtet, so kann der Anteil der Makrophagen rechnerisch ermittelt werden, indem die Summe der PMN und Lymphozyten von allen gemessenen Zellen abzogen wird (ÖSTENSSON et al. 1988, ÖSTENSSON 1993).
Auch der DNS-Farbstoff Carboxydimethylfluoreszeindiazetat ist dafür geeignet, intakte lebende Zellen von Zellfragmenten zu unterscheiden. Vor der durchflußzytometrischen Analyse werden durch Zentrifugation die Zellen aus der Milch separiert. Bisher wurde mit dieser Methode lediglich der Anteil der PMN bestimmt (MILLER et al. 1993).
Durch die Kombination der DNS-Farbstoffe SYBR green 1 und Propidiumiodid können durchflußzytometrisch durch Zentrifugation gewonnene Milchzellen in PMN und mononukleäre Zellen differenziert werden. Diese Farbstoffkombination ermöglicht es, nur lebende Zellen in der Auswertung zu berücksichtigen, wodurch die Abgrenzung der Zellpopulationen verbessert wird (PILAI et al. 2000).
2.3.2 Differenzierung mit Hilfe monoklonaler Antikörper
2.3.2.1 Herstellung monoklonaler Antikörper
Monoklonale Antikörper werden mit Hilfe von tumorös entarteten Plasmazellen der Maus, den Myelomzellen, hergestellt. Nach Immunisierung einer Maus gegen ein bestimmtes Antigen werden Milzzellen dieser Maus mit Myelomzellen fusioniert.
Durch mehrere Schritte werden die so gewonnenen Hybridomzellen vereinzelt, so daß Zellklone entstehen, die sich aus einer einzigen Zelle gebildet haben und nur monoklonale Antikörper eines Isotyps und einer Spezifität produzieren. In weiteren Schritten wird dann die genaue Spezifität des Antikörpers ermittelt, so daß er analytisch eingesetzt werden kann. Solche Antikörper können durch chemische
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Reaktionen an ihrem unspezifischen Teil mit Fluorochromen, Enzymen oder anderen Molekülen gekoppelt werden, um sie sichtbar zu machen (JANEWAY u. TRAVERS 1997). Zur Differenzierung einzelner Zellpopulationen und zellulärer Subpopulationen werden diese Antikörper in der Membranimmunfluoreszenz eingesetzt (siehe 3.5.3.3).
2.3.2.2 Cluster of Differentiation
Die Oberflächenstrukturen von Zellen können in Haupthistokompatibilitätskomplex, Antigenrezeptoren und Differenzierungsantigene unterteilt werden. Letztere werden allgemein „Cluster of Differentiation“ (CD) genannt und durchnummeriert. Diese aus der Humanmedizin stammende Bezeichnung wurde auch in der Tiermedizin übernommen. Eine CD-Bezeichnung wird aber erst vergeben, wenn festgestellt wurde, daß die gefundene Struktur mit der menschlichen übereinstimmt. Das geschieht in internationalen Workshops. Konnte keine korrespondierende humane Struktur gefunden werden, so erhält die Struktur beim Rind die Bezeichnung
„Workshop Cluster“ (WC1). Beide Bezeichnungen sagen nichts über die Funktion der Oberflächenstruktur aus (MORRISON et al. 1991, JANEWAY u. TRAVERS 1997).
Die CD-Moleküle können auch polymorph vorkommen, wie dies z.B. für das bovine CD4 beschrieben wurde. Durch den Vergleich von zwölf gegen CD4 gerichtete Antikörper wurden unterschiedliche Bindungsverhalten festgestellt (BENSAID u.
HADAM 1991, MORRISON et al. 1991).
Im folgenden wird auf diejenigen Oberflächenstrukturen näher eingegangen, deren Expression unter Berücksichtigung der Eutergesundheit mit Hilfe der Membranimmunfluoreszenz im Rahmen der vorgelegten Arbeit untersucht wurde.
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2.3.2.3 Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II
Das bovine MHC (Major Histocompatibility Complex) Klasse II Molekül kann auf der Oberfläche von professionellen antigenpräsentierenden Zellen nachgewiesen werden. Dazu gehören u.a. B-Zellen, Makrophagen und dendritische Zellen.
Überdies werden diese Moleküle auf aktivierten Zellen exprimiert, z.B. aktivierten T- Zellen. Die Expression wird durch Zytokine, v.a. Interferon-γ, reguliert (PASTORET et al. 1998). Diese Präsentation von antigenen Peptiden ist ein wichtiger Bestandteil der Immunregulation.
2.3.2.4. TCR1
Die im Mikroskop nicht weiter unterteilbare Population lymphoider Zellen der Milch läßt sich anhand von Oberflächenstrukturen in drei große Subpopulationen einteilen:
B-Zellen, αβ-T-Zellen mit dem T-Zellrezeptor (TCR) 2 und γδ-T-Zellen mit dem TCR1 (WYATT et al. 1996).
Bovine γδ-T-Zellen sind eine heterogene Gruppe, deren Bedeutung noch nicht abschließend geklärt ist. Es wird vermutet, daß sie ein Teil des angeborenen Überwachungssystems sind, das insbesondere im Darmtrakt und in der Milchdrüse eine wichtige Verteidigungslinie gegen Infektionen darstellt. Bei Jungtieren ist ihre Population größer als bei adulten. γδ-T-Zellen werden vor allem in Schleimhäuten nachgewiesen und sind in der Milz, der Milchdrüse und dem Darmepithel besonders häufig zu finden. Dort sollen sie immunregulatorische Funktionen haben. In Wiederkäuern rezirkuliert ein Großteil dieser Lymphozytenpopulation zwischen Blut, Gewebe und Lymphe und ist in den peripheren Körperkompartimenten weit verteilt (PARK et al. 1992, WYATT et al. 1994, DAVIS et al. 1996, MACHUGH et al. 1997, FERENS et al. 1998, DAUBENBERGER et al. 1999, SOLTYS u. QUINN 1999)
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2.3.2.5 WC1
WC1 ist ein vom T-Zell-Rezeptor unabhängiger Marker für γδ-T-Zellen, dessen Funktion noch ungeklärt ist. Es wird jedoch spekuliert, daß sie derjenigen von CD4 und CD8 ähnelt, d.h. daß dieses Molekül ein Korezeptor des T-Zellrezeptors ist (DAUBENBERGER et al. 1999, VAN KAMPEN et al. 1999).
2.3.2.6 CD4
CD4 wird von einer großen Subpopulation der αβ-T-Zellen sowie einem kleinen Teil der γδ-Lymphozyten als Korezeptor exprimiert. Die CD4-positiven (CD4+) T- Helferzellen erkennen die von MHC Klasse II präsentierten Peptide und aktivieren u.a. durch die Sekretion von Zytokinen die Makrophagen dazu, phagozytierte Bakterien abzutöten (JANEWAY u. TRAVERS 1997, FERENS et al. 1998, DAUBENBERGER et al. 1999, RIOLLET et al. 2000).
2.3.2.7 CD8
Analog zu CD4 wird auch CD8 von einer großen Subpopulation der αβ-T-Zellen sowie einem kleinen Teil der γδ-Lymphozyten als Korezeptor exprimiert. CD8+ αβ-T- Zellen können entweder zytotoxische oder suppressive Lymphozyten sein. Sie reagieren auf von MHC Klasse I präsentierte Antigene. Zytotoxische Lymphozyten töten viral oder tumorös entartete Zellen ab, während suppressive Lymphozyten durch die Sekretion spezifischer Zytokine die Immunantwort herunterregulieren (JANEWAY u. TRAVERS 1997, FERENS et al. 1998, DAUBENBERGER et al. 1999, RIOLLET et al. 2000).
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2.3.2.8 CD14 (LPS-Rezeptor)
CD14 kommt auf der Oberfläche boviner Monozyten, Makrophagen und einer Subpopulation der PMN vor. Er ist ein Rezeptor für den Komplex aus Lipopolysaccharid (LPS) und LPS-Bindungsprotein. Die Bindung an diesen Rezeptor löst in Monozyten und Makrophagen u.a. die Synthese von Interleukin (IL) -1, IL-6, IL-8, dem Tumornekrosefaktor (TNF) α und dem Granulozytenkoloniestimulierenden Faktor (G-CSF) aus.
Die Bindung an CD14 steht somit am Anfang einer Entzündungsreaktion. CD14 wird auch als Marker für Makrophagen eingesetzt (ADLER et al. 1994, SOPP et al. 1996, BERTHON u. HOPKINS 1996).
2.3.3 Zelldifferentialbild einer gesunden Milchdrüse
Bei der durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung mit Hilfe von Antikörpern wird nur selten der prozentuale Anteil von PMN, Lymphozyten und Makrophagen an allen Zellen angegeben, sondern meistens werden Aussagen über die Expression von Oberflächenstrukturen, das Reaktionsmuster von Subpopulationen bzw. ihr Verhältnis zueinander gemacht.
2.3.3.1 Phagozyten
In der Milch normal laktierender Kühe konnte auf ca. 68 % der PMN CD14 und auf ca. 80 % CD11b nachgewiesen werden. Für CD18 schwanken die Angaben zwischen 65 und 88 % (PAAPE et al. 1996, RIOLLET et al. 2001).
35% der großen mononukleären Zellen (große MNC) tragen CD14 und 55 % CD18 auf ihrer Oberfläche. Für den Anteil der Makrophagen an den MNC besteht eine Abhängigkeit vom Laktationsstadium: er ist mit 69 % peripartal am größten und sinkt
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im Laktationsverlauf auf 21 % (PARK et al. 1992, PAAPE et al. 1996, RIOLLET et al.
2001).
2.3.3.2 Lymphozyten
Durchschnittlich sind in der Milch 20 % der Lymphozyten B-Lymphozyten und 45 % T-Lymphozyten, ihre Anteile sind jedoch erheblichen Schwankungen unterlegen (CONCHA et al. 1978, PAAPE et al. 2000). Der Anteil der B-Lymphozyten zeigt einen ähnlichen Verlauf wie derjenige der Makrophagen: er schwankt zwischen 25 % peripartal und 7 % in der Laktation. Die T-Lymphozyten verhalten sich entgegengesetzt: im Geburtszeitraum stellen sie 16 % der Lymphozyten, später 62 % (PARK et al. 1992, VAN KAMPEN u. MALLARD 1997). Mit Hilfe eines Antikörpers gegen den B-Zellmarker CD21 können in der Lymphozytenpopulation der Milch nur ca. 1 % B-Lymphozyten nachgewiesen werden, mit dem T-Zellmarker CD2 aber ca. 60 % T-Lymphozyten (RIOLLET et al. 2001).
Tab. 3 stellt den Anteil der CD4+ und CD8+ Zellen an den T-Lymphozyten dar. Das Verhältnis dieser beiden Zellarten (CD4/CD8) ist < 1 (YAMAGUCHI et al. 1999, PAAPE et al. 2000). Beide Subpopulationen unterliegen einem Laktationseinfluß. In der Frühlaktation ist der Anteil der CD8+ Zellen am größten und nimmt im Laktationsverlauf ab. Bei den CD4+ Zellen verhält es sich genau umgekehrt (ASAI et al. 1998).
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Tab. 3: Größe der CD4+ und CD8+ Lymphozytensubpopulationen in Blut und Milch Antigen
Quelle CD4 CD8 Substrat Bezug
8 – 28 % 8 – 34 % Milch Lymphozytenmorphologie Park et al. 1992
25 – 31 % 16 – 21 % Blut Lymphozytenmorphologie Schmaltz et al.
1996 35 – 42 % 58 – 65 % Milch CD3+ Lymphozyten Taylor et al. 1997 32 – 33 % 47 – 49 % Milch T-Lymphozygen
10 – 27 % 35 – 40 % Milch CD3+ Lymphozyten Van Kampen et al.
1999
33 – 40 % 10 – 18 % Blut CD3+ Lymphozyten 24 ± 14 % 59 ± 13 % Milch CD2+ Lymphozyten Asai et al. 2000
67 ± 6,2 % 20 ± 3,6 % Blut CD2+ Lymphozyten Riollet et al. 2001 33 % 21 % Milch Lymphozytenmorphologie
Die Population der γδ-T-Zellen bildet mit ca. 29 % die dritte große Lymphozytenfraktion in der Milch, ca. 13 % davon sind CD8+ γδ-T-Zellen. Zur Geburt sind ca. 20 % Lymphozyten in der Milch WC1+, in der Laktation geht ihr Anteil auf ca.
15 % (VAN KAMPEN et al. 1999) bzw. 5 % (RIOLLET et al. 2001) zurück.
MHC II wird von ca. 6 % der Lymphozyten exprimiert (RIOLLET et al. 2001).
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2.3.4 Zelldifferentialbild einer erkrankten Milchdrüse
Viele der im Folgenden aufgeführten Daten beruhen auf durch LPS- bzw.
Toxininstillation in die Milchdrüse künstlich hervorgerufenen Mastitiden oder aber auf experimentellen Infektionen v.a. mit Staphylococcus (S.). aureus, nicht jedoch auf Felduntersuchungen.
2.3.4.1 Phagozyten
PMN aus abnormaler Milch tragen kein CD14 auf ihrer Zelloberfläche, aber CD18 wird auf allen PMN nachgewiesen. Der Anteil CD11b exprimierender PMN liegt wie in normaler Milch bei 80 %, die Expressionsdichte ist aber signifikant niedriger (SOLTYS u. QUINN 1999, RIOLLET et al. 2001).
CD14 wird von 25 %, CD18 von 95 % der großen MNC exprimiert mit einer im Vergleich zur gesunden Milchdrüse um das dreifache gestiegenen Expressionsdichte (PAAPE et al. 1996).
In Tab. 4 werden die Ergebnisse einer Studie mit intrazisternaler LPS-Instillation zusammenfassend für Blut und Milch dargestellt.
Tab. 4: Durchflußzytometrisches Zelldifferentialbild der Phagozyten in Blut und Milch vor und nach einer intrazisternalen LPS-
Injektion (PAAPE et al. 1996)
CD14 vor CD14 nach CD 18 vor CD 18 nach PMN Milch 68 % 0 % 65 – 88% 100 %
PMN Blut 3 % 0 % 93 % 90 %
große MNC Milch
35 % 25 % 55 % 95 %
große MNC Blut 63 % 61 % 95 % 99 %
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2.3.4.2 Lymphozyten
Durch eine Mastitis nimmt die Dichte der CD4-Moleküle auf der Zelloberfläche zu und es erhöht sich der Anteil der T-Helferzellen (CD4+) innerhalb der Lymphozytenpopulation und wird größer als derjenige der CD8+ Zellen. Dieser Anstieg scheint jedoch je nach Infektionserreger unterschiedlich stark auszufallen.
So wurde beispielsweise beschrieben, daß im Vergleich zu Escherichia (E.) coli und S. aureus bei durch Streptokokken verursachten Mastitiden ein geringer Anstieg des Anteils der CD4+ Zellen stattfindet. Für CD8+ Zellen wurde sowohl eine Vergrößerung als auch eine Verkleinerung dieser Lymphozytensubpopulation beschrieben, während für die Expressionsdichte keine Veränderung gefunden wurde (LEITNER et al. 1995, TAYLOR et al. 1997, SOLTYS u. QUINN 1999, RIVAS et al. 2000, RIOLLET et al. 2001)
Der Anteil der γδ-T-Zellen an den Lymphozyten steigt auf ca. 14 % und scheint unbeeinflußt von der Erregerspezies zu sein (SOLTYS u. QUINN 1999, RIOLLET et al. 2000).
2.3.5 Zelldifferentialbild des Blutes
2.3.5.1 Phagozyten
Von den PMN im Blut exprimieren ca. 93 % CD18 und nur ca. 3 % CD14. Durch LPS-Injektion in die Milchdrüse geht die Expression beider Strukturen um jeweils ca.
3 % zurück (PAAPE et al. 1996).
Im Blut schwankt der Anteil der Monozyten an den mononukleären Zellen im Laktationsverlauf zwischen 15 % und 31 %, wobei der niedrigste Wert in der frühen Trockenstehphase erreicht wird. Auf ca. 62 % der großen MNC konnte CD14 nachgewiesen werden. Der Anteil der CD18+ großen MNC stiegt durch LPS-Injektion in die Milchdrüse von 95 % auf 99 % an (PARK et al. 1992, PAAPE et al. 1996).
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2.3.5.2 Lymphozyten
Im Blut laktierender Kühe besteht die Lymphozytenpopulation aus 23 % B-Zellen und 45 % T-Zellen (CONCHA et al. 1978). Zur Geburt findet innerhalb der Lymphozytenpopulation ein signifikanter Anstieg der IgM tragenden B-Lymphozyten und der MHC II+ Zellpopulationen statt (VAN KAMPEN u. MALLARD 1997), im anschließenden Laktationsverlauf ändern sich die Anteile von B- und T-Lymphozyten sowie NK Zellen dagegen kaum (PARK et al. 1992).
Im Blut laktierender Kühe sind 20 % der T-Lymphozyten CD8+. Für die Lymphozytensubpopulation der T-Helferzellen (CD4+) gibt es unterschiedliche Angaben: ca. 35 % (VAN KAMPEN et al. 1999) und ca. 67 % (ASAI et al. 2000).
Peripartal nehmen die Anteile der CD4+ und CD8+ an den Lymphozyten sowie die mittlere Expressionsdichte dieser Oberflächenstrukturen ab und steigen in der Frühlaktation nur langsam wieder an. Das Verhältnis von CD4/CD8 Lymphozyten, das immer > 1 beträgt, zeigt ebenfalls eine Abhängigkeit von Laktationsstadium. Es nimmt vom Laktationsbeginn zum Laktationsende hin ab (PARK et al. 1992, ASAI et al. 2000). Nur die Größenschwankungen der CD8+ Lymphozytenpopulation scheinen von Infektionen der Milchdrüse beeinflußt zu sein (VAN KAMPEN u. MALLARD 1997, VAN KAMPEN et al. 1999, RIVAS et al. 2000), wobei nicht in jeder Studie zu diesem Themenkomplex eine Reaktion der Blutleukozyten auf eine Infektion der Milchdrüse beobachtet werden konnte (RIOLLET et al. 2001).
Der Anteil der γδ-T-Zellen an der Lymphozytenpopulation im Blut beträgt ca. 3 %, derjenige der CD8+ γδ-T-Zellen ca. 2 %. Die in ihrer Größe laktationsabhänige Subpopulation der WC1+ γδ-T-Zellen zeigt ein den αβ-T-Zellen (CD4+ und CD8+) genau entgegengesetztes Verhalten: ihr Anteil an den Blutlymphozyten ist zur Geburt am niedrigsten und steigt während der Laktation an (VAN KAMPEN u. MALLARD 1997, VAN KAMPEN et al. 1999, ASAI et al. 2000).
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2.4 Zelluläre Abwehr der bovinen Milchdrüse 2.4.1 Phagozytose
Als Phagozytose wird das Erkennen und Aufnehmen fremder Partikel durch Zellen bezeichnet. Phagozytose und anschließendes Abtöten der Bakterien stellen einen wichtigen Schutzmechanismus des Euters gegen eindringende Mikroorganismen dar. Ihre Ausprägung zeigt neben tierindividuellen Einflüssen eine Abhängigkeit von Laktationsstadium und –nummer (VECHT 1985, GUIDRY et al. 1985).
Die Phagozytose wird durch die sogenannte Opsonisierung der Bakterien mit Antikörpern, v.a. IgG und IgM, oder Komplementfaktoren, v.a. C3b, verbessert. Die Phagozyten wiederum tragen auf ihrer Zelloberfläche Komplement- sowie Fc- Rezeptoren für die Antikörper. Es wird jedoch vermutet, daß diese Rezeptoren durch Milchbestandteile blockiert und dadurch inaktiviert werden. Komplement kommt in der Milch nur in sehr niedrigen Konzentrationen vor. Die Menge von IgG1, IgG2, IgM und IgA, die in normaler Milch gering ist, steigt im Rahmen einer Mastitis an. Die Fähigkeit der Phagozyten in der Milch zu Phagozytose und intrazellulärem Abtöten von Bakterien ist auch durch die Aufnahme von Fett, Eiweiß und anderen Milchbestandteilen sowie die in der Milch geringen Konzentrationen von Sauerstoff und Glucose im Vergleich zum Blut reduziert (JAIN 1976, PAAPE u. WERGIN 1977, PAAPE et al. 1981, TARGOWSKI 1983, HOLMBERG u. CONCHA 1985, VECHT 1985, CONCHA 1986, BURVENICH et al. 1994, SORDILLO et al. 1997).
2.4.2 Makrophagen
Die Phagozyten in der Milch sind Makrophagen und PMN. Die Makrophagen, die in normaler Milch die größte Zellfraktion bilden, begegnen als erste Phagozyten den ins Euter eingedrungenen Bakterien (THOMAS et al. 1994). Sie bauen phagozytierte Mikroorganismen ab und präsentieren sie auf ihrer Zelloberfläche in MHC II- Molekülen. Aktivierte Makrophagen setzten zusätzlich verschiedenen Mediatoren frei, durch die PMN angelockt und stimuliert werden. Durch Antigenpräsentation
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stimulieren sie auch Lymphozyten, die ebenfalls PMN-anlockende Lymphokine freisetzen (TARGOWSKI 1983, HOLMBERG u. CONCHA 1985, VECHT 1985, BURVENICH et al. 1994, SORDILLO et al. 1997).
2.4.3 PMN
2.4.3.1 Lebenszyklus
PMN werden als der wichtigste Schutz vor Mastitiden eingestuft. Neben den im Blut zirkulierenden PMN gibt es noch Reserven, die marginal der Wand der Blutgefäße angelagert sind, sowie einen weiteren Pool im Knochenmark. Aus diesen Reserven wandern sie, angelockt durch Signale, die u.a. von Makrophagen ausgesandt werden, als Barriere gegen das Eindringen von Mikroorganismen in Körperhöhlen und Gewebe (JAIN 1976). Die Lebensspanne der PMN, nachdem sie nach einer Reifungszeit von zehn bis zwölf Tagen das Knochenmark verlassen haben, beträgt nur wenige Tage. Nach Ablauf dieser Frist werden sie apoptotisch und von Makrophagen phagozytiert, so daß keine toxischen Substanzen ins Gewebe gelangen können. Die PMN in der Milch werden gemeinsam mit den anderen Zellen regelmäßig beim Melken aus dem Euter gespült und in der Blutbahn neu rekrutiert.
Die kontinuierliche Migration der PMN in die Milchdrüse stellt nach Ansicht vieler Autoren die erste immunologische Barriere gegen eindringende Bakterien dar (BURVENICH et al. 1994, 1995, PAAPE et al. 2000).
2.4.3.2 Migration
Verschiedene Mediatoren führen zu einer direkten und gerichteten Migration der PMN zum Entzündungsort. Dies geschieht, indem die PMN dem Konzentrationsgradienten der Chemoattraktinen wie z.B. C5a, Interleukin (IL) 8 oder LPS zur höchsten Konzentration folgen, was Chemotaxis genannt wird (TARGOWSKI 1983, BURVENICH et al. 1995, PAAPE et al. 2000). Andere
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Mediatoren wie CD11/CD18 lagern sich an die Zellmembran an und führen zu einer Adhäsion der PMN an die Gefäßwand, bevor sie das Gefäß verlassen und durch die Tight Junctions ins Gewebe gelangen.
2.4.3.3 Entzündung
Im Fall einer Mastitis gelangen innerhalb von acht bis zehn Stunden mehrere Millionen Zellen in die Milch, ein erster signifikanter Anstieg des Zellgehaltes ist sogar schon nach vier Stunden meßbar (JAIN 1976, PAAPE et al. 1976, BURVENICH et al. 1994, PRIN-MATHIEU et al. 2002). Das Ausmaß der PMN- Infiltration hängt u.a. von der Erregerspezies ab (CONCHA 1986, LEITNER et al.
1995). Der Erfolg dieser PMN-Rekrutierung steht in direktem Zusammenhang mit der erfolgreichen Bekämpfung einer Euterinfektion. Die kann dadurch erklärt werden, daß, wie unter 2.4.1 beschrieben, die Phagozytosefähigkeit der PMN in der Milch stark eingeschränkt ist und für eine erfolgreiche Abwehr sehr viel PMN notwendig sind. Dennoch konnten Eigenschaften von vor einer Infektion aus Blut isolierten PMN mit der Schwere der anschließenden experimentellen Mastitis in Verbindung gebracht werden (BURVENICH et al. 1994).
In der Milch phagozytieren die PMN die eingedrungenen Erreger und töten sie intrazellulär ab. Dies kann sauerstoffabhängig durch die Bildung radikaler Sauerstoffspezies geschehen oder sauerstoffunabhängig durch Säuren, Lactoferrin, Lysozym oder kationische Proteine. Beide recht unspezifischen Mechanismen stellen auch eine Gefahr für das umgebende körpereigene Gewebe dar, indem sie zu dessen Fibrosierung und damit zum Verlust der Funktionalität führen (TARGOWSKI 1983, THOMAS et al. 1994, BURVENICH et al. 1995, SHUSTER et al. 1996, SORDILLO et al. 1997, PAAPE et al. 2000).
