4 ERGEBNISSE
4.1 U NTERSUCHUNG ZUM E INFLUSS DER INSTRUMENTELLEN S AMENÜBERTRAGUNG (IS) AUF DIE UTERINE
4.1.3 Einfluss der Uterusspülungen auf die bakterielle Kontamination der Gebärmutter
Die Methode zur schonenden Spülung des Uterus einer Stute wurde technisch vom Verfahren des Embryotransfers abgeleitet. Für die geplanten Versuche war es von besonderer Bedeutung, eine Beeinflussung der uterinen Leukozyteneinwanderung durch kontaminierende patho gene und unspezifische Keime auf ein Minimum zu beschränken, weshalb beim Katheterisieren der Gebärmutter unter antiseptischen Kautelen gearbeitet wurde. Gründe hierfür waren einerseits das Bemühen um eine Vermeidung einer entstehenden akuten Endometritis aufgrund vielfacher Manipulation am normalerweise sterilen Uterus und die damit verbundene eventuelle Beeinflussung des Trächtigkeitserfolges, als auch die Verfälschung des kontrollierten Leukozyteninflux in den Uterus, welcher durch definierte Stimuli erfolgen sollte.
Für die bakteriologischen Untersuchungen sind sofort im Anschluss an eine erfolgte Uterusspülung 2 ml von der gewonnenen Flüssigkeit mit Hilfe einer sterilen Spritze entnommen und bei -20°C aufbewahrt worden. Die Nullspülung erfolgte immer unmittelbar vor Applikation einer stimulierenden Substanz in den Uterus. Die 2. Spülung wurde jeweils 6 Stunden nach der Nullspülung durchgeführt. Die Spülungen 3 bis 5 fanden 12 bis 24 Stunden nach der vorherigen beim selben Tier statt.
Tab. 2: Bakteriologische Befunde der Uterusspülflüssigkeiten nach wiederholter Uterusspülung
Anzahl Spülungen
1) n 2) Befunde 3)
Nullspülung 71 2 x ggr. Enterokokken 4), 69 x bakteriologisch negativ 1. Spülung 71 1 x ggr. Enterokokken, 70 x bakteriologisch negativ 2. Spülung 29 2 x ggr. Enterokokken, 27 x bakteriologisch negativ
3. Spülung 8 8 x bakteriologisch negativ
4. Spülung 8 8 x bakteriologisch negativ
1) Bei allen Versuchsstuten ist eine Nullspülung (50 ml PBS; s. 3.2.4) zur Evaluierung der intrauterinen ze llulären Zusammensetzung und zum Ausschluss einer bakteriellen Kontamination der Gebärmutter durchgeführt worden. Die Spülungen 1-4 erfolgten 1, 3, 6, 24, 36 oder 48 Stunden nach Besamung bzw. rhIL-8-Infusion.
2) Untersucht wurden bis zu 71 klinisch gesunde Stuten zum Zeitpunkt der Rosse.
3) Die bakteriologische Untersuchung erfolgte unter Anwendung der direkten Keimanzüchtung und eines Anreicherungsverfahrens durch Nährmedien (s. 3.2.9)
4) Ein geringgradiger Gehalt an Enterokokken wird nach derzeitigem Kenntnisstand als „nicht uteruspathogen“
für die Stute angesehen.
Die Tabelle 2 zeigt, dass auch bei wiederholter Uterusspülung bei demselben Tier weder eine mittelgradige noch ein starke bakterielle Kontamination mit pathogenen oder unspezifischen Keimen nachweisbar war. Eine Beeinflussung der kontrollierten PMN-Anlockung durch Bakterien oder ihre Komponenten in den Uterus ist deshalb weitgehend auszuschließen.
4.1.4 Einfluss des histologischen Status des Endometriums auf den Leukozyteninflux
Nur diejenigen Zuchtstuten, welche hinsichtlich ihres Zyklusstandes, ihres pathohistologischen und mikrobiologischen Status, ihrer Güstzeit, der Anzahl der Abfohlungen u.a. eine Kategorisierung ihres Endometriums in die Kategorien I, IIa und IIa/b (s. 3.2.10 und Anhang 2) erfahren, wurden im Rahmen dieser Dissertation in die Versuche eingebunden. Die Einteilung in die unterschiedlichen Kategorien erfolgt einerseits unter Berücksichtigung der oben genannten Punkte hinsichtlich des Reproduktionsstadiums und andererseits anhand der Beurteilung des inflammatorischen bzw. histologischen Status des
Endometriums. Bei Stuten der Kategorien IIa und IIa/b erfolgte die Einteilung aufgrund degenerativer Schleimhautveränderungen (z.B. eine periglanduläre Fibrose). Dagegen wurden Stuten mit akuten entzündlichen Veränderungen in den Experimenten nicht berücksichtigt.
Unter Einbeziehung der Anamnese, der Klinik und der Mikrobiologie konnte eine klare Aussage hinsichtlich der vorhandenen Geschlechtsgesundheit jeder Zuchtstute ge macht werden. Die Endometriumsbiopsie wurde unter sterilen Kautelen mit Hilfe des Uterusbiopsiegerät nach ROBERTS (s. 3.1.1) vom Dach des corpus uteri entnommen, in Formalin (35 %) (s. 3.1.2) verbracht und zur Untersuchung eingeschickt.
Diese Einteilung der pathohistologischen Untersuchung (freundlicherweise durchgeführt von der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. H.-A. Schoon vom Institut der Veterinär-Pathologie der veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leibzig) eines Gebärmutterschleimhautbioptats erfolgt anhand eines international anerkannten Kategorisierungsschemas (s. Anhang 2) hinsichtlich der Fruchtbarkeitsaussichten, wobei der jeweilige Reproduktionsstatus berücksichtigt wird. Die Stuten, die eine unterschiedliche Klassifizierung erfahren haben, sollten auf mögliche Veränderungen ihres Leukozyteninflux in den Uterus nach gleicher Stimulation untersucht werden (s. Tab. 3).
Tab. 3: Einfluss des histologischen Zustandes des Endometriums (Kategorie I, IIa, IIa/b) auf den Leukozyteninflux in die Gebärmutter
Kategorie I Kategorie IIa Kategorie IIa/IIb
Dargestellt sind die drei unterschiedlichen Kategorien des Endometriumstatus, die Anzahl der Stuten, welche hiernach eingeteilt wurden, und der Mittelwert sowie der Standarderror of the mean (SEM) der gewonnenen Leukozyten in Mio/ml . Die Zellen sind mit 50 ml PBS mittels eines, vom Embryotransfer abgeleiteten Spülverfahrens aus Spülproben 6 Stunden nach Insemination, nach rhIL-8 Applikation und nach simulierter wiederholter IS (= IS 2) gewonnen worden.
Der Vergleich, der nach unterschiedlicher Stimulation (IS, intrauterine rhIL-8-Infusion) aus dem Blut in das Uteruslumen migrierten Leukozyten, bei Stuten mit unverändertem und ggr.
degenerativem Endometrium erbringt keine Unterschiede hinsichtlich der nach Uterusspülung gewonnenen Leukozytenzahlen (s. Tab. 3). Eine Beeinflussung der PMN-Rekrutierung in den Uterus nach IS oder rhIL-8-Infusion durch den histologischen Status des Endometriums kann unter den hier gewählten experimentellen Bedingungen nahezu ausgeschlossen werden.
4.2 Funktionelle Eigenschaften uteriner neutrophiler Granulozyten nach einmaliger und wiederholter Insemination
Es war zu prüfen, ob die PMN, die nach einmaliger oder wiederholter Insemination in das Uteruslumen gelockt wurden, Unterschiede hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften aufweisen. Zur funktionellen und phänotypischen Charakterisierung der in den Uterus eingewanderten PMN kam deren Phagozytosefähigkeit und die Expression funktionsassoziierter Oberflächenstrukturen zur Prüfung (s. 3.1.5). Hierzu wurden die Zellen mittels einmaliger IS von Frischsperma (Gruppe A) und simulierter wiederholter Besamung (Gruppe B) in den Uterus gelockt. Sechs Stunden nach der Applikation von rhIL-8 oder Frischsperma wurden uterine PMN durch Spülung gewonnen, separiert und funktionell charakterisiert.
Die funktionelle und phänotypische Beschreibung uteriner PMN wurde bei den Tieren aus dem Experiment I (vgl. 4.1.2.2) durchgeführt. Die Gruppen A und B umfassen zwischen 8 und 11 Versuchsstuten. Zum besseren Vergleich der Zellen unterschiedlicher Pferde wurden die Resultate der uterinen PMN jeweils als relative Ergebnisse an den zeitgleich untersuchten autologen Blut-PMN (=100 %) erfasst (Abb. 8 und 9).
4.2.1 Phagozytoseaktivität
Die 6 Stunden nach rhIL-8-Gabe oder nach Insemination durch Spülung gewonnenen PMN wiesen durchgehend eine geringere Phagozytosebeteiligung (= Prozentsatz Phagozytose-positiver PMN) und eine geringere Ingestionskapazität (= Fluoreszenzintensität der Phagozytose-positiven PMN) auf (s. Abb. 8). Die relative Phagozytosebeteiligung der uterinen PMN verglichen mit den zeitgleich gewonnenen und untersuchten autologen Blut-PMN (=100 %) lagen jeweils zwischen 70 % und 80 % (s. Abb. 8 I). Dieser Unterschied zwischen Blut- und Uterus-PMN war jeweils signifikant (p< 0,01; nicht graphisch dargestellt).
Dabei wurden sowohl zwischen den PMN der beiden Versuchsgruppen A und B sowie zwischen den durch rhIL-8 und durch Frischsamen rekrutierten uterinen PMN der Gruppe B keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Dies spiegelt sich auch bei der relativen Ingestionskapazität wieder. Im Vergleich zu den autologen Blut-PMN lag diese zu allen Versuchszeitpunkten bei etwa 30 % (s. Abb. 8 II). Der Unterschied war statistisch zu sichern (p< 0,05; nicht graphisch dargestellt).
25 50 75 100
Phagozytoseaktivität (%)
(n=11) (n=10) (n=10)
Gruppe A Gruppe B
I) Phagozytosebeteiligung
0 25 50 75 100
(n=9) (n=8) (n=10)
relative Ingestionskapazität (%)
Gruppe A Gruppe B
II) Ingestionskapazität
IS rhIL-8
Abb. 8: Einfluß von einfacher IS (Gruppe A) und simulierter wiederholter IS (Gruppe B) auf die Phagozytoseaktivität von uterinen PMN.
Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM der Phagozytose-positiven (relative Phagozytosebeteiligung; I) Uterus-PMN sowie der mittleren Fluoreszenzintensität (relative Ingestionskapazität; II) der Phagozytose-positiven PMN als prozentualer Anteil von den gleichzeitig untersuchten autologen Blut-PMN (= 100%) von Stuten. Die Werte der Uterus-PMN stellen jeweils die prozentuale Abweichung gegenüber diesen 100% dar.
Verglichen werden die durch Uterus-Spülung gewonnenen PMN 6 h nach einmaliger IS (Gruppe A, schwarze Säule) sowie 6 h nach rhIL-8-Applikation (weisse Säule) und 6 h nach simulierter wiederholter IS (Gruppe B, schwarze Säule).
Demnach lagen übereinstimmend bei allen hier untersuchten Stuten sowohl eine quantitative (Phagozytosebeteiligung) als auch eine qualitative (Ingestionsaktivität) Reduktion der Phagozytoseaktivität intrauteriner PMN gegenüber den autologen Blut-PMN vor. Dies galt sowohl bei Verwendung von Frischsamen (viel phagozytierbares Material) als auch von rhIL-8 (nahezu kein phagozytierbares Material) als Stimulus der PMN-Einwanderung in den equinen Uterus.
4.2.2 Expression funktionsassoziierter PMN-Oberflächenstrukturen
Sowohl aus autologem venösen Blut separierte (s. 3.2.1.3) als auch aus der Uterusspülflüssigkeit gewonnene PMN (s. 3.2.4) wurden auf ihre Expression funktionsassoziierter Oberflächenstrukturen (s. 3.2.7) untersucht und durchflusszytometrisch ausgewertet (s. 3.2.5). Zum Einsatz kamen die monoklonalen Antikörper CZ 3.1 (gegen equines CD11a), CZ 4 (gegen equine MHC-Klasse-I) und CZ 5.15 (gegen equines CD44).
Alle untersuchten Oberflächenstrukturen wurden jeweils annähernd von 100 % der Blut- und Uterus-PMN exprimiert. Die uterinen PMN beider Versuchsgruppen wiesen jedoch bei allen 3 Oberflächenstrukturen eine gegenüber den autologen Blut-PMN meist signifikant verringerte Expressionsdichte auf (s. Abb. 9).
Beim Vergleich der Expressionsdichten bei PMN, die nach einmaliger (Gruppe A, Abb. 9) oder simulierter IS (Gruppe B, s. Abb. 9), also 24 Stunden nach rhIL-8-Infusion, aus dem Uterus isoliert worden waren, konnten keine signifikanten Unterschiede gefunden werden.
Die relative Expressionsdichte lag bei MHC-Klasse-I in der Gruppe A bei etwa 65 % und in der Gruppe B bei etwa 45 % (s. Abb. 9 I), bei CD 11a jeweils bei etwa 60 % (s. Abb. 9 II) und bei CD 44 jeweils bei etwa 50 % (s. Abb. 9 III) der zeitgleich gewonnenen und bearbeiteten autologen Blut-PMN.
Dagegen wiesen die nach rhIL-8-Gabe (ohne Frischsamen) isolierten uterinen PMN teilweise signifikante (p<0,05; eqMHC-I und eqCD44) Expressionsunterschiede zu den nach Gabe von Frischsperma gewonnenen uterinen PMN auf. Die relative Expressionsdichte lag bei allen drei Membranstukturen unter der der autologen Blut-PMN, allerdings war MHC-Klasse-I bei
nach rhIL-8 rekrutierten uterinen PMN signifikant höher exprimiert als bei den 24 Stunden später nach IS isolierten PMN (p< 0,05; s. Abb. 9 I).
Bei CD44 waren die relativen Expressionsdichten der PMN nach rhIL-8-Gabe im Vergleich zu den nach IS isolierten PMN signifikant verringert (p<0,05; s. Abb. 9 III).
0 25 50 75 100
relative Floureszenzintensitäz (%)
I) EqMHC-Klasse-I (mAk Cz4)
Gruppe A Gruppe B
(n=9)
(n=10) (n=11)
*
0 25 50 75 100
relative Fluoreszenzintensitäzt(%)
II) EqCD11a (mAk CZ3.1)
Guppe A Gruppe B
(n=11)
(n=11)
(n=10)
0 25 50 75 100
IS rhIL-8
relative Floureszenzintensitäz (%)
III) EqCD44 (mAk CZ5.15)
(n=11)
(n=10)
(n=11)
Guppe A Gruppe B
*
*
Abb. 9: Relative Expressionsdichte der Oberflächenmoleküle MHC-Klasse-I, CD 11a und CD44 auf uterine n PMN nach einmaliger (Gruppe A) und simulierter wiederholter IS (Gruppe B)
Vergleichend dargestellt sind Mittelwerte und SEM der relativen Expressionsdichte der jeweiligen Oberflächenmoleküle (CD 44, CD 11A und MHC I, s. 3.1.8) von Blut- und Uterus-PMN von geschlechtsgesunden Stuten. Verglichen werden die durch Uterus-Spülung gewonnenen PMN 6 h nach einmaliger IS (Gruppe A) sowie 6 h nach rhIL-8-Applikation und 6 h nach simulierter wiederholter IS (Gruppe B). Nach Separation der Zellen wurde eine indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF, s. 3.2.7) durchgeführt.
Die Fluoreszenztintensität der Blut-PMN jedes Tieres wurde dabei als „100%-Wert“ festgelegt. Die Säule der Uterus-PMN stellt jeweils die prozentuale Fluoreszenzintensität gegenüber den Blut-PMN dar.
*, unterschiedlich mit p<0,05
In Übereinstimmung mit der signifikant reduzierten Phagozytoseleistung der Uterus-PMN gegenüber den autologen Blut-PMN (s. 4.2.1) waren auch drei Oberflächenmarker auf den uterinen PMN signifikant geringer exprimiert als auf autologen Blut-PMN. Im Gegensatz zur Phagozytose (s. 4.2.1) war der Einfluss von Frischsperma auf die Expressionsdichte dieser Oberflächenmarker deutlich bis signifikant unterschiedlich von dem des rhIL-8.
4. 3 Trächtigkeitsresultate
Die Besamungsfrequenz bei der Stute war und ist häufig Gegenstand von Diskussion und wissenschaftlichen Studien. Auf eine einheitliche Handhabung konnte sich bisher nicht verständigt werden. Es gibt unterschiedliche Erkenntnisse hinsichtlich resultierender Trächtigkeitsergebnisse nach Doppel- oder Mehrfachbesamung mit einem Inseminationsintervall von 24 Stunden oder weniger. Viele Autoren gehen bei wiederholter Insemination in einem 24-stündigen Intervall von einer reduzierten Trächtigkeitsrate aus, da die Spermien der Zweitbesamung mit einem inflammatorischen Milieu im Uterus konfrontiert werden. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zur Simulation einer wiederholten Insemination soll neben der Charakterisierung des uterinen PMN-Influx v.a. zur Untersuchung von Auswirkungen auf den Besamungserfolg eingesetzt werden. In diesen initialen Studien soll geprüft werden, ob bei IS 24 Stunden nach IL-8-Applikation der Besamungserfolg im Vergleich zur einmaligen IS differiert.
Mit Hilfe der rektalen Palpation und der rektalen Ultraschalluntersuchung des Uterus sind alle Stuten am Tag 16 post inseminationem auf eine mögliche Trächtigkeit untersucht worden. Bei nachgewiesener Trächtigkeit erfolgten zwei Kontrolluntersuchungen am 30. und 60. Tag der Trächtigkeit. Alle initial tragenden Stuten waren bei der letzten Trächtigkeitskontrolle noch tragend. Die Stuten des Experiments I trugen die Frucht aus, für die Stuten des Experiments II liegen noch keine Abfohlergebnisse vor. Auch hat noch keine der Stuten abortiert.
In Experiment I konnte in der Gruppe A (einmalige IS, Abb. 10) eine Trächtigkeitsrate von 91
% und in Experiment II in der Gruppe A eine Trächtigkeitsrate von 70 % erreicht werden. Mit 55 % (Experiment I) und 60 % (Experiment II) ähnelten sich die Trächtigkeitsergebnisse der Gruppe B (simulierte wiederholte IS, Abb. 10) und liegen damit geringfügig unter denen der Gruppe A.
Gruppe A
Abb. 10: Trächtigkeitsergebnisse an Tag 60 nach einmaliger IS und simulierter wiederholter IS
Dargestellt sind die Prozentzahlen der tragenden Stuten aus den Experimenten I und II nach einmaliger Insemination (Gruppe A) und simulierter wiederholter IS (Gruppe B; Stunde 0: rhIL-8, Stunde 24: Frischsamen).
Die Trächtigkeitsuntersuchung erfolgte durch rektale manuelle Palpation und Ultraschalluntersuchung am Tag 16, 30 und 60 post inseminationem.
Bei den Stuten der Gruppe B (simulierte wiederholte IS) zeigte sich eine in der Tendenz niedrigere Trächtigkeitsrate. Aufgrund der komplexen Faktoren, die den Besamungserfolg beeinflussen und der für entsprechende Fragestellungen zu geringen Gruppengrösse wurde auf eine statistische Analyse verzichtet.
4.4 In-vitro -Untersuchungen zur Modulation des uterine n PMN-Influx durch Kompo nenten des Inseminats
Die Ergebnisse der in- vivo-Versuche, insbesondere die starken Schwankungen des PMN-Influx nach einmaliger Insemination (IS) von Frischsperma in den beiden Versuchsabschnitten (s. 4.1.2.) warfen Fragen zu den entsprechenden Ursachen auf. In nachfolgenden Experimenten wurde ein in- vitro-Modell verwendet, um Auswirkungen potentieller chemoattraktiver Komponenten des Inseminats einer Frischsamenportion auf die PMN-Wanderung zu untersuchen. Hierzu gehören u. a. der Frischsamenverdünner, das Seminalplasma und die Spermien (s. 3.1.9). Die von FRANK (2000) für das bovine System etablierte 10-Well- Transmigrationsmethode (s. 3.2.8) bietet die Möglichkeit, die
Migrationsleistung von Zellen als Reaktion auf eine chemoattraktive Substanz qualitativ und quantitativ zu bewerten. Die Eignung der Transmigrationskammer zur Untersuchung des Wanderungsverhaltens equiner PMN wurde von ENGELKE (2000) nachgewiesen.
4.4.1 Frischsamenverdünner
Die einmalig mit Frischsamen besamten Stuten haben auf die Insemination individuell mit einem stark unterschiedlich PMN-Influx aus dem peripheren Blut in das Uteruslumen reagiert (s. 4.1). Besonders auffällig war jedoch die deutlich unterschiedliche PMN-Rekrutierung in den beiden Versuchsabschnitten (Experiment I und II) der Gruppe A trotz definierter Versuchsbedingungen. Zwar war der Magermilch-Eidotter-Verdünner immer anhand der gleichen Rezeptur hergestellt worden, doch wurden in Experiment I und II (s. 4.1.2.2) unterschiedliche Chargen des Verdünners verwendet. Die Chargen des Verdünners der in-vivo- Experimente standen für die in-vitro-Experimente nicht mehr zur Verfügung. Zur Abklärung des Verdünners als Ursache für die beobachtete unterschiedliche Höhe der uterinen PMN-Rekrutierung wurden 3 Verdünner-Chargen auf ihre chemoattraktive Kapazität für PMN aus dem Blut von 6 Stuten getestet. Der Verdünner wurde mit R0+-Medium verdünnt und in den Verdünnungsstufen 1:2, 1:10, 1:1.000, 1:5.000, 1:10.000 und 1:100.000 in R0+-Medium in die unteren Wells der Transmigationskammer pipettiert (s. 3.1.9). Als Negativkontrolle diente R0+-Medium (s. 3.1.3), als Positivkontrolle rhIL-8 in einer Konzentration von 25 ng/ml (ENGELKE, 2000).
Nach zweistündiger Inkubation der bestückten Transmigrationskammern bei 37°C und 5%
CO2 in Luft zeigte sich, dass alle drei Verdünner konzentrationsabhängig die Transmigration von PMN durch die Membran bewirkten (s. Abb. 11). Die Verdünnungsstufe 1:2 liegt mit durchschnittlich 57 % gewanderten PMN noch ca. 15 % unter dem Ergebnis der Verdünnungsstufe 1:10, welche ein Transmigrationsoptimum von 73 % aufweist. Damit liegt sie im Bereich der rhIL-8-Positivkontrolle (71 %). Konzentrationsabhängig fiel dann der prozentuale Anteil der gewanderten PMN ab. Mit weiterer Verdünnung des Verdünners fiel der prozentuale Anteil der gewanderten PMN langsam ab und erreichte erst bei einer
Verdünnung von 1:100.000 das Niveau der Negativkontrolle mit R0+-Medium (8 % transmigrierte PMN). Die Vitalität der migrierten PMN lag bei allen Ansätzen > 99 %.
0
Abb. 11: In-vitro -Migration equiner PMN stimuliert durch Frischsamenverdünner (FSV)
Untersucht wurde die Migration Percoll-gereinigter PMN (Reinheit >98% ) aus dem heparinisierten Blut 6 gesunder Stuten durch eine Polycarbonatmembran (Porengröße 3µm) in der Transmigrationskammer (s. 3.2.1.3) nach Stimulation mit dre i unterschiedlichen Chargen an Frischsamenverdünner. Es kamen Verdünnungsstufen von 1:2, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:5000 und 1:100.000 in R0+-Medium zum Einsatz. Eingesetzt wurden 2 x 106 Blut-PMN/200 µl RO+. Als Positivkontrolle diente rhIL-8 in einer Konzentration von 25 ng/ml, als Negativkontrolle diente das Verdünnungsmedium R0+ (s. 3.1.3). Die Kammern wurden 2 h bei 37°C und 5 % CO2 in Luft inkubiert. Die Auswertung der Zellzahlen erfolgte mittels Referenzzellmethode (s. 3.1.6) im Durchflusszytometer. Dargestellt sind die nach 2 h gewonnenen vitalen migrierten PMN als prozentualer Anteil an der insgesamt wiedergefundenen PMN-Anzahl.
Mit diesem Versuch konnte gezeigt werden, dass der eingesetzte Frischsamenverdünner eine starke chemoattraktive Substanz für die equinen PMN enthält. Die drei unterschiedlichen Verdünner-Chargen zeigten bei allen verwendeten Versuchsstuten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Transmigrationsaktivität der PMN. Allerdings konnte im Verlauf der Verdünnung jedes Frischsamenverdünners erst eine konzentrationsabhängige
signifikante Zunahme und, ab einer höheren Verdünnungsstufe als 1:10, eine signifikante Abnahme der migrierten PMN nachgewiesen werden (die signifikanten Unterschiede sind in der Abb. 11 nicht dargestellt). Mit diesem Experiment konnte belegt werden, dass unterschiedliche Verdünnerchargen für die beobachtete, stark unterschiedliche PMN-Rekrutierung in den beiden in-vivo-Teilexperimenten (s. 4.1.2.2) kaum in Frage kommen.
4.4.2 Spermien
Nachdem für den Verdünner eine starke chemoattraktive Wirkung für equine PMN nachgewiesen wurde (s. 4.4.1), sollten auch mögliche Effekte von Spermien auf das Migratio nverhalten von PMN geprüft werden. Dabei wurde auch die Vitalität der Spermien berücksichtigt. Um einerseits eine hohe Vitalität der Spermien gewährleisten zu können und andererseits ein Suspensionsmedium für die Spermien ohne eigene chemotaktische Wirkung zu nutzen, wurde auf eine 2%ige Glucoselösung in PBS (s. 3.1.2) als Trägermedium für die Spermien zurückgegriffen. Diese stellte auch die Negativkontrolle im folgenden Versuch dar.
Die Aufbereitung des Ejakulates umfasste die Abtrennung des Seminalplasmas (s. 3.1.9) und die Aufnahme des Spermienpellets im oben genannten Medium. Die resuspedierten Spermien wurden auf 400.000 Samenzellen/315 µl Medium eingestellt. Etwa 50 % der so präparierten Spermien wiesen eine gestörte Membranintegrität auf (PJ-positiv; s. 3.1.9). Die verbliebenen Spermien waren PJ-negativ und wurden deshalb als vital eingestuft.
Um eine Vergleichspopulation von Spermien mit stärkerer Membranschädigung zu produzieren, wurden Spermien desselben Ejakulates durch Schockgefrierung abgetötet (100
% PJ-positiv). Interleukin 8 (25 ng rhIL-8/ml PBS mit 2 % Glucose) diente als Positivkontrolle in der Transmigrationskammer. Es wurden aus dem Blut gewonnene PMN (Reinheit > 98%) von 3 gesunden Stuten eingesetzt.
Sowohl die Präparationen mit 50 % PJ-positiven Spermien als auch jene mit den abgetöteten Spermien (100 % PJ-positiv) wirkten direkt chemoattraktiv für equine PMN (s. Abb. 12). Die PMN-Wanderungsrate lag im Falle geringer Membranschädigung im Durchschnitt bei 34,5 % der eingesetzten PMN, während bei 100 % PJ-positiven Spermien mit 64,2 % annähernd doppelt so viele PMN transmigrierten (s. Abb.12). Diese Präparation wies damit eine ähnliche
chemoattraktive Potenz wie die Positivkontrolle auf (rhIL-8: 70 % Transmigration). Die als Negativkontrolle eingesetzte 2%ige Glucoselösung konnte keine Chemotaxis bei equinen PMN auslösen.
0 25 50 75 100
% migrierte PMN
Glucose 50 % 100 % PJ-positiv rhIL-8
(n=1)
(n=3)
(n=3)
(n=1)
**
Abb. 12: Einfluss des Grades der Membranschädigung von Hengstspermien auf die Transmigration equiner PMN
Über 98% reine neutrophile Granulozyten aus dem Blut von 3 gesunden Stuten wurden in einer Konzentration von 2 x 106 PMN/200µlR0+-Medium in die oberen Kompartimente der Transmigrationskammer eingesetzt (s.
3.1.9). Der chemotaktische Stimulus in den unteren Kompartimenten bestand aus 2%iger Glucose-Lösung (Negativkontrolle), rhIL-8 (25 ng/ml 2%ige Glucoselösung, Positivkontrolle) und Spermien (4 x 105 in 315 µl 2%iger Glucose-Lösung; s. 3.1.9). Nach 2 h Migrationszeit (Inkubation bei 37°C, 5 % CO2) wurden die Zahlen vitaler migrierter und vitaler nicht-migrierter PMN durchflusszytometrisch quantifiziert und der Anteil migrierter an der Gesamtzahl vitaler Zellen berechnet (Migrationsrate). Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der Migrationsraten.
**, unterschiedlich mit p<0,01
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen belegen, dass Spermien mit steigender Membranschädigung in vitro eine direkte, signifikante chemoattraktive Potenz für neutrophile Granulozyten haben. In einem Folgeexperiment sollte deshalb untersucht werden, ob membrangeschädigte equine Spermien (s. 3.1.9) chemoattraktive Substanzen in die Umgebung abgeben. Dazu wurde nach Entfernung des Seminalplasmas durch einmalige
Zentrifugation (300 x g) das verbliebene Spermienpellet in PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde anschließend 3 mal wiederholt und die jeweils erhaltenen Waschüberstände (1-4) in die unteren Kompartimente der Transmigrationskammer pipettiert. Schon nach der ersten Zentrifugation waren annähernd 100 % der Spermien membrangeschädigt (PJ-positiv). In den oberen Kompartimenten wurden 2 x 106 PercollR -separierte PMN/200 µl RO+-Medium von 3 Stuten eingesetzt. Als Negativkontrolle diente PBS, als Positivkontrolle rhIL-8 (25ng/ml). Die Resultate sind in Abb. 13 dargestellt.
Nach zweistündiger Inkubation konnten aus den unteren Kompartimenten unterschiedliche Mengen transmigrierter PMN gewonnen werden: Überstand 1 erreichte mit 58 % transmigrierten PMN einen Wert, der sich dem des rhIL-8 als Positivkontrolle (70 %) annäherte. Überstand 2 zeigte mit einem Wert von 23 % gewanderten PMN noch eine beachtliche chemotaktische Wirkung, während die Waschüberstände der 3. und 4. Waschung mit 6 bzw. 4,7 % dem Wert der Negativkontrolle (3 %) entsprachen.
0
Abb.13: Die in-vitro -Transmigration equiner PMN wird durch Waschüberstände membrangeschädigter Spermien stimuliert
PercollR-separierte equine Blut-PMN (s. 3.2.1.3) von 3 gesunden Stuten wurden in einer Konzentration von 2 x 106 vitalen Zellen/200µl RO+-Medium in der oberen Abteilung der Transmigrationskammer eingesetzt (s. 3.1.9).
In den unteren Vertiefungen der Kammer kamen die, durch 4 konsekutive Waschungen der Spermien mit PBS, gewonnenen zellfreien Überstände 1-4, das rhIL-8 (Positivkontrolle) sowie PBS (Negativkontrolle) zum Einsatz.
Die Transmigrationskammer wurde für 2 h bei 37°C und 5 % CO2 in Luft inkubiert. Dargestellt sind die PJ-negativen PMN als prozentualer Anteil an den wiedergefundenen PMN nach Auswertung mittels Referenzzellmethode (s. 3.1.6) im Durchflußzytometer als Mittelwert und SEM. Untersucht wurden die PMN dreier Stuten. *, unterschiedlich mit p<0,05; **, unterschiedlich mit p<0,01
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die zellfreien Zentrifugationsüberstände gewaschener Spermien eine signifikante chemotaktische Wirkung auf equine PMN hatten. Da nach der
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die zellfreien Zentrifugationsüberstände gewaschener Spermien eine signifikante chemotaktische Wirkung auf equine PMN hatten. Da nach der