Folgerungen zu Versuch 1

Insgesamt betrachtet waren die eingesetzten mikroskopischen und durchflußzytometrischen Techniken geeignet, Aussagen über das Zelldifferentialbild unter Berücksichtigung der Eutergesundheit zu treffen. Um die Vergleichbarkeit mit den Literaturangaben zu verbessern, sollte die Methodik zur Herstellung der mikroskopischen Ausstriche überprüft und gegebenenfalls modifiziert werden. Auch der Bereich der Probenahme und der dabei verwendeten Gefäße sollte beachtet werden. Im Bereich der Durchflußzytometrie könnte durch den Einsatz eines geeigneten Antikörpers gegen TCR1 und ein insgesamt breiteres Antikörperspektrum, das auch die Phagozyten mit umfaßt, die Aussagefähigkeit optimiert werden.

Trotz der technischen Mängel ließ sich ein erster gemeinsamer Trend erkennen: Die vier Viertel eines Euters zeigten eine funktionelle Abhängigkeit voneinander. Eine ausführliche Diskussion dieses Aspektes erfolgt unter 5.3.6.

Diskussion

5.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen

5.2.1 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Untersuchers auf das mikroskopische Zelldifferentialbild

5.2.1.1 Einfluß des Probenahmegefäßes

Die Makrophagen als vorrangig unspezifische Phagozyten zeigen eine starke Adhäsion, sogar an Stoffe mit glatten Oberflächen wie Glas. Diese Eigenschaft wird zur Charakterisierung und Isolierung von Makrophagen genutzt (LEE et al. 1980, MIELKE 1980, DESIDERIO u. CAMPBELL 1980, ELLIS et al. 1988). Kunststoff mit seiner im Vergleich zu Glas rauheren Oberfläche gibt den Makrophagen noch mehr Anlagerungsmöglichkeiten. So wurde bei einer vergleichenden Untersuchung über die Anhaftung von Peritonäalzellen der Ratte an Glas und Plastik nachgewiesen, daß diese Zellen tendenziell stärker an Plastik adhärieren. Zusätzlich zeigte sich, daß an Glas anhaftende Makrophagen eine größere Kapazität hatten, verschiedene Partikel zu binden, als Makrophagen auf einer Plastikoberfläche (GARROUSTE et al. 1982).

Vor diesem Hintergrund wurde untersucht, ob das Material des Probenahmegefäßes sich auf das Zelldifferentialbild auswirkt.

Der Einfluß des Materials des Probenahmegefäßes beschränkte sich auf die Phagozyten, insbesondere die Makrophagen. In den in Kunststoffgefäßen transportierten Milchproben wurden signifikant (p < 0,05) weniger Makrophagen, in einem Fall auch PMN, gefunden als in den Proben aus Glasflaschen. Dieses Ergebnis, ebenso wie die zuvor dargelegte Neigung der Makrophagen zur Adhäsion, läßt sich durch die Funktion dieser Zellarten, der Phagozytose, erklären. Um überhaupt etwas aufnehmen zu können, müssen sich diese Zellen an das Partikel anlagern. Dieser Prozeß wird zwar durch die Opsonisierung unterstützt, ist aber nicht von ihr abhängig, wie die Phagozytose von Fett und Eiweiß in Milch zeigt (siehe 2.4.1 und 2.4.2).

Diskussion

5.2.1.2 Einfluß des Untersuchers

Auch der Einfluß des Untersuchers auf das Zelldifferentialbild stellte sich als signifikant (p < 0,05) heraus. Der starke Unterschied zwischen den Ergebnissen bestätigte die praktische Erfahrung vieler Laboratorien, daß nur Zelldifferentialbilder, die von demselben Untersucher ermittelt wurden, miteinander verglichen werden können. Daher sollten mikroskopische Untersuchungen nur von einer Person durchgeführt werden. Untersuchungsergebnisse aus verschiedenen Instituten können nicht miteinander verglichen werden (DILBAT 1963, DULIN et al. 1982).

Schon die alleinige mikroskopische Zellzählung wird stark subjektiv beeinflußt, und es kommen Variationskoeffizienten bis 19 % vor (TOLLE et al. 1971, KITCHEN 1981).

5.2.2 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Antikörpers auf das durchflußzytometrische Zelldifferentialbild

5.2.2.1 Einfluß des Probenahmegefäßes

Aufgrund des signifikanten Einflusses des Gefäßmaterials auf die mikroskopische Zelldifferenzierung wurde beispielhaft anhand von vier gegen Lymphozyten gerichteten Antikörpern untersucht, ob auch die durchflußzytometrische Zelldifferenzierung durch den Faktor Material beeinflußt wird. Es wurden Antikörper (CD4-S und WC1) ausgewählt, die in Versuch 1 ein unerwartetes Verhalten gezeigt hatten, sowie jeweils ein Alternativantikörper (CD4-I und GB21A). Die Lymphozyten waren den durch Adhäsion aktivierten Makrophagen und den von ihnen ausgeschütteten Mediatoren nur kurze Zeit ausgesetzt. Daher waren im durchflußzytometrischen Zellbild keine Veränderungen zu erwarten, was durch diesen Versuch bestätigt wurde.

Diskussion

5.2.2.2 Einfluß des Antikörpers

In Anbetracht der unerwarteten Ergebnisse der durchflußzytometrischen Lymphozytendifferenzierung in Versuch 1 wurde das Bindungsverhalten zweier Antikörper mit dem von Alternativantikörpern verglichen. Für die Oberflächenstruktur CD4 wurde ein von einem anderen Zellklon produzierter Antikörper mit gleicher Spezifität eingesetzt, während für die Zielzellart γδ-T-Zellen die Alternative zum mAk gegen WC1 in einem direkt gegen den TCR1 gerichteten Antikörper bestand. Es stellte sich heraus, daß CD4-S und GB21A signifikant (p < 0,05) höhere Bindungsraten an aus Milch isolierte Lymphozyten zeigten als der jeweilige Vergleichsantikörper.

Der Antikörper CD4-I lag mit einer durchschnittlichen Bindungsrate von 5 % weit unter den in der Literatur genannten Werten und erschien daher ungeeignet für die Analyse von Milchlymphozyten. Wenn auch in Veröffentlichungen keine Angaben über das Bindungsverhalten verschiedener Antikörper gegen CD4 an aus Milch isolierten Zellen gefunden wurden, so gibt es doch Hinweise auf mögliche Ursachen für Unterschiede. Anhand von aus Blut isolierten Lymphozyten wurde ein Polymorphismus von CD4 beschrieben (MORRISON et al. 1991). Des weiteren wurden bei der Analyse von 12 verschiedenen Antikörpern gegen CD4 Unterschiede im Bindungsverhalten festgestellt (BENSAID u. HADAM 1991). In diese Untersuchung wurden neben Lymphozyten aus Blut lediglich noch diejenigen aus den peripheren lymphatischen Organen mit einbezogen, Lymphozyten aus dem Euter dagegen nicht. Die Berücksichtigung anderer Organe bei der Analyse des Bindungsverhaltens von Antikörpern zeigte jedoch, daß durch die selektive Verteilung der Lymphozyten im Körper ausgehend von den Eigenschaften der Blutlymphozyten Rückschlüsse auf andere Organe nicht ohne weiteres möglich sind.

Der Einsatz eines Antikörpers gegen WC1 zur Untersuchung von γδ-T-Zellen in Milch wurde bereits unter 5.1.3.3 diskutiert. Mit dem gegen den TCR1 gerichteten Antikörper GB21A konnte ein γδ-T-Lymphozytenanteil von 14 % nachgewiesen

Diskussion

werden, der sich damit im unteren Bereich der Literaturangaben bewegt (siehe 2.3.3.2).

5.2.3 Vergleich von Kieler Sedimentausstrich und Ausstrich der Zellsuspension mit der „Kaffeemühle“

Durch Einsatz der „Kaffeemühle“ in Versuch 1 wurde versucht, die Zellen der ZSM auf der relativ kleinen Fläche eines Deckgläschens zu konzentrieren. Mit dieser Technik gelang es, relativ gut auszuwertende Ausstriche herzustellen, jedoch standen die Ergebnisse im Widerspruch zu den Literaturangaben (siehe 5.1.2).

Daher wurde dieses Verfahren mit einem gebräuchlichen – dem Kieler Sedimentausstrich (KSA) – verglichen. Neben der eigentlichen Ausstreichtechnik unterschieden sie sich vor allem in der Anzahl der vorangegangenen Zentrifugationen.

Unabhängig vom SCC der Milch wurden signifikant (p < 0,05) unterschiedliche Differenzierungsergebnisse für PMN und Lymphozyten gefunden, bei einem SCC >

400.000 Zellen/ml auch für Makrophagen. Diese Unterschiede beruhten auf einer Anreicherung der PMN bzw. einem Verlust der Lymphozyten in der ZSM. Mit beiden Methoden konnten – parallelverschoben – Veränderungen des Zelldifferentialbildes unter Berücksichtigung der Eutergesundheit beobachtet werden.

Ob nur der Direktausstrich von Milch ein unverfälschtes Bild der Milchzellen ermöglicht (DILBAT 1967) oder der Sedimentausstrich vorzuziehen ist, war umstritten (JÜRGENS 1939). Heute ist allgemein anerkannt, daß der Direktausstrich von Milch keine geeignetes Routineverfahren ist, da gerade bei Milch mit niedrigem Zellgehalt mehr Gesichtsfelder ausgezählt werden müssen und dennoch oft nicht genügend Zellen für eine genaue Aussage gefunden werden (TOLLE et al. 1971, KITCHEN 1981, DULIN et al. 1982). Daher wird das Sediment nach 10-minütiger Zentrifugation von 10 ml Milch untersucht. Unterschiede gibt es lediglich in der Methode, die Zellen auf einem Objektträger zu verteilen. Dies kann nach Art des

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Blutausstriches geschehen, in dem 1 Tropfen Sediment auf den Rand eines Objektträgers aufgetragen und mit einem zweiten Objektträger verteilt wird. Eine weitere Möglichkeit ist der Kieler Sedimentausstrich, bei dem das Sediment mit einer Öse verteilt wird (siehe 2.2.2.1). Die Cytospin-Zentrifuge konzentriert mit Hilfe der Zentrifugalkraft die Zellen auf einer sehr begrenzten Fläche. Beim Vergleich der Cytospinausstriche mit Direktausstrichen der Milch konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden (DULIN et al. 1982).

Im Rahmen einer Dissertation wurde unter Berücksichtigung des Laktationsstadiums das Zelldifferentialbild in verschiedenen durch Zentrifugation gewonnenen Fraktionen untersucht (DILBAT 1967). Während im Sediment, im Rahm und in der Milch etwa das gleiche Zelldifferentialbild beobachtete wurde, reicherten sich in der Magermilch die großen mononukleären Zellen an (siehe Tab. 40). Angesichts einer weiteren Untersuchung zu diesem Thema, bei der im Rahm nur Makrophagen nachgewiesen wurden (LEE et al. 1980), liegt die Vermutung nahe, daß das Zelldifferentialbild durch die Zentrifugation der Milch verändert wird.

Tab. 40: Prozentuale Verteilung der Zellen in

verschiedenen durch Zentrifugation gewonnenen Milchfraktionen nach DILBAT 1967

Fraktion % Epithelzellen % PMN % Lymphozyten Sediment 33 – 43 26 – 38 23 – 41 Magermilch 57 – 72 7 – 22 11 – 36 Rahm 39 – 56 17 – 44 17 – 27 Milch 38 – 49 16 – 38 23 – 34

Auch wenn keine weiteren Veröffentlichungen konkret zu diesem Thema gefunden wurden, so sind doch mit unterschiedlichen Methoden ermittelte Zelldifferentialbilder in der Literatur zu finden (siehe Tab. 2). Im Vergleich mit durchflußzytometrisch ermittelten Zelldifferentialbildern (WEVER U. EMANUELSON 1989, ÖSTENSSON et

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al. 1993) findet bei dem auf Zentrifugation basierenden Verfahren Cytospin eine Anreicherung der Lymphozyten statt (MILLER et al. 1991), d.h. die Literaturangaben ergeben ein den eigenen Ergebnissen widersprechendes Bild. Es läßt sich somit keine Aussage treffen, ob die in der Literatur sowie in dieser Arbeit gefundenen Unterschiede durch die Anzahl der Zentrifugationen oder andere Komponenten des Ausstrichverfahrens bedingt sind. Es bleibt jedoch festzuhalten, daß die mit der

„Kaffeemühle“ in Kombination mit in Glasflaschen transportierten Milchproben erzielten Ergebnisse den Literaturangaben entsprechen und die „Kaffeemühle“ daher für weitere Untersuchungen die Methode der Wahl ist.

5.2.4 Untersuchungen zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung

Mit diesem Versuchsaufbau sollte näherungsweise eine Aussage über die technische Wiederholbarkeit der Methoden zur Zelldifferenzierung ermöglicht werden. Die Probengewinnung und Verarbeitung der Milchvolumina, die für die Zellgewinnung für Mehrfachansätze nötig gewesen wären, waren arbeitstechnisch nicht durchführbar.

Da in Milch und Blut nur bei sehr wenigen Parametern Abweichungen gefunden wurden, kann grundsätzlich von einer akzeptablen Wiederholbarkeit der Methoden ausgegangen werden. Die Aussagefähigkeit dieser Analyse wurde jedoch durch die Verteilung über mehrere Untersuchungstage eingeschränkt, da die untersuchten Tiere einer sich laufend verändernden Umwelt ausgesetzt waren. Die Umweltveränderungen spiegeln sich wiederum im Immunsystem wider. Daher sind Veränderungen der untersuchten Parameter, die ja die Abwehrlage des Immunsystems widerspiegeln, nicht zwangsläufig der Methode anzulasten. Vor allem die signifikanten (p < 0,05) Veränderungen der Blutparameter sind auf diese Zusammenhänge zurückzuführen.

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5.2.5 Folgerungen aus Versuch 2

Milchproben für die mikroskopische Zelldifferenzierung sollten in Glasgefäßen genommen werden, da Kunststoff zu einer Verringerung des Anteils der Phagozyten, insbesondere der Makrophagen führt. Des weiteren können nur die durch denselben Untersucher mit der identischen Methode ermittelten Zelldifferentialbilder miteinander verglichen werden.

Bei der Auswahl der spezifischen monoklonalen Antikörper muß jeweils überprüft werden, ob er für die Markierung von Milchzellen geeignet ist.

5.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer selektierten Tierauswahl

Bei diesem Versuch wurde – soweit es das Tiermaterial zuließ – darauf geachtet, durch gezielte Auswahl nachweislich tragender Tiere vor allem in der Gruppe A insbesondere hormonbedingte, aber auch laktationsbedingte Variationen der untersuchten Parameter zu umgehen. Die Tiere der Referenzgruppe A waren außerdem bis zur Probenahme nicht euterkrank. Des weiteren wurden zwei Klassen der Eutererkrankung definiert (siehe 3.5.4.2.3 Tab. 10) und der Einfluß der erkrankten Milchdrüsen auf benachbarte Euterviertel analysiert.

.

5.3.1 Selektierte Kriterien der Eutergesundheit

Die durchschnittliche Zellzahl (SCC) im VAG der Gruppe A bewegte sich mit ca.

22.000 Zellen/ml deutlich am unteren Rand des physiologischen Bereiches von 20.000 – 50.000 Zellen/ml (siehe 5.1.1). Die logarithmierte NAGase-Aktivität (NAGase) in VAG (0,24) und VGH (0,20) lag sogar unterhalb der von GRABOWSKI (2000) ermittelten physiologischen Referenz von 0,31 +/- 0,19. Auch die elektrische

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Leitfähigkeit (LF) befand sich mit 5,66 mS/cm im physiologischen Bereich von

< 6 mS/cm (HAMANN u. ZECCONI 1998, GRABOWSKI 2000).

Es erschien daher gerechtfertigt, die Werte der Gruppe A, in der die Kühe seit der Abkalbung auf allen Vierteln als eutergesund eingestuft wurden, als Referenz für die übrigen Gruppen einzusetzen.

Analog zu Versuch 1 konnte auch hier eine Erhöhung von SCC VAG und NAGase VAG und zusätzlich auch der LF der gesunden Viertel euterkranker Kühe (B1 und C1) festgestellt werden, die jedoch nur bei SCC VAG und hochgradiger Eutererkrankung (C1) signifikant war (p < 0,05). Wie unter 5.1.1 berichtet, wurden auch schon in anderen Arbeiten ähnliche Resultate beobachtet. Der Grad der Erkrankung der Nachbarviertel scheint beim Ausmaß der Erhöhung eine Rolle zu spielen. Im VGH übt dagegen – anders als in Versuch 1 – der Gesundheitszustand der benachbarten Euterviertel keinen Einfluß auf die hier betrachteten Parameter aus.

Die Erhöhung der Werte in durch Entzündung veränderter Milch für alle selektierten Kriterien der Eutergesundheit untermauerte die Ergebnisse aus Versuch 1. Die anhand des Leitparameters der Euterentzündung SCC VAG getroffene Unterteilung in unterschiedliche Schweregrade der Mastitis wird durch SCC VGH sowie NAGase in VAG und VGH unterstützt, indem sich die Gruppen B2 und C2, für die der gleiche Grenzwert von SCC VAG < 400.000 Zellen/ml galt, in diesen Parametern nicht unterschieden und in Gruppe C3 (SCC VAG > 400.000 Zellen/ml) die höchsten Werte zu finden waren. Dementsprechend konnte die von GRABOWSKI (2000) beschriebene signifikante Korrelation von SCC VGH, NAGase VAG und VGH sowie LF mit SCC VAG erneut bestätigt werden.

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5.3.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild in Milch

Nach den Erkenntnissen aus Versuch 2 (siehe 5.2) wurden nun – zusätzlich zu einer gezielten Auswahl der Versuchstiere – die Milchproben in Glasflaschen genommen und transportiert. Die Herstellung der Ausstriche selbst blieb unverändert.

Im Versuch 3 fügte sich das Zelldifferentialbild der Gruppe A (34 % PMN, 25 % Lymphozyten und 39 % Makrophagen) in neuere Literaturangaben ein (WEVER u.

EMANUELSON 1989, MILLER et al. 1991). Diese Werte wurden analog zur bisherigen Vorgehensweise als Referenz betrachtet.

Wie in der Literatur beschrieben (siehe 2.2.5) und durch Versuch 1 bestätigt, stellten die PMN in der Milch erkrankter Euterviertel (B2, C2, C3) die größte Zellfraktion, wobei ihr Anteil in C3 mit 80 % am höchsten war. Dieser Anteil war um 23 % größer als der korrespondierende Wert in Versuch 1, obwohl dort die mittlere Zellzahl und die NAGase-Aktivität auf ein stärkeres Entzündungsgeschehen schließen ließen.

Über die Gründe lassen sich nur Vermutungen anstellen, da aufgrund zu kleiner Stichprobengrößen keine erregerabhängige Auswertung durchgeführt werden konnte. Die Bestimmung des Infektionsbeginns ist bei der Untersuchung von natürlichen Infektionen ebenfalls problematisch und schränkt daher auch deren Aussagefähigkeit ein (RIVAS et al. 2000). Es ist aber möglich, daß in Versuch 3 der Anteil akuter Mastitiden größer als in Versuch 1 war. Wie unter 2.2.5 dargelegt, nimmt bei chronischen Mastitiden der Anteil der mononukleären Zellen zu. Nach RIOLLET et al. (2001) ist das Zelldifferentialbild bei chronischen Euterentzündungen auch vom Erreger abhängig. Bei durch S. aureus verursachten Mastitiden liegt der PMN-Anteil zwischen 55 – 96 %, während bei E. coli als Erreger schon nach 13 Tagen die mononukleären Zellen überwiegen (HILL et al. 1984). Zusätzlich zu einer signifikanten Vergrößerung des Anteils der PMN im Rahmen einer Euterinfektion wurde, unabhängig von der Eutergesundheit, ein deutlicher Herdeneinfluß auf das Zelldifferentialbild der Milch beschrieben (PICCININI et al. 1999).

Ebenso wie für die selektierten Kriterien der Eutergesundheit spiegelte sich die anhand des SCC VAG vorgenommene Abstufung des Erkrankungsgrades im

Diskussion

Zelldifferentialbild wider, es war aber keine klare Abgrenzung zum nach dem SCC VAG als gesund definierten Bereich möglich.

Die Veränderung des Zelldifferentialbildes in den als gesund eingeordneten Milchdrüsen euterkranker Kühe, wie sie in Versuch 1 beobachtet wurde, konnte erneut bestätigt und statistisch untermauert werden (siehe Abb. 4. u. 8). Wie schon für die selektierten Kriterien der Eutergesundheit konnte auch hier eine Abstufung der Veränderungen in Abhängigkeit vom Erkrankungsgrad festgestellt werden. Der PMN-Anteil in der nach klassischen Kriterien als eutergesund eingestuften Gruppe C1 war genauso groß wie der in den als mittelgradig entzündet eingestuften Gruppen B2 und C2. Damit wurden die Ergebnisse von WEVER u. EMANUELSON (1989) widerlegt, die keine gegenseitige Beeinflussung benachbarter Euterviertel dokumentierten. Die mikroskopische Zelldifferenzierung erwies sich somit im Vergleich mit der Zellzählung als die sensiblere diagnostische Maßnahme.

5.3.3 Mikroskopisches Zelldifferentialbild des Blutes

Die anhand des SCC VAG diagnostizierten Mastitiden und ihr Schweregrad spiegelten sich zwar im Zelldifferentialbild des Blutes wider, die Veränderungen ließen sich jedoch nur für Eosinophile Granulozyten und Monozyten zwischen den Gruppen A und C statistisch absichern (p < 0,05). Die aufgetretenen Änderungen entsprachen denen der Milchleukozyten. Eine sich hier andeutende Neutrophilie im Blut kombiniert mit einer Lymphopenie kann als Indiz für eine bakterielle Infektion gewertet werden (KRAFT u. SCHILLINGER 1997). Es wurde bereits beobachtet, daß die Gesamtleukozytenzahl auf Änderungen der Eutergesundheit reagiert, und dabei nicht unbeträchtliche tierindividuelle Schwankungen auftreten (REDETZKY 2000).

Eine eingehendere Analyse, die härtere Aussagen ermöglicht, konnte aufgrund der zu geringen Stichprobengröße nicht vorgenommen werden.

Diskussion

5.3.4 Durchflußzytometrische Parameter der Milchzellsuspension

5.3.4.1 Zellvitalität

Der Anteil vitaler Zellen war in Versuch 3 – unabhängig von der Eutergesundheit – höher als in Versuch 1, was auf die veränderte Bestimmungsmethode zurückzuführen ist. Dabei wurde nicht nur ein anderer Farbstoff eingesetzt, sondern die Zellen wurden vor der Messung auch deutlich geringeren Belastungen unterworfen. Die Höhe der Zellvitalität schien die von VANGROENWEGHE et al.

(2000) gefundenen Werte zu bestätigen (siehe 5.1.3.1). Auch wenn im eigenen Versuch das Laktationsstadium kein Auswahlkriterium war, befanden sich die Versuchstiere doch aufgrund des Kriteriums „nachgewiesene Trächtigkeit“ in einem fortgeschrittenen Laktationsstadium.

Die in Versuch 1 beobachtete Erhöhung der Zellvitalität in den gesunden Vierteln euterkranker Kühe konnte nur für eine mittelgradige Eutererkrankung (B1) bestätigt werden. Analog zur bisherigen Beobachtung zeigten die Gruppen B2 und C2 die höchsten Werte, während die Zellvitalitäten in C1 und C3 derjenigen in einer gesunden Milchdrüse entsprachen. Dies könnte ein Indiz dafür sein, daß in hochgradig erkrankten Milchdrüsen (C3) die PMN nach Phagozytose und Zerstörung der Erreger zugrundegegangen und zu Eiter geworden sind (LIEBICH 1993).

5.3.4.2 CD4 und CD8

Die als Referenz (Gruppe A) betrachteten prozentualen Anteile von CD4⁺ (20 %) und CD8⁺ (45 %) unterschieden sich deutlich von den Ergebnissen aus Versuch 1, stimmten aber mit der Mehrheit der Literaturangaben überein (siehe 2.3.3.2 und Tab. 3). Wie bereits unter 5.1.3.2 erwähnt, waren die Werte der mittleren Fluoreszenzintensität (Xm) nicht mit Angaben in der Literatur vergleichbar, da sie vom Durchflußzytometer und dessen Einstellungen abhängen.

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Alle Gruppen zeigten einen im Vergleich zur Referenz signifikant (p < 0,05) erhöhten Anteil CD4⁺ Lymphozyten, auch die eutergesunden Viertel an Mastitis erkrankter Kühe. Damit stimmten die eigenen Ergebnisse mit den Literaturangaben überein (siehe 2.3.3.2). Der Abfall der CD4-Expressionsdichte auf der Zelloberfläche bestätigte die von RIOLLET et al. (2001) gemachten Beobachtungen und widerlegt damit die Ergebnisse von RIVAS et al. (2000).

Der Anteil der CD8⁺ T-Zellen hatte dagegen eine rückläufige Tendenz, die aber nur für C3 statistisch gesichert werden konnte. Diese Beobachtung steht im Einklang mit SOLTYS u. QUINN (1999) und RIVAS et al. (2000). Die Expressionsdichte dieser Struktur war in der Referenzgruppe signifikant niedriger als in allen anderen Gruppen, was den Ergebnissen von RIOLLET et al. (2001) entspricht, während RIVAS et al. (2000) einen – wenn auch nicht signifikanten – Aufwärtstrend beschrieben.

5.3.4.3 TCR1

Mit dem gegen den γδ-T-Zellrezeptor (TCR1) direkt gerichteten Antikörper GB21A, der in Gruppe A 10 % der Lymphozyten markiert hat, konnte der in der Literatur als physiologisch angesehene Anteil der γδ-T-Lymphozyten (8 %) bestätigt werden.

Auch der in Versuch 1 beobachtete Abwärtstrend bei zunehmender Schwere der Mastitis wurde bestätigt. Bei hochgradiger Mastitis konnte zusätzlich eine signifikante Verringerung der Expressionsdichte beobachtet werden. Untersuchungen mit dem ebenfalls direkt gegen den TCR1 gerichteten mAk (GD3.8) ergaben dagegen bei einer Mastitis eine signifikante Vergrößerung der γδ-T-Zellpopulation (SOLTYS u.

QUINN 1999). Wie schon mehrfach erwähnt, können mit Antikörpern unterschiedlicher Herkunft erzielte Ergebnisse nur bedingt miteinander verglichen werden. Da keine Veröffentlichungen gefunden werden konnten, in denen die Lymphozytensubpopulationen der Milch unter Berücksichtigung der Eutergesundheit mit dem mAk GB21A untersucht wurden, ist eine über die Ausführungen unter 5.1.3.3 hinausgehende Einordnung der eigenen Befunde nicht möglich. Bezüglich

Diskussion

der Expressionsdichte des TCR1 wurden ebenfalls keine veröffentlichten Daten gefunden.

Bei den CD8⁺ γδ-T-Zellen konnte unter Berücksichtigung der Eutergesundheit keine Veränderung beobachtet werden. Für diese Lymphozytensubpopulation kann weder die Referenz noch das Verhalten unter Berücksichtigung der Eutergesundheit eingeordnet werden. Die bisher bekannten Daten sind nicht mit den eigenen Ergebnissen vergleichbar. Sie beziehen sich auf CD2⁺ T-Zellen, während dieser mAk in den eigenen Untersuchungen nicht eingesetzt wurde. Auch wurde bisher nur Milch aus gesunden Milchdrüsen untersucht (ASAI et al. 2000).

5.3.4.4 Bo 116

Für den gegen PMN gerichteten Antikörper Bo116 liegt bisher noch keine abschließende Charakterisierung seines Antigens vor (RÖNSCH 1992). Die Expression dieses Antigens auf PMN ist an deren Funktionszustand gekoppelt

Für den gegen PMN gerichteten Antikörper Bo116 liegt bisher noch keine abschließende Charakterisierung seines Antigens vor (RÖNSCH 1992). Die Expression dieses Antigens auf PMN ist an deren Funktionszustand gekoppelt

Im Dokument Untersuchungen zum Zelldifferentialbild in Milch und Blut unter Berücksichtigung des Gesundheitsstatus der bovinen Milchdrüse (Seite 134-0)