3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 G ERÄTE UND M ATERIALIEN
3.1.1 Geräte-, Klinik - und Laborbedarf
Aqua dest.-Aufbereitungssystem „SG Umkehr-Osmoseanlage Typ RO 50/14 SMB TypI“
Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG
Reinstwasser System Typ SG –RS 90-4 UF“
Autoklav Typ GE406
Druckbehälter zur Sterilfiltration
Durchflusszytometer mit Computereinheit
“Fluorescence Activated Cell Analyser (FACScanR )“
Eismaschine Typ UBE 30-10 Fa. Ziegra, Isernhagen Fluoreszenzmikroskop mit Ploemiluminator und
Laborwaage BL310 Fa. Sartorius GmbH, Göttingen
Magnetrührer mit Heizplatte IKAMAG®RH Fa. Janke u. Kunkel, Staufen Pipette, einstellbar“ Transferpette®“ (2-20µl)
Pipetten, einstellbar „pipetman“ (100-1000 µl, 20-200µl, 10-100 µl, 1-20 µl)
Röhrchen-Schüttler Typ Reamix
Rüttler für Mikrotiterplatten AM69 Microshaker Sterile Werkbank, Heraus LaminAir® HLB 2472 Kühlzentrifuge Varifuge K Typ 4500
Zentrifuge Megafuge 1.0R
Tischzentrifuge mit Winkelrotor für Reaktionsgefäße 1,5 ml
Fa. Brandt, Wertheim
Fa. Gilson, Villers Le Bel/Frankreich Fa. ASID, Unterschleißheim Plattenzentrifuge mit Plattenrotor, Typ UJ II KS Fa. Heraeus-Christ, Osterode Hettich Zentrifuge Rotina 48 Fa. Hettich, Tuttlingen
Bunsenbrenner mit automatischer Zündung gasprofi 1
Fa. Wartewig, Göttingen CO2-Brutschrank Typ BK 5060E Fa. Heraeus-Christ, Hanau Feuchtkammer (Plastikbox mit Gittereinsatz) Einzelhandel
Pinzette, gebogen, anatomisch Fa. Eickemeyer (170710), Tuttlingen PC-MB 25 x 80 mm, 3 µm Porengröße, PVP
Filter 0,45 µm „Sartobran-PH Capsule Sartobran® Filter 0,2 µm „Sartobran-PH Capsule Sartobran®
Fa. Brandt, Wertheim
Fa. Cytogen (442000), Ober-Mörlen Fa. Sartorius, Göttingen
Fa. Sartorius, Göttingen
Klinikbedarf
Cervix- Zange nach Albrechtsen, 54 cm Künstliche Vagina, Modell Hannover Einwegtupferentnahmegeräte
Uterusbiopsiegerät nach Roberts, 65 cm Fa. Eikemeyer, Tuttlingen Scheidenspekulum nach Polansky, 25 cm
Embryotransferkatheter „Neustadt/Aisch“
Fa. Eikemeyer, Tuttlingen
Fa. W. Wörrlein, Medizintechnik, Ansbach Untersuchungshandschuhe, Der supersensitive, 90
cm, transparent,
Untersuchungsgel Bovi.VetGel
Kanüle Neolus, 1,2 x 40 mm; 0,9 x 40 mm
Fa. Müller
Tierärztebedarf J. Lehneke, Schortens Fa. Terumo, Leuven/Belgien
S-Monovette®, 10 ml, Lithium-Heparin Kanüle für S-Monovette
Fa. Sarstedt, Nümbrecht Fa. Sarstedt, Nümbrecht Spritzen, 2, 5, 10 und 20 ml Fa. Codan, Leusahn
Spritzen, 50 ml mit 60-ml-Skalierung Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Vacutainer® Brand Luer Adapters
Vacutainer® Systems, Halter
Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
Laborbedarf
Fa. Techno Plastic Products TPP® Fa. Eppendorf, Hamburg
Objektträger, 76 x 26 mm Fa. Heiland, Gallin Laborflaschen mit Gewinde, 100 ml, 500 ml
Papier, saugfähig
Pasteurpipetten, 22,5 cm aus Glas
Pipettenspitzen Plastibrand® 0,5 µl -20 µl Pipettenspitzen, blau und gelb
Fa. VWR international, Hannover Einzelhandel
Fa. Brandt (747720), Wertheim Fa. Brandt (702565), Wertheim
Fa. Sarstedt (70/762002 und 70/760002), Nürnbrecht
Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 ml Fa. Becton Dickinson (352008), Heidelberg Probenröhrchen mit 12 ml Fa. Greiner (191161), Frickenhausen Falcon, 50 ml, Polypropylen
Händedesinfektionsmittel Sterilium
Fa. Corning (430829), New York/USA Fa. Bode Chemie (669), Hamburg
3.1.2 Medikamente, Reagenzien und andere Materialen
Acridinorange Fa. Sigma-Aldrich (A6014), Steinheim
bovines Serum-Albumin, BSA, Fraktion V Fa. PAA (K41-001-100), Linz/Österreich DTAF-Ziegen-Antikörper-anti-Maus-IgG und IgM,
schwere und leichte Ketten
Fa. Dianova (115-015-068), Hamburg Dinolytic®, 5 mg/ml, (Dinopros-Trometamol) Fa. Pharmacia Tiergesundheit, Erlangen Ethanol, absolut Fa. J.T. Baker (8228), Deventer/Holland
Ethidiumbromid Fa. Sigma-Aldrich (E87A51), Steinhe im
Fetales Kälberserum (FCS) Fa. Biochrom (SO 113/431B), Berlin Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Fa. Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim Formaldehyd Solotus 35-37% Fa. Caelo, Hilden
Interleukin-8, human, rekombinant (72a.a.) Fa. Pepro Tech (200-08M) , Rocky Hill, NJ/USA
Isopropyl-Alkohol 70 % Tierärztebedarf J. Lehneke, Schortens Kaliumchlorid (KCL), kristallin
Kaliumhydrogencarbonat, reinst (KHCO3)
Fa. Sigma-Aldrich (P-4504), Steinheim Fa. Merck (4852), Darmstadt
Natriumazid, NaN3, 10%ig Fa. Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim Natriumchlorid, NaCl Fa. Roth (9265.2), Karlsruhe
Natriumhydroxyd-Pellets, wasserfrei Fa. Sigma-Aldrich (S-5881), Steinheim Natriumhypochlorit-Lösung 12% Fa. Roth (9062), Karlsruhe
Pansorbin® cells (hitzeinaktivierte Staphylokokken sp.)
Ovogest® 1500 (1500 IE Choriongonadotropin) Paraformaldehyd
Fa. Calbiochem-Novabiochem (507867), Bad Soden/Taunus
Fa. Intervet, Unterschleißheim
Fa. Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim PBS Dulbecco, Instant (9,55 g/l, phosphatgepufferte
Salzlösung)
Fa. Biochrom (L-182-10), Berlin
Percoll® Fa. Amersham Biosciences (17-0891-01), Uppsala/
Schweden
PMA, Phorbol-12-Myristat-13-Acetat Fa. Sigma (P-8139), Deisenhofen Propidiumjodid, PJ
RPMI 1640-Medium (Trockensunbstanz)
Fa. Calbiochem-Novabiochem (537059), Bad Soden/Taunus
Phosphatpuffer (PBS/ 2fach PBS) NaCl
Na2HPO4 x H2O KH2PO4
KCL
Aqua tridest.
8 g /16 g 1,24 g /2,48 g 0,2 g /0,4 g 0,2 g /0,4 g ad 1000 ml /1000 ml MIF-Puffer (PBS mit 1% BSA und 0,01%
NaN3) BSA NaN3
PBS
1,0 0,01 g ad 100 ml
Medium für Zellkulturarbeiten
Zellkulturmedium R0+ R0- (RPMI 1640 mit Hepes-Puffer) mit Zusatz von Penicillin (10 IU/ml) Streptomycin (100 µg/ml)
3.1.4 Materialien für die Zählung, Differenzierung, Vitalitätsbestimmung und Separation von Leukozyten und Spermien
WRIGHT-Lösung
Die Anfärbung eines Blutausstriches zur mikroskopischen Erstellung eines Differentialblutbildes erfolgte mit WRIGHT-Lösung (s. 3.1.2). Sie wurde in der im Handel erhältlichen Ausgangslösung unverdünnt eingesetzt (s. 3.2.3).
TÜRK’sche -Lösung
Zur Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im Blut (s. 3.2.3) wurde handelsübliche unverdünnte TÜRK’sche-Lösung (Gentianaviolett 20 mg, Essigsäure 6,5 ml, Aqua dest. ad 100 ml, s. 3.1.2) eingesetzt.
Acridinorange-Ethidiumbro mid
Um die Anzahl vitaler Zellen mikroskopisch zu bestimmen, wurde die bei 4°C maximal 6 Monate haltbare Lösung eingesetzt. Die Gebrauchslösung enthielt 2,5 mg Acridinorange und 2,5 mg Ethidiumbromid, die in 1000 ml PBS mit 0,02% Natriumazid (s. 3.1.2) gelöst wurden.
Percoll
Percoll ist ein synthetisches Sol, welches aus Silikatpartikeln besteht, die mit Polyvinyl-Pyrrolidon beschichtet sind. Bei 20°C hat es ein spezifisches Gewicht von 1,130 g/ml. In einen isotonen Zustand wurde das Percoll durch Zusatz von 870 mg kristallinem NaCl zu 100 ml Percoll gebracht. Mit steriler 0,9%iger NaCl-Lösung (s. 3.2.4.3) wurden das 100%ige Percoll zu 78%ige und eine 55%ige Percoll- Lösung verdünnt.
3.1.5 Induktoren der Leukozyteneinwanderung in den Uterus
Interleukin-8 ist ein physiologisch im weiblichen Endometrium synthetisiertes Zytokin. Als Chemokin für neutrophile Granulozyten, deren Einwanderung in den equinen Uterus stimuliert wurde, ist in dieser Arbeit rekombinantes humanes, lyophilisiertes Interleukin-8 (rhIL-8, 8,4 kDa, 72 Aminosäuren) eingesetzt worden.
Das lyophilisierte Cytokin wurde mit 0,1 % BSA in PBS rekonstituiert und auf 1 µg/ml verdünnt und in aliquoten Teilen zu 1 ml bei -20°C gelagert. Vor der Anwendung am Tier wurde eine Konzentration von 25 ng rhIL-8/ml Trägermedium (PBS) gewählt. Dafür wurden die benötigten Aliquots unmittelbar vor der Applikation aufgetaut.
Den grössten Anteil an den verschiedenen Arten der Belegung einer Stute hat die instrumentelle Samenübertragung mit Frischsamen. Dieser enthält zu unterschiedlich hohen Anteilen Eigelb, Magermilchpulver, Glucose, Ampuwa und ein Antibiotikum. Frischsamen ist in seiner Gesamtheit als Chemoattraktivum für equine PMN vielfach beschrieben (s.
2.1.5).
3.1.6 Materialien für die Durchflusszytometrie
Aqua tridest. und Natriumhypochlorit
Sterilfiltriertes Aqua tridest. (Porengröße 0,2 µm, s. 3.1.2) und 1%ige Natriumhypochlorit-Lösung (s. 3.1.2) wurden zur Spülung und Reinigung des Messkanal- und Schlauchsystems des Durchflusszytometers verwandt.
Trägermedium zur Messung („Sheath fluid“)
PBS (s. 3.1.3) mit Zusatz von Natriumazid (final 1,5 mmol/l, s. 3.1.2) diente als Trägermedium. Anstelle des kommerziell erhältlichen Trägermediums wurde diese Lösung nach Sterilfiltration mit Hilfe des Filters „Sartobran“ (s. 3.1.1) als Trägermedium für alle Messproben eingesetzt.
Propidiumjodid
Das Fluorochrom Propidiumjodid (PJ; s. 3.1.2) interkaliert mit doppelsträngiger DNA membrandefekter Zellen. Somit dient PJ zur Beurteilung der morphologischen Integrität der Zellen und damit des Anteils der vitalen Zellen. Das Emissionsmaximum des Farbstoffes liegt bei 639 nm. Die kristalline Grundsubstanz wurde zur Herstellung der Gebrauchslösung in PBS (100 µg/ml) gelöst, welche in aliquoten Teilen zu 1 ml bei -20°C gelagert wird. Bei den durchflusszytometrischen Messungen erhielt jede Messrobe PJ in einer Endkonzentration von 2 µg/ml.
Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung
Bovine, mononukleäre FITC-markierte (s. 3.1.2) Zellen sind als Referenzzellen für die durchflusszytometrische Zellzahlbestimmung eingesetzt worden. Mit Hilfe eines Ficoll® -Dichtegradienten wurden diese aus EDTA-Blut gewonnen (Reinheit > 98 %). Im Anschluss an eine hypotone Lyse und zwei Waschgänge mit PBS (jeweils 300 x g, 8 min, 4°C) wurde die Zellsuspension mit dem monoklonalen Antikörper (mAk) Bo1 (500 µl unverdünnte Lösung) versetzt und für 30 min bei 4°C inkubiert. Es folgten drei weitere Waschgänge (jeweils 300 x g, 8 min, 4°C) mit MIF-Puffer (s. 3.1.3) und eine weitere Inkubatio n bei 4°C
für 30 min mit dem FITC-konjugierten Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper (s. 3.1.7) sowie 3 weitere Waschungen (s. oben). Die Zellen wurden dann mit 4%igem Paraformaldehyd (s.
3.1.2) 12 – 24 Stunden fixiert. Im Anschluss an die Fixierung sind die Zellen dreimal mit MIF-Puffer (s. 3.1.3) gewaschen (s. oben) und dann in einer Endkonzentration von 0,8 - 10 x 106 Zellen/ml Sheath- fluid-PJ-Lösung (20 µl PJ/ml Sheath fluid; s. 3.1.6) bei 4°C lichtgeschützt gelagert worden.
3.1.7 Materialien für die Bestimmung der Phagozytoseaktivität FITC-markierte Streptokokken
Um die Phagozytosefähigkeit der Leukozyten mit Hilfe des Durchflusszytometers nachweisen zu können, sind als Ingestionspartikel Staphylokokken mit FITC (s. 3.1.2) fluoreszenzmarkiert worden. Bei den Phagozytoseobjekten handelt es sich um fixierte Staphylokokken aus einer standardisierten Suspension (Pansorbin®, 2 x 108 Bakterien/ ml, s.
3.1.2), welche in der markierten Gebrauchssuspension in aliquoten Teilen zu 1 ml bei -20°C und lichtgeschützt gelagert wurden.
Serum zur Opsonisierung der Staphylokokken
Zur Opsonisierung der Bakterien wurde natives Serum verwendet worden, welches von 3 Spenderstuten aus der Klinik für Pferde der Tierärztliche Hochschule Hannover gewonnen worden war. Ausgangsmaterial war nichtgerinnungsgehemmtes Vollblut, das unter sterilen Kautelen mit dem Vacutainersystem (s. 3.1.1) aus der Vena jugularis entnommen wurde. Bei Raumtemperatur wurde das Blut eine Stunde stehengelassen, bis eine deutliche Koagulation sichtbar war. Anschließend wurden die Röhrchen 20 min bei 1500 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Das Serum wurde durch Abheben gewonnen und erneut zentrifugiert (s. oben).
Nach Gewinnung des Serums der 3 Tiere wurde es zu gleichen Anteilen zusammengegeben (gepoolt). Die Lagerung erfolgte unverdünnt bei -20°C in aliquoten Teilen, damit es für jeden Einsatz nur einmal aufgetaut werden musste.
3.1.8 Materialien für die indirekte Membranimmunfluoreszenz
Monoklonale Antikörper
Für die indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF; s. 3.2.8) sind als Primärantikörper monoklonale Antikörper (mAk) verwendet worden (Herkunft, Spezifität und Gebrauchsverdünnung der mAk sind aus Tabelle 1 zu entnehmen). Der als Sekundärantikörper für die indirekte MIF verwendete „Ziege-anti-Maus IgG und IgM, schwere und leichte Kette“-Antikörper ist mit Dichlorotriazinyl-Amino-Fluorescein konjugiert (DTAF – Zg-anti-M – IgG +IgM (H + L), s. 3.1.2). Dieser Antikörper war absorbiert gegen equine-, bovine- und humane Serumproteine und hatte eine Konzentration von 1,5 mg/ml. Vor Verwendung wurde eine Gebrauchsverdünnung (1:100) hergestellt. Zur Verdünnung aller Antikörper diente MIF-Puffer (s. 3.1.3).
Tab. 1: Verwendete monoklonale Antikörper
mAk Donor Isotyp Verdünnung Spezifität
CZ3.1a Maus IgG1 ohne EqCD11a/18 (LFA-1)
CZ4 a Maus ohne EqMHC-Klasse-I
CZ5.15 a Maus IgG1 ohne EqCD44
Referenzen und Herkunft der mAk:
a LUNN et al. (1998)
3.1.9 Materialien für den in-vitro-Transmigrationstest
Frischsamenverdünner
Für die in-vivo- und in- vitro-Experimente wurde jeweils ein klinikeigener Magermilch-Eigelb-Verdünner eingesetzt. Die Herstellung erfolgte in der Tierärztlichen Klinik für Pferde, Dres. Genn und Steinmann, Mühlen. Zu unterschiedlichen Teilen (die exakten
Mengenverhältnisse sind vertraulich) sind in diesem Verdünner u.a. Magermilchpulver, Glucose, Eigelb, Ampuwa und ein Antibiotikum (s. 3.1.2) enthalten. Um die groben Bestandteile zu entfernen wird dieses Gemisch erst zentrifugiert (4000 x g, 20 min, Raumtemperatur) und anschließend mit Hilfe von Milchfilterschläuchen (s. 3.1.1) filtriert. Zu je 100 ml wird der Verdünner bei -20° C eingefroren und erst direkt vor der Verwendung aufgetaut. Um eine spätere Messung mit dem Durchflußzytometer zu ermöglichen, wurde der Verdünner nach dem Auftauen erneut mit Hilfe eines Filters (0,45 µm) filtriert.
Bereitstellung von Seminalplasma und membrangeschädigten Spermien
Von einem sich im Deckeinsatz befindlichen 3 jährigen Warmbluthengst einer Besamungsstation in Niedersachsen, wurde ein vollständiges Ejakulat mit Hilfe eines Phantoms und einer künstlichen Vagina, Modell Hannover, gewonnen. Der Hengst zeigte eine sehr gute Libido und benötigte einen Aufsprung bis zur Ejakulation. Für die Aufbereitung wurde das Ejakulat in einen vorgewärmten Messbecher (38°C) gegeben und mit Hilfe eines Milchfilterschlauches (s. 3.1.1) von Schmutzpartikeln und Schleimanteilen befreit. Das Ejakulat hatte ein Volumen von 72 ml und eine Dichte von 264 Mio. Samenzellen/ml. Die Anzahl der vorwärtsbeweglichen Spermien betrug 60 %, die der ortsbeweglichen und unbeweglichen jeweils 20 %. Dieses native Sperma wurde 10 min bei 2400 x g zentrifugiert.
Anschließend wurde der Überstand, das Seminalplasma, vorsichtig abpipettiert und erneut zentrifugiert (8 min, 800 x g), um alle Samenzellen zu eliminieren. Bei der mikroskopischen Kontrolle waren danach keine Spermien auffindbar. Bei -20° C wurde das Seminalplasma in aliquoten Teilen zu 5 ml gelagert und erst kurz vor der in-vitro-Verwendung aufgetaut. Vor dem Einsatz des Seminalplasmas in der Transmigrationskammer wurde es mit Hilfe eines Filters mit einer Porengröße von 0,45 µm filtriert (s. 3.1.1). Für in-vitro-Experimente, bei denen membrangeschädigte Spermien eingesetzt werden sollten, wurde das verbleibende Spermienpellet in RO+-Medium (s. 3.1.3) resuspendiert und in Aliquots zu 1 Mio Spermien/ml bei -20° C gelagert. Nach dem Auftauen wurden 100 % PJ-positive Spermien nachgewiesen.
Bereitstellung von vitalen Spermien
Vom selben Hengst wurde im gleichen Verfahren bei einem erneuten Sprung ein Ejakulatvolumen von 21 ml mit einer Dichte von 416 Mio. Samenzellen/ml mit normaler Farbe, Konsistenz und Geruch gewonnen. Mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskops (s. 3.1.1) mit vorgewärmtem Heiztisch wurde bei 40facher Vergrößerung die Motilität der Spermien geschätzt (60 % vorwärtsbewegliche, 20 % ortsbewegliche und 20 % unbewegliche Spermien). Es folgte eine Zentrifugation des Ejakulates (100 x g, 10°C, 5 min) zur schonenden und weitgehenden Abtrennung des Seminalplasmas. Dieses wurde abgehebert und das im Glas verbleibende Spermienpellet in einer 2%igen Glucose-Nährlösung resuspendiert. Für die weiteren Arbeitsgänge wurde die Spermiensuspension innerhalb von zwei Stunden bei 4°C in das Labor der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover verbracht. Hier erfolgte eine Verdünnung der Spermien auf 2 x 106 Zellen/ml in 2%iger Glucose-Lösung. Vor Plazierung der Spermiensuspension in die unteren Vertiefungen der Transmigrationskammer wurde zur Bestimmung des Anteils lebender Spermien eine Färbung mit Acridinorange-Ethidiumbromid (s. 3.1.4) durchgeführt. Fünfzig Prozent der Samenzellen wiesen eine intakte Zellmembran auf (PJ-negativ). Für die Verwendung in der Transmigrationskammer wurde die Suspension auf 4 x 105 Samenzellen/315 µl 2%ige Glucose-Lösung eingestellt. Zur Bereitstellung einer 100 % PJ-positiven Spermienpopulation sind 2 ml dieser Suspension in einem Eppendorfcup (s. 3.1.1) bei -20°C für 30 min eingefroren und anschließend wieder aufgetaut worden.
Zent rifugationsüberstände nach Spermienwaschung
Eingesetzt wurde ein in der Klinik Dres. Genn und Steinmann, Mühlen, aufgestallter 3 jähriger, gesunder Hengst. Er befand sich zur Zeit der Samenentnahme im Deckeinsatz. Die Untersuchung des Ejakulats ergab eine Dichte von 312 Mio. Spermien/ml, ein Volumen von 36 ml und eine Motilität von 70 % vorwärtsbeweglichen, 20 % ortsbeweglichen und 10 % unbeweglichen Spermien. Vor der ersten Spermien-Waschung erfolgte eine Zentrifugation (100 x g), die der Entfernung des Seminalplasmas diente, welches anschließend verworfen wurde. Es wurden dann 4 Waschungen mit PBS mit (140 x g) durchgeführt, wobei nach jeder Zentrifugation der Überstand nach Dekantierung abpipettiert und in ein steriles Gefäß überführt wurde. Die erste Waschung wurde mit 50 ml, alle folgenden mit 10 ml PBS (s.
3.1.3) durchgeführt. Alle anderen Überstände sind filtriert (0,2 µm Porengröße; s. 3.1.1) und bei -20°C eingefroren worden.
Nach jeder Zentrifugation wurden die Spermien nach Resuspendierung in PBS einer Acridinorange- Ethidiumbromid-Färbung (s. 3.1.4) unterzogen. Mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops und der Bürker-Zählkammer (s. 3.1.1) sind die prozentualen Anteile der lebenden und toten Spermien bestimmt worden. Nach der ersten Zentrifugation zur Entfernung des Seminalplasmas waren noch 20 % der Spermien vital, nach der ersten PBS- Waschung noch 3 %; nach der 2. Waschung und später waren keine vitalen Spermien mehr zu finden.
Transmigrationskammer
Zur Verfügung standen vier 10-Well- Transmigrationskammern (s. 3.1.1), die jeweils aus einer Acrylbodenplatte (50 x 101 x 11 mm), einer Acryldeckplatte (50 x 101 x 6 mm), einer Silikondichtungsmatte und 6 Schraubenmuttern bestehen. 10 Rundboden-Vertiefungen für ein Volumen von je 415 µl sind in die Bodenpla tte eingelassenen. Sie stimmen mit der Lokalisation der durchgehenden Bohrungen der Deckplatte überein. Die Kompartimente der Boden- und der jeweilig zugehörigen Deckplatte wurden beim Zusammenbau durch eine zwischengelegte Polycarbonatmembran (s 3.1.1) getrennt, die somit den Boden für die Vertiefungen der Deckplatte bildet. Ebenfalls zwischen die beiden Platten und auf die Polycarbonatmembran ist die Silikonmatte zur Abdichtung der nachher verschraubten
Transmigrationskammer plaziert worden. Sie ist entsprechend den Bohrungen der Acrylplatten mit Löchern ausgestattet. Sechs Gewindestangen sind in der Bodenplatte verankert, die beim Zusammenstecken durch entsprechende Einsparungen der Silikonmatte und der Deckplatte führen. Die beiden Acrylplatten werden mit Hilfe der Schraubenmuttern mäßig fest aneinander gepresst.
Polycarbonatmembran
Die Polycarbonatmembran weist eine glänzende, wenig adhärente (sie zeigt in Richtung Deckplatte) und eine matte, stärker adhärente Seite (sie weist in Richtung Bodenplatte) auf.
Sie ist etwa 10 µm dick und 25 x 80 mm groß. Die Poren besitzen eine Größe von 3 µm; es befinden sich 2 x 106 Poren auf einem Quadratzentimeter der Membran.
Feuchtkammer
Um während der Inkubationsphase im Brutschrank das Verdunsten von Flüssigkeiten möglichst gering zu halten, wurde eine Feuchtkammer (s. 3.1.1) eingesetzt. Hierbei handelte es sich um eine Kunststoffbox mit Gittereinsatz, die mit etwa 20 ml einer 1%igen Kupfersulfatlösung (s. 3.1.3) befüllt wird.
Reinigung der Kammer
Eine einmolare Natriumhydroxyd-Lösung (s. 3.1.3) wurde zur Reinigung der beiden Acrylplatten der Transmigrationskammern verwandt. Hierfür wurden 22 g Natriumhydroxyd-Pellets (s. 3.1.3) in 550 ml Aqua tridest. gelöst. Zur Reinigung wurde die Lösung auf 60°C erhitzt und die Acrylplatten 30 min darin belassen. Diese Lösung wurde bei 4°C aufbewahrt und bis zum Auftreten einer leichten Trübung mehrfach verwandt. Im Anschluss an das Reinigen mit Natriumhydroxyd-Lösung wurden die Kammern mit Aqua tridest. mehrmals abgespült.
3.1.10 Probanden
Alle eingesetzten Pferde waren Warmblutstuten in einem Alter von 2 bis 7 Jahren. Bei diesen nur für die Zucht gehaltenen Tieren handelte es sich um Maidenstuten oder Stuten mit maximal 2 Fohlen. Für die Durchführung der in- vivo-Versuche kamen ins gesamt 42 Stuten zum Einsatz. Hierbei handelt es sich zum einen um Traberstuten eines niedersächsischen Gestüts, zum anderen um Warmblutstuten aus einem Gestüt in Mecklenburg-Vorpommern.
Hier sind Stuten der verschiedensten Verbände zu finden: Hannover, Ho lstein, Oldenburg, Westfalen und Zangersheide. Alle Stuten waren bei der Probenentnahme klinisch gesund.
In zwei aufeinander folgenden Zuchtsaisons wurden 2 Experimente (I und II) mit jeweils einer Gruppe A und einer Gruppe B durchgeführt. In Experiment I befanden sich 22 Stuten (Gruppe A: n=11, Gruppe B: n=11) und in Experiment II 20 Stuten (Gruppe A: n=10, Gruppe B: n=10). Bei den Versuchen zur Bestimmung der indirekten Membranimmunfluoreszenz und der Phagozytoseaktivität wurden nur die Stuten des Experimentes I einbezogen. Aufgrund von Fehlern in der Versuchsdurchführung konnten nicht die Ergebnisse aller Stuten ausgewertet werden. Daraus ergaben sich bei der Bestimmung der Phagozytoseaktivität Gruppengrössen von 8, 9, 10 und 11 Tieren und bei der indirekten Membranimmunfluoreszenz Gruppengrössen von 9, 10 und 11 Tieren.
Die Bestimmung des hormonellen Status (Progesteron und Östrogen) erfolgte bei den 42 Stuten der Experimente I und II sowie bei 12 Stuten aus orientierenden Vorversuchen (integriert in Abb.5).
Für die Einarbeitung in die immunologischen Methoden sowie für die in-vitro- Transmigrationsexperimente wurden bis zu 5 Stuten aus der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
Für die Frischsamengewinnung der in- vivo-Experimente und für den Erhalt von Spermien bzw. Seminalplasma der in- vitro-Experimente sind 8 Hengste des Zuchtgebietes Oldenburg eingesetzt worden. Alle Hengste waren 3 bis 8 Jahre alt und befanden sich im regelmässigen Deckeinsatz. Die Hengste wiesen bei den Samenentnahmen keine Anzeichen einer Krankheit auf.
3.2 Methoden
3.2.1 Gewinnung und Separation von Leukozyten aus dem Blut
3.2.1.1 Blutentnahme
Zeitgleich mit den uterinen Spülungen erfolgte für die in-vitro-Untersuchungen die Blutentnahme zur Gewinnung von Leukozyten durch Punktion der gestauten Vena jugularis unter sterilen Kautelen mittels Vacutainersystem (s. 3.1.1). Hierzu wurden Vacutainerröhrchen mit Natrium- Heparin-Zusatz benutzt. Bis zur Leukozytenseparation wurden die Röhrchen bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Zur Bestimmung des Progesteron- und Östrogengehaltes im Plasma wurde das Blut unter gleichen Bedingungen mit Hilfe von Li-Heparin-Röhrchen (s. 3.1.1) genommen.
3.2.1.2 Serumgewinnung
Vacutainerröhrchen ohne Zusatz von Antikoagulanz (s. 3.1.1) kamen für die Gewinnung von nicht gerinnungsgehemmten Vollblut und die anschließende Serumpräparation zum Einsatz.
Bis zur vollständigen Gerinnung wurde die Blutprobe bei Raumtemperatur gelagert und anschließend zentrifugiert (1.500 x g, 20 min, 20°C). Das Serum von 3 gesunden Stuten wurde abgesaugt, ein weiteres Mal zentrifugiert (s. oben) und abschließend gepoolt. In aliquoten Teilen (1 ml in 1,5- ml- Reaktionsgefäßen, s. 3.1.1) wurde das Serum bei -20°C gelagert.
3.2.1.3 Separation polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten
Hypotone Erythrozytolyse
Die Elimination der Erythrozyten wurde durch eine hypotone Lyse erzielt: Zur Erythrozyten-Sedimentation wurde das Vollblut ca. 30 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach
Gewinnung vo n 10 ml des leukozytenreichen Überstandes, welcher immer noch Erythrozyten enthält, wurde dieser für die Lyse zunächst mit 20 ml Aqua tridest. (4°C) vermengt und 10 Sekunden später mit 20 ml doppeltkonzentriertem PBS (4°C; s. 3.1.3.) gemischt, um die Isotonie wieder herzustellen. Es schloß sich eine 8- minütige Zentrifugation der Zellsuspension an (220 x g, 4°C). Nach Dekantieren des Überstandes wurde das Zellpellet in dem verbleibenden Rest des Überstands resuspendiert, in 50 ml PBS (4°C) aufgenommen und erneut zentrifugiert (8 min, 140 x g, 4°C). Nach Zentrifugation und Entfernen des Überstandes wurde der Vorgang der Erythrozytolyse wiederholt (s. oben). Es schlossen sich 2 weitere Waschgänge mit Zentrifugation (8 min, 140 x g, 4 °C) und Resuspendierung in 50 ml PBS an. Am Ende erfolgte die Bestimmung der Leukozytenzahl (s. 3.1.4) und die Einstellung der erforderlichen Zelldichte.
Percoll-Separation
Für die Gewinnung von PMN in hoher Reinheit folgte der 30-minütigen Erythrozyten-Sedimentation eine Percoll®-Dichtegradienten-Zentrifugation. Bei Raumtemperatur wurde Percoll® unterschiedlicher Dichte (55% und 78%; s. 3.1.2) in einem 50- ml- Polypropylenröhrchen (s. 3.1.1) übereinander geschichtet: Zunächst wurden 10 ml des 55%igen Percolls in das Röhrchen gegeben. Diese Lage wurde mit Hilfe einer 10 ml Spritze mit aufgesetzter Kanüle (0,8 x 50 mm) durchstochen und mit dem 78%igen Percoll (10 ml) behutsam unterschichtet. Ebenfalls mit Spritze und Kanüle sind vorsichtig und langsam 10 ml des leukozytenreichen Überstandes über die obere Percoll-Lage geschichtet worden.
Anschließend wurde das Röhrchen zentrifugiert (1000 x g, 20 min, 20°C). Bevor die
Anschließend wurde das Röhrchen zentrifugiert (1000 x g, 20 min, 20°C). Bevor die