Materialien für den in-vitro-Transmigrationstest

Frischsamenverdünner

Für die in-vivo- und in- vitro-Experimente wurde jeweils ein klinikeigener Magermilch-Eigelb-Verdünner eingesetzt. Die Herstellung erfolgte in der Tierärztlichen Klinik für Pferde, Dres. Genn und Steinmann, Mühlen. Zu unterschiedlichen Teilen (die exakten

Mengenverhältnisse sind vertraulich) sind in diesem Verdünner u.a. Magermilchpulver, Glucose, Eigelb, Ampuwa und ein Antibiotikum (s. 3.1.2) enthalten. Um die groben Bestandteile zu entfernen wird dieses Gemisch erst zentrifugiert (4000 x g, 20 min, Raumtemperatur) und anschließend mit Hilfe von Milchfilterschläuchen (s. 3.1.1) filtriert. Zu je 100 ml wird der Verdünner bei -20° C eingefroren und erst direkt vor der Verwendung aufgetaut. Um eine spätere Messung mit dem Durchflußzytometer zu ermöglichen, wurde der Verdünner nach dem Auftauen erneut mit Hilfe eines Filters (0,45 µm) filtriert.

Bereitstellung von Seminalplasma und membrangeschädigten Spermien

Von einem sich im Deckeinsatz befindlichen 3 jährigen Warmbluthengst einer Besamungsstation in Niedersachsen, wurde ein vollständiges Ejakulat mit Hilfe eines Phantoms und einer künstlichen Vagina, Modell Hannover, gewonnen. Der Hengst zeigte eine sehr gute Libido und benötigte einen Aufsprung bis zur Ejakulation. Für die Aufbereitung wurde das Ejakulat in einen vorgewärmten Messbecher (38°C) gegeben und mit Hilfe eines Milchfilterschlauches (s. 3.1.1) von Schmutzpartikeln und Schleimanteilen befreit. Das Ejakulat hatte ein Volumen von 72 ml und eine Dichte von 264 Mio. Samenzellen/ml. Die Anzahl der vorwärtsbeweglichen Spermien betrug 60 %, die der ortsbeweglichen und unbeweglichen jeweils 20 %. Dieses native Sperma wurde 10 min bei 2400 x g zentrifugiert.

Anschließend wurde der Überstand, das Seminalplasma, vorsichtig abpipettiert und erneut zentrifugiert (8 min, 800 x g), um alle Samenzellen zu eliminieren. Bei der mikroskopischen Kontrolle waren danach keine Spermien auffindbar. Bei -20° C wurde das Seminalplasma in aliquoten Teilen zu 5 ml gelagert und erst kurz vor der in-vitro-Verwendung aufgetaut. Vor dem Einsatz des Seminalplasmas in der Transmigrationskammer wurde es mit Hilfe eines Filters mit einer Porengröße von 0,45 µm filtriert (s. 3.1.1). Für in-vitro-Experimente, bei denen membrangeschädigte Spermien eingesetzt werden sollten, wurde das verbleibende Spermienpellet in RO+-Medium (s. 3.1.3) resuspendiert und in Aliquots zu 1 Mio Spermien/ml bei -20° C gelagert. Nach dem Auftauen wurden 100 % PJ-positive Spermien nachgewiesen.

Bereitstellung von vitalen Spermien

Vom selben Hengst wurde im gleichen Verfahren bei einem erneuten Sprung ein Ejakulatvolumen von 21 ml mit einer Dichte von 416 Mio. Samenzellen/ml mit normaler Farbe, Konsistenz und Geruch gewonnen. Mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskops (s. 3.1.1) mit vorgewärmtem Heiztisch wurde bei 40facher Vergrößerung die Motilität der Spermien geschätzt (60 % vorwärtsbewegliche, 20 % ortsbewegliche und 20 % unbewegliche Spermien). Es folgte eine Zentrifugation des Ejakulates (100 x g, 10°C, 5 min) zur schonenden und weitgehenden Abtrennung des Seminalplasmas. Dieses wurde abgehebert und das im Glas verbleibende Spermienpellet in einer 2%igen Glucose-Nährlösung resuspendiert. Für die weiteren Arbeitsgänge wurde die Spermiensuspension innerhalb von zwei Stunden bei 4°C in das Labor der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover verbracht. Hier erfolgte eine Verdünnung der Spermien auf 2 x 10⁶ Zellen/ml in 2%iger Glucose-Lösung. Vor Plazierung der Spermiensuspension in die unteren Vertiefungen der Transmigrationskammer wurde zur Bestimmung des Anteils lebender Spermien eine Färbung mit Acridinorange-Ethidiumbromid (s. 3.1.4) durchgeführt. Fünfzig Prozent der Samenzellen wiesen eine intakte Zellmembran auf (PJ-negativ). Für die Verwendung in der Transmigrationskammer wurde die Suspension auf 4 x 10⁵ Samenzellen/315 µl 2%ige Glucose-Lösung eingestellt. Zur Bereitstellung einer 100 % PJ-positiven Spermienpopulation sind 2 ml dieser Suspension in einem Eppendorfcup (s. 3.1.1) bei -20°C für 30 min eingefroren und anschließend wieder aufgetaut worden.

Zent rifugationsüberstände nach Spermienwaschung

Eingesetzt wurde ein in der Klinik Dres. Genn und Steinmann, Mühlen, aufgestallter 3 jähriger, gesunder Hengst. Er befand sich zur Zeit der Samenentnahme im Deckeinsatz. Die Untersuchung des Ejakulats ergab eine Dichte von 312 Mio. Spermien/ml, ein Volumen von 36 ml und eine Motilität von 70 % vorwärtsbeweglichen, 20 % ortsbeweglichen und 10 % unbeweglichen Spermien. Vor der ersten Spermien-Waschung erfolgte eine Zentrifugation (100 x g), die der Entfernung des Seminalplasmas diente, welches anschließend verworfen wurde. Es wurden dann 4 Waschungen mit PBS mit (140 x g) durchgeführt, wobei nach jeder Zentrifugation der Überstand nach Dekantierung abpipettiert und in ein steriles Gefäß überführt wurde. Die erste Waschung wurde mit 50 ml, alle folgenden mit 10 ml PBS (s.

3.1.3) durchgeführt. Alle anderen Überstände sind filtriert (0,2 µm Porengröße; s. 3.1.1) und bei -20°C eingefroren worden.

Nach jeder Zentrifugation wurden die Spermien nach Resuspendierung in PBS einer Acridinorange- Ethidiumbromid-Färbung (s. 3.1.4) unterzogen. Mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops und der Bürker-Zählkammer (s. 3.1.1) sind die prozentualen Anteile der lebenden und toten Spermien bestimmt worden. Nach der ersten Zentrifugation zur Entfernung des Seminalplasmas waren noch 20 % der Spermien vital, nach der ersten PBS- Waschung noch 3 %; nach der 2. Waschung und später waren keine vitalen Spermien mehr zu finden.

Transmigrationskammer

Zur Verfügung standen vier 10-Well- Transmigrationskammern (s. 3.1.1), die jeweils aus einer Acrylbodenplatte (50 x 101 x 11 mm), einer Acryldeckplatte (50 x 101 x 6 mm), einer Silikondichtungsmatte und 6 Schraubenmuttern bestehen. 10 Rundboden-Vertiefungen für ein Volumen von je 415 µl sind in die Bodenpla tte eingelassenen. Sie stimmen mit der Lokalisation der durchgehenden Bohrungen der Deckplatte überein. Die Kompartimente der Boden- und der jeweilig zugehörigen Deckplatte wurden beim Zusammenbau durch eine zwischengelegte Polycarbonatmembran (s 3.1.1) getrennt, die somit den Boden für die Vertiefungen der Deckplatte bildet. Ebenfalls zwischen die beiden Platten und auf die Polycarbonatmembran ist die Silikonmatte zur Abdichtung der nachher verschraubten

Transmigrationskammer plaziert worden. Sie ist entsprechend den Bohrungen der Acrylplatten mit Löchern ausgestattet. Sechs Gewindestangen sind in der Bodenplatte verankert, die beim Zusammenstecken durch entsprechende Einsparungen der Silikonmatte und der Deckplatte führen. Die beiden Acrylplatten werden mit Hilfe der Schraubenmuttern mäßig fest aneinander gepresst.

Polycarbonatmembran

Die Polycarbonatmembran weist eine glänzende, wenig adhärente (sie zeigt in Richtung Deckplatte) und eine matte, stärker adhärente Seite (sie weist in Richtung Bodenplatte) auf.

Sie ist etwa 10 µm dick und 25 x 80 mm groß. Die Poren besitzen eine Größe von 3 µm; es befinden sich 2 x 10⁶ Poren auf einem Quadratzentimeter der Membran.

Feuchtkammer

Um während der Inkubationsphase im Brutschrank das Verdunsten von Flüssigkeiten möglichst gering zu halten, wurde eine Feuchtkammer (s. 3.1.1) eingesetzt. Hierbei handelte es sich um eine Kunststoffbox mit Gittereinsatz, die mit etwa 20 ml einer 1%igen Kupfersulfatlösung (s. 3.1.3) befüllt wird.

Reinigung der Kammer

Eine einmolare Natriumhydroxyd-Lösung (s. 3.1.3) wurde zur Reinigung der beiden Acrylplatten der Transmigrationskammern verwandt. Hierfür wurden 22 g Natriumhydroxyd-Pellets (s. 3.1.3) in 550 ml Aqua tridest. gelöst. Zur Reinigung wurde die Lösung auf 60°C erhitzt und die Acrylplatten 30 min darin belassen. Diese Lösung wurde bei 4°C aufbewahrt und bis zum Auftreten einer leichten Trübung mehrfach verwandt. Im Anschluss an das Reinigen mit Natriumhydroxyd-Lösung wurden die Kammern mit Aqua tridest. mehrmals abgespült.