Bestimmung der Phagozytosekapazität neutrophiler Granulozyten

Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) gehören zu den professionellen Phagozyten. Für eine schnelle und objektive Beurteilung der Phagozytoseaktivität wurde eine durchflusszytometrisch auswertbare Untersuchungsmethode für bovine PMN von ZERBE

(1994) und von ENGELKE (2000) für Pferdegranulozyten modifiziert. Sie ermöglicht Aussagen über den Anteil der phagozytierenden PMN (Phagozytoseaktivität) einer Zellsuspension und die mittlere Fluoreszenzintensität der Phagozytose-positiven Zellen als Maß für die Menge der phagozytierten Partikel (Ingestionskapazität).

Testdurchführung

Die in 3.1.2 beschriebenen FITC-markierten nicht vermehrungsfähigen Staphylokokken wurden als Phagozytosepartikel eingesetzt worden. Die Bakteriensuspension (1 ml, 2 x 10⁸ Bakterien/ml PBS) wurde nach dem Auftauen resuspendiert und auf zwei 1,5 ml-Reaktionsgefäße (Cups) verteilt. Bei 14.800 x g sind diese dann für 45 Sekunden zentrifugiert worden. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert.

Zur Opsonierung wurden 50 µl Poolserum (s. 3.1.7) und 450 µl PBS in ein Cup pipettiert. In dem zweiten Cup wurde für einen Kontrollansatz statt des Mischserums PBS eingesetzt. Das Bakterienpellet wurde resuspendiert und anschließend für 45 Minuten im Brutschrank inkubiert (37°C, 5% CO2).

Nach der Opsonisierung wurden die sedimentierten Bakterien resuspendiert. Pro Phagozytoseansatz sind 2 x 10⁵ PMN in 100 µl PBS in die Vertiefung einer 96- Loch-Rundboden-Mikrotiterplatte sowie 100 µl der entsprechend vorbereiteten Bakteriensuspension (= 2 x 10⁷ Bakterien pro Well) pipettiert worden. Dies entspricht einem PMN-Staphylokokken-Verhältnis von 1:100. Jede Probe wurde als Triplikat angesetzt. Zur homogenen Verteilung in der Suspension wurden sie für 30 Sekunden auf dem Mikrotiterplattenrüttler bewegt. Es folgte eine 60minütige Inkubation bei 37°C und 5% CO2. Nach 30 min wurden die Proben zwischenzeitlich kurz aufgerüttelt, um allen PMN einen gleichmäßigen Kontakt zu den Phagozytoseobjekten zu ermöglichen. Anschließend sind die Mikrotiterplatten auf Eis gestellt worden, um die Reaktion zu stoppen. Für die Auswertung mit dem Durchflusszytometer wurden 200 µl der Zell- Bakterien-Suspension in 200 µl Sheath fluid-PJ-Gemisch (s. 3.1.3) aufgenommen und bis zur Messung lichtgeschützt auf Eis gehalten.

Abb. 2: Ermittlung der Phagozytoseaktivität equiner neutrophiler Granulozyten mittels Durchflusszytometrie

Dargestellt ist ein Punktdiagramm („Dotplot“; s. 3.2.7) equiner PMN nach durchflusszytometrischer Analyse.

Die gezeigten PMN wurden mit opsonisierten Staphylokokken inkubiert. Phagozytose-positive PMN (B; hier:

59%) unterscheiden sich durch eine vermehrte Grünfluoreszenzintensität von PMN, die keine fluoreszierenden Staphylokokken aufgenommen haben (A). Die mittlere Fluoreszenzintensität der phagozytierenden PMN (hier:

610) ist ein Maß für die Quantität aufgenommener Staphylokokken. Die Werte wurden mit Hilfe der Software WinMDI (TROTTER 1998) ermittelt.

Auswertung

Je Probenansatz wurden 10.000 Zellen durchflusszytometrisch gemessen. Nach Aufnahme markierter Staphylokokken sind PMN, auch als Phagozytose-positive PMN oder FL-1-positive PMN bezeichnet, durch ihre erhöhte Grünfluoreszenz von Granulozyten, welche nicht phagozytiert haben, abgrenzbar. Unter den ausgewerteten Zellen befanden sich auch Bakterienaggregate, die im „lifegate“ (s. 3.2.7) mitgemessen wurden. Bei der Auswertung mit dem Programm WinMDI^© (TROTTER 1998) werden diese Bakterienaggregate aufgrund ihrer hohen Fluoreszenzintensität in FL-3 (s. 3.2.7) und ihrer FSC-SSC Werte erkannt und von der Auswertung ausgeschlossen. Außerdem sind nur PJ- negative PMN (s. 3.2.7) bewertet worden.

Der Prozentsatz der phagozytierenden Zellen wird als Phagozytoseaktivität bezeichnet. Die mittlere Fluoreszenzintensität der Phagozytose- oder FL-1-positiven PMN wird als Maß für die Anzahl inkorporierter Staphylokokken angesehen (Ingestionskapazität).

Grünfluoreszenzintensität (FL-1)

10⁰ 10⁴

Seitwärtsstreulicht (SSC) 0 1023

A B

Phagozytosemessungen zeichnen sich durch eine relativ hohe Interassayvarianz aus (ZERBE 1994).

Um die Phagozytoseleistung zweier Populationen (z.B. Blut- und Uterus-PMN) zu vergleichen, wurde die Phagozytose der Blut-PMN als Bezugsgröße (= 100%) genutzt. Die Phagozytose der Uterus-PMN wurde als prozentuale Abweichung vom Blutwert dargestellt.

3.2.7 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF)

Die indirekte MIF wurde zur Sichtbarmachung von zellulären Oberflächenstrukturen eingesetzt. Das Prinzip dieser Methode beruht auf zwei aufeinanderfolgenden Antigen-Antikörper-Reaktionen: Ein monoklonaler Antikörper (mAk) bindet als „Primärantikörper“

zuerst an einem bestimmten Epitop, das auf einer Zelle exprimiert ist. Ein zweiter, fluorochromkonjugierter Antikörper (Sekundär-Antikörper) bindet an den konstanten Teil (Isotyp) des Primär-Antikörpers. Mit Hilfe des Durchflusszytometers kann nun die Fluoreszenzintensität der Zelle gemessen werden, die als ein Maß für die Expressionsdichte der erkannten Oberflächenstruktur gilt.

Testdurchführung

Von einer auf 2 x 10⁶ Zellen/ml eingestellten PMN-Suspension wurden 100 µl in ein Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte (MTP) mit Rundboden (s. 3.1.1) gegeben. Jede Probe wurde als Triplikat angesetzt. Es folgte eine Zentrifugation der Platte bei 10°C für 3 min bei 100 x g.

Der Überstand der Zellsuspension wurde durch einmaliges Ausschlagen aus der MTP entfernt und das verbliebene Pellet in einem Mikrotiterplattenrüttler in der Restflüssigkeit resuspendiert (10 sec.). Außerhalb der Zentrifuge sind die Zellen, außer auf dem Mikrotiterplattenrüttler (Raumtemperatur), immer auf Eis gelagert worden. Dann wurden 20 µl des primären mAk (s. 3.1.8) in seiner Gebrauchskonzentration in die Wells pipettiert, die Negativkontrollen wurden mit 20 µl MIF-Puffer (s. 3.1.3) versetzt. Zur sorgfältigen Durchmischung wurde die MTP für 10 Sekunden gerüttelt (s. oben). Es folgte eine 20minütige Inkubationsphase auf Eis. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die nicht gebundenen, überschüssigen Antikörper durch zweimaliges Waschen (3 min, 220 x g, 10°C) mit 150µl

MIF-Puffer (s. 3.1.3) entfernt. Nach den Zentrifugationen ist der Überstand jeweils abgeschlagen und die Platten für weitere 10 Sekunden gerüttelt worden. Nun wurde der sekundäre, fluorochromkonjugierte Anti-Antikörper (s. 3.1.8; 1:100 verdünnte Stammlösung von DTAF-ZantiM-IgG+IgM) der verbleibenden Zellsuspension in einer Menge von 20 µl pro Well hinzugegeben. Um eine unspezifische Reaktion des sekundären Antikörpers mit den zu untersuchenden Zellen erkennen zu können, wurden auch die Wells der Negativkontrollen beschickt. Nach Aufrütteln sind die Zellen unter Lichtabschluss erneut 20 Minuten auf Eis inkubiert worden. Es folgten wiederum zwei Waschgänge mit MIF-Puffer (s. 3.1.3), bei denen überschüssige Antikörper entfernt wurden. Das letztlich vorliegende Zellpellet wurde in 100 µl PBS resuspendiert. Die Zellsuspension wurde sorgfältig aus den Wells herauspipettiert und in Messröhrchen (s. 3.1.1) überführt, in denen 100 µl eines Gemisches aus Sheath fluid und Propidiumjodid (PJ, s. 3.1.6) vorgelegt worden waren. Es schloss sich die Analyse im Durchflusszytometer (s. 3.2.5) an.

Seitwärtsstreulicht (SSC) 0 1023

10⁰ 10⁴ 10⁰ 10⁴

0 64

Zellzahl

Grünfluoreszenzintensität (FL-1)

A B

Abb. 3: Beurteilung der mittleren Fluoreszenzintensität neutrophiler Granulozyten nach indirekter MIF

Dargestellt ist ein Punktdiagramm („Dot plot“, A) einer Fluoreszenz-positiven PMN-Population, bei dem die Komplexität (SSC) gegen die Fluoreszenzintensität (FL-1) der Zellen aufgetragen ist. In B ist das entsprechende Histogramm gezeigt (Zellzahl/FL-1). Die Grünfluoreszenzintensität der PMN ist durch Markierung mit einem primären monoklonalen Antikörper (hier CZ5.15; s. 3.1.7) und einem sekundären Detektionsantikörper (s. 3.1.7) erzeugt worden, der mit dem grünfuoreszierenden Fluorochrom konjugiert war. Der Mittelwert der FL-1-positiven PMN betrug in diesem Beispiel 222 und wurde mit Hilfe der Analysesoftware WinMDI (TROTTER 1998) ermittelt.

3.2.8 Transmigrationstest

In Voruntersuchungen für den Einsatz am Versuchstier wurden in-vitro unter Zuhilfenahme einer Transmigrationskammer (s. 3.1.10) verschiedene chemoattraktive Substanzen auf ihre Wirksamkeit gegenüber equinen PMN analysiert. Zum Einsatz kam ein von FRANK (2000) etabliertes Verfahren zur Analyse des Migrationsverhaltens neutrophiler Granulozyten.

Angeregt von einer chemoattraktiven Substanz durchwandern hierbei die PMN (vorgelegt im oberen Well der Kammer) eine 10 µm starke Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 3 µm (s. 3.1.10) und sammeln sich im unteren „blinden“ Well an. Diese Methode bietet nicht nur die Möglichkeit zur quantitativen Bestimmung der Migrationsleistung einer Zellpopulation, sondern gestattet darüber hinaus eine weiterführende Charakterisierung der migrierten PMN.

Reinigung der Transmigrationskammer

Zur Reinigung wurden direkt vor Testdurchführung die Acrylanteile der Kammer in einmolarer Natriumhydroxyd-Lösung (s. 3.1.2 u. 3.1.10) und die Silikondichtung in Aqua tridest. gelegt (60°C, 30 min). Um einer Schädigung der Silikondichtung vo rzubeugen, muss der Kontakt mit Natriumhydroxyd-Lösung unbedingt vermieden werden. Danach wurden die Kammeranteile dreimal mit Aqua tridest. gespült und dann etwa 30 min bei 37°C getrocknet.

Nach der Testdurchführung wurden die Kammerteile gründlich mit Wasser gespült und in Aqua tridest. gelegt (30 min, Raumtemperatur). Danach wurden sie abgetrocknet und trocken gelagert.

Testdurchführung

In die Vertiefungen des unteren Kammerteils wurden 315 µl der zu testenden chemoattraktiven Substanz gegeben. Diese Flüssigkeit wurde mit 100 µl 100%igem isotonen Percoll^ (s. 3.1.4) unterschichtet. Dadurch wurde die Adhärenz der gewanderten Zellen am Boden der Vertiefungen vermindert. Die zehn Vertiefungen des unteren Kammerteils wurden nun mit einer Polycarbonatmembran bedeckt. Dabei ist es bedeutsam, dass sich unter der Membran keine Luftblasen ansammeln. Erreicht wurde das durch ein exaktes Einhalten des

Flüssigkeitsvolumens von 415 µl in der unteren Vertiefung. Auf die Membran wurde die Silikondichtung und darüber der obere Kammerteil plaziert und mittels Schraubenmuttern fixiert. In die Vertiefungen des oberen Kammerteils wurden abschließend jeweils 200 µl der Zellsuspension gegeben (1 x 10⁷/ml R0⁺ oder R3F⁺).

Inkubation

Die Inkubation der Transmigrationskammern erfolgte in einer Feuchtkammer (s. 3.1.9) für 2 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ in Luft.

Gewinnung der Zellfraktionen

Die Zellsuspensionen der oberen Wells (= nicht gewanderte Zellen) wurden durch sorgfältiges Pipettieren resuspendiert, um adhärente Zellen von der Oberseite der Membran zu lösen. Dabei ist auf Unversehrtheit der Polycarbonatmembran zu achten. Es wurden je Ansatz 100 µl Zellsuspension entnommen und in vorgekühlte, mit 100 µl Sheath fluid (s. 3.1.3) befüllte Probenröhrchen für die Durchflusszytometrie (s. 3.1.6) überführt.

Nach Entfernung der Schraubenmuttern wurde der obere Teil der Kammer waagerecht abgehoben, wobei sich Silikonmatte und Membran gleichzeitig mit ablösten.

Nach guter Durchmischung der Zellsuspension der „blinden“ Vertiefung wurden 100 µl entnommen und in vorgekühlte, mit 100 µl Sheath fluid befüllte Probenröhrchen für die Durchflusszytometrie (s. 3.1.6) überführt.

Auswertung

Zur Beurteilung der Anzahl migrierter und nicht migrierter Zellen mehrerer Ansätze wurde die Referenzzellmethode (s. 3.1.6) eingesetzt. Die Ansätze wurden mit einer bekannten Menge Referenzzellen versetzt und gründlich gemischt. Vor der Auswertung im Durchflusszytometer wurde allen Messansätzen PJ (s. 3.1.6) beigefügt. Bei der durchflusszytometrischen Messung kame n jeweils 10.000 Zellen zur Auswertung. Die Analysesoftware WinMDI (TROTTER 1998; s. 3.2.7) ermöglicht eine Differenzierung der beteiligten Leukozytensubpopulationen von den Referenzzellen. Mit Hilfe der Software Excel

wurde die Anzahl gewanderter und nicht gewanderter Zellen auf Basis der Referenzzellmenge berechnet. Dabei wurden von den aus den Wells entnommenen 100 µl Zellsuspension (jeweils 100 µl aus der oberen und unteren Abteilung) rechnerisch auf die ursprünglich vorhandenen Volumina (415 µl im unteren und 200 µl im oberen Well) geschlossen und das Verhältnis migrierter und nicht migrierter Zellen prozentual dokumentiert.

3.2.9 Bakteriologische Untersuchung von Uterusspülproben

Direkt im Anschluss an die Gewinnung der Uterusspülproben wurden jeweils ca. 2 ml der Flüssigkeit für eine bakteriologische Untersuchung zurückgelegt und bei -20°C aufbewahrt.

Die Auswertung dieser Proben sollte Aufschluss über den bakteriellen Kontaminationsstatus mit pathogenen oder unspezifischen Keimen des Uterus der Versuchsstuten geben. Mittels einer Spritze wurde unter aseptischen Kautelen die Flüssigkeit aufgenommen und in sterile Vorratsröhrchen (s. 3.1.2) verbracht. Der Nachweis kontaminierender Keime in der Probe erfolgte über eine direkte Keimanzüchtung und ein Anreicherungsverfahren in Nährmedien.

Die bakteriologische Untersuchung übernahm freundlicherweise die Arbeitsgruppe des bakteriologischen Labors der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover.