Untersuchungen zum Einfluss von wiederholten IS auf die uterine Leukozytenzahl

4.1.2.1 Uteriner PMN-Influx nach IS und Infusion von rekombinantem humanem Interleukin 8 (rhIL-8)

Die Auswirkung einer Nachbesamung 24 Stunden nach der Erstbesamung auf die intrauterine Leukozytenzusammensetzung ist weitgehend unbekannt. Für entsprechende Fragestellungen sollte ein Modellsystem einer wiederholten IS etabliert werden, bei dem die Erstbesamung durch die intrauterine Infusion von rhIL-8 simuliert wird. Im hier vorgestellten Vorexperiment wurde der PMN-Influx nach IS und rhIL-8-Infusion vergleichend untersucht.

Nach einer Besamung oder Bedeckung kommt es immer zu einem Influx von neutrophilen Granulozyten in den Uterus (KATILA et al. 1990). Durch das Chemokin rhIL-8 wird ein Influx von PMN in den Stutenuterus erreicht (ENGELKE et al. 1999, ZERBE et al. 2003).

Daher wurde bei den Stuten der Gruppe A (n=11, s. Abb. 6) 6 Stunden nach Insemination von Frischsperma (s. 3.1.5) und bei den Stuten der Gruppe B (n=11, s. Abb 6) 6 Stunden nach rhIL-8-Applikation der Uterus mit 50 ml PBS gespült (s. 3.2.4). Zum Ausschluss einer bakteriellen Kontamination des Uterus und zur Untersuchung der intrauterinen zellulären Zusammensetzung ist zu Versuchsbeginn eine so genannte Nullspülung (50 ml PBS) durchgeführt worden. Leukozytenzahl und - zusammensetzung der Spülflüssigkeit wurden jeweils in nach WRIGHT gefärbten Ausstrichen und durch Zellzählung mit der BÜRKER-Zählkammer analysiert (s. 3.2.3).

Nach Überprüfung der Rossesymptome (s. 3.2.11) wurde bei den Stuten der Gruppe A 24 Stunden vor der Besamung mittels hCG-Applikation (s. 3.2.11) die Ovulation induziert. Bei den Stuten der Gruppe B ist zeitgleich mit der rhIL-8-Applikation hCG zwecks späterer Besamung in einem weiteren Experiment verabreicht worden.

Die Untersuchungen der Uterusspülflüssigkeiten, welche 6 Stunden p. insem. gewonnen wurden, enthielten im Durchschnitt der 11 Stuten der Gruppe A (s. Abb. 6) Leukozytenzahlen von 35 x 10⁶/ml (s. Abb. 6). Sechs Stunden nach rhIL-8-Applikation konnten bei den 11 Stuten der Gruppe B im Mittel 43,5 x 10⁶ Leukozyten/ml (s. Abb. 6) aus der Gebärmutter

gespült werden. Der Anteil der neutrophilen Granulozyten an der Gesamtleukozytenpopulation lag in beiden Gruppen über 99 %. Alle Spülungen waren bakteriologisch negativ.

Bezüglich der Histologie wurden nur Stuten in den Versuch mit einbezogen, die anhand einer Endometriums-Biopsie in die Kategorien I bis IIa/b (KENNEY und DOIG 1986; SCHOON et al. 1992; s. 3.2.10, s. Anlage 2) eingestuft worden waren. Die endometrischen Veränderungen, welche die Kategorisierung bedingten, waren nur degenerativer und in keinem Fall akut inflammatorischer Natur.

0 20 40 60 80 100

Gruppe A: Frischsperma Gruppe B: rhIL-8 (n=11)

(n=11)

PMN (Mio/mll)

Abb. 6: Leukozyten-Influx 6 h nach Insemination oder rhIL-8-Infusion in den Uterus

Verglichen wurde die Anzahl der uterinen PMN in Mio/ml, die mit 50 ml PBS mit Hilfe eines, vom dem Embryotransfer abgeleiteten Spülverfahrens, 6 Stunden nach IS und 6 Stunden nach rhIL-8-Applikation, gewonnen werden konnten. Dargestellt sind die Mittelwerte und der Standardfehler (SEM).

Aufgrund der quantitativ vergleichbaren Menge an selektiv in den Uterus migrierten PMN nach Frischsperma- und rhIL-8-Infusion eignet sich rhIL-8 zur Simulation einer IS. Dies wurde in nachfolgenden Experimenten zur Untersuchung von Auswirkungen wiederholter IS entsprechend eingesetzt.

4.1.2.2 Uteriner PMN-Influx nach modellhafter wiederholter IS beim Pferd

Im Rahmen der gynäkologischen Betreuung von Stuten, die zur Besamung vorstellig werden, wird häufig eine wiederholte IS während einer Rosse durchgeführt. Nicht selten wird 24 Stunden nach der ersten Besamung eine zweite vorgenommen. Hier stellt sich die Frage nach der möglichen Beeinträchtigung des Trächtigkeitsergebnisses durch Spermienphagozytose durch uterine PMN, die durch die erste IS in den Uterus gelockt wurden (s. 4.1.1).

Im folgenden Experiment sollte geklärt werden, ob eine simulierte wiederholte IS (Gruppe B, Abb. 7) im Vergleich zur einmaligen IS (Gruppe A, Abb. 7) zu einem veränderten Leukozyteninflux in den equinen Uterus führt (s. Anlage 1).

Die Stuten der Gruppe A (n=21; Experiment I und II) wurden einmalig mit Frischsamen besamt (s. 3.1.9) und 6 Stunden später mit 50 ml PBS gespült. Den Probanden der Gruppe B (n=21; Experiment I und II) ist dagegen erst rhIL-8 in den Uterus appliziert worden (=

simulierte Erstbesamung); 24 Stunden später folgte eine Besamung (= simulierte Zweitbesamung). Sechs Stunden nach Applikation von rhIL-8 oder Frischsamen schloss sich jeweils die Spülung der Gebärmutter wie in Gruppe A an. Die uterinen Leukozyten wurden mit der BÜRKER-Zählkammer quantifiziert und in nach WRIGHT gefärbten Ausstrichen differenziert (s. 3.2.3).

Nach Überprüfung der Rossesymptome (s. 3.2.11) wurde bei allen Stuten 24 Stunden vor der IS mit Frischsamen mittels hCG-Applikation (s. 3.2.11) die Ovulation induziert (s. Anlage 1).

Alle Stuten hatte 24 Stunden nach Insemination von Frischsperma ovuliert.

In Abbildung 7 sind zwei Teilexperimente dargestellt. Die beiden Teilexperimente fanden in aufeinanderfolgenden Zuchtsaisons statt. Im Experiment I war zwischen einmaliger IS (Gruppe A, 35 x 10⁶ Leukozyten/ml Spülflüssigkeit) und rhIL-8-Infusion (43,5 x 10⁶ Leukozyten/ml Spülflüssigkeit, Gruppe B) kein signifikanter Unterschied in der Anzahl der, 6 Stunden nach der Stimulation aus dem Uterus gewonnenen, Leukozyten zu finden. Der Anteil der PMN lag immer über 99 %. Dies trifft auch auf die simulierte wiederholte IS der Gruppe B zu. Hier war sowohl innerhalb der Gruppe B im Vergleich zur rhIL-8-Infusion 24 Stunden

vorher, als auch zur einmaligen IS in Gruppe A kein signifikanter Unterschied bei der Anzahl der uterinen Leukozyten zu beobachten.

Im Experiment II war der PMN-Einstrom nach einmaliger IS (103 x 10⁶ Leukozyten/ml Spülflüssigkeit, Gruppe A) signifikant stärker als nach rhIL-8-Infusion (29 x 10⁶ Leukozyten/ml Spülflüssigkeit) (p < 0,05) und nach der simulierten wiederho lten IS in Gruppe B (18,3 x 10⁶ Leukozyten/ml Spülflüssigkeit) (p < 0,01). Innerhalb der Gruppe B war kein signifikanter Unterschied bezüglich der PMN-Anlockung nach simulierter erster und zweiter IS zu sehen. Auch in Experiment II lag der Anteil der uterinen PMN an der Gesamtleukozytenpopulation immer über 99 %.

einmalige IS rhIL-8

Vergleichend sind die PMN-Zahlen in Mio/ml als Mittelwerte und SEM in der Uterusspülflüssigkeit dargestellt, welche nach einmaliger IS (Gruppe A – Experiment I (n=11) und Experiment II (n=10)) und simulierter wiederholter IS (Gruppe B – Experiment I (n=11) und Experiment II (n=10)) jeweils 6 Stunden nach Applikation von Frischsamen oder rhIL-8 durch Spülung gewonnen wurden (s. 3.2.4 und Anlage 1).

Für die Auswertung der Spülproben wurden die Methoden der Differenzierung von nach WRIGHT gefärbten Ausstrichen und die Zellzählung mit der BÜRKER-Zählkammer angewandt. Der Anteil der PMN an der Gesamtleukozytenpopulation betrug stets > 99 %.

*, unterschiedlich mit p<0,05; ***, unterschiedlich mit p<0,001

Zusammenfassend ist festzustellen, dass eine simulierte wiederholte IS nicht zu einem erhöhten Leukozyteneinstrom in die Gebärmutter der Stute führt. Überraschenderweise kam es trotz gut definierter Versuchsbedingungen in den beiden Teilexperimenten zu einer stark unterschiedlichen PMN-Rekrutierung nach einmaliger instrumenteller Samenübertragung.

Mögliche Gründe für die ses Phänomen können einerseits bakterielle Uteruskontaminationen (s. 4.1.3) durch die Manipulationen (Spülungen, IS, IL-8-Infusion) oder die histologische Beschaffenheit des Endometriums der Stuten sein (s. 4.1.4). Andererseits könnten Komponenten der Besamungsportionen bisher unbekannte Einflüsse auf die Leukozytenimmigration haben. Diese sollen in geeigneten in- vitro-Experimenten untersucht werden (s. 4.4).

4.1.3 Einfluss der Uterusspülungen auf die bakterielle Kontamination der