der Klinik für Geburtshilfe und Gynäkologie des Rindes der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Aufbau eines analytischen Endometritismodells
bei der Stute
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades eines
D O C T O R M E D I C I NA E V E T E R I N A R I A E durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Fabian Walter Engelke
aus Hannover
Hannover 2000
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. W. Leibold Univ.-Prof. Dr. med. vet. E. Klug 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. J. Pohlenz
Tag der mündlichen Prüfung: 05.12.2000
Gefördert durch ein Graduiertenstipendium der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Abkürzungen und Termini technici 8
1 Einleitung 11
2 Literaturübersicht 12
2.1 Endometritis der Stute 12
2.2 Schutzmechanismen des Uterus gegen Infektionen 14
2.2.1 Drainage 14
2.2.2 Immunglobuline 15
2.2.3 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten 16
2.3 Endometritismodelle 16
2.3.1 Endometritismodelle bei der Stute 16
2.3.2 Endometritismodelle anderer Tierarten 17
2.4 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten 18
2.4.1 Phänotypische Eigenschaften von neutrophilen Granulozyten 19
2.4.2 Extravasation und Migration 20
2.4.3 In-vitro-Migrationsuntersuchungen 22
2.4.3.1 Under-Agarose-Assay 22
2.4.3.2 Boyden-Kammer 22
2.4.3.3 Auf equine neutrophile Granulozyten wirksame Chemotaktika 23 2.4.3.4 Hemmung der Migration equiner neutrophiler Granulozyten 24
2.4.3.5 Interleukin 8 24
2.4.4 Phagozytose 26
2.4.5 Die In-vitro-Beurteilung der Phagozytoseaktivität 27
2.4.6 Bildung reaktiver Sauerstoffspezies 28
2.4.7 Die In-vitro-Beurteilung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies 29 2.5 Die Rolle der neutrophilen Granulozyten bei der
Infektionsabwehr im equinen Uterus 29
3 Material und Methoden 32
3.1 Geräte und Materialien 32
3.1.1 Geräte, Klinik- und Laborbedarf 32
3.1.2 Medikamente, Reagenzien und andere Materialen 34
3.1.3 Lösungen, Medien und Puffer 36
3.1.4 Induktor der Leukozyteneinwanderung in den Uterus 37 3.1.5 Materialien für die Separation und Differenzierung von Leukozyten 37
3.1.6 Materialien für die Durchflusszytometrie 38
3.1.7 Materialien für die indirekte Membranimmunfluoreszenz 39 3.1.8 Materialien für die Bestimmung der Phagozytoseaktivität 41 3.1.9 Materialien für die Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies 41
3.1.10 Materialien für den Transmigrationstest 42
3.1.11 Tiere 44
3.2.3 Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung 45
3.2.4 Leukozytendifferenzierung 47
3.2.5 Isolierung von Leukozyten aus dem Blut 47
3.2.5.1 Eliminierung der Erythrozyten durch hypotone Lyse 47
3.2.5.2 Percoll®-Separation 48
3.2.6 Gewinnung und Isolierung uteriner Leukozyten 48
3.2.7 Durchflusszytometrie 49
3.2.8 Indirekte Membranimmunfluoreszenz 53
3.2.9 Untersuchungsverfahren zur Bestimmung der Phagozytosekapazität
neutrophiler Granulozyten 55
3.2.10 Untersuchungsverfahren zur Bestimmung der Bildung reaktiver
Sauerstoffspezies durch neutrophile Granulozyten 57
3.2.11 Transmigrationstest 58
3.2.12 Bakteriologische Untersuchung von Uterusspülproben 60 3.2.13 Histologische Untersuchung von Endometriumgewebe 61
3.2.14 Statistische Auswertung 62
4 Ergebnisse 63
4.1 Methodische Vorarbeiten 63
4.1.1 Isolierung equiner neutrophiler Granulozyten aus dem Blut 63 4.1.2 Modulation von Oberflächenstrukturen equiner neutrophiler Granulozyten 65 4.1.3 Modifikation einer Methode zur Untersuchung der Bildung
reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) durch neutrophile Granulozyten 68 4.1.4 Methode zur Untersuchung der in-vitro-Transmigration equiner
neutrophiler Granulozyten 71
4.1.4.1 Stimulation der in-vitro-Transmigration durch hefeaktiviertes Serum 71 4.1.4.2 Stimulation der in-vitro-Transmigration durch Leukotrien B4 73 4.1.4.3 Stimulation der in-vitro-Transmigration durch rekombinantes
humanes Interleukin 8 75
4.1.4.4 Kulturmedium für die in-vitro-Transmigration 78
4.1.4.5 Migrationszeit 80
4.1.4.6 Technik zur Bestimmung der Transmigrationsrate equiner PMN 81 4.2 Entwicklung eines Endometritismodells bei der Stute 84 4.2.1 Eignungsprüfung von rekombinantem humanen Interleukin 8 84 4.2.2 Einfluss von rhIL-8-Konzentration und Einwirkzeit auf den intrauterinen
Leukozytengehalt 86
4.2.3 Einfluss der Uterusspülung auf die Ergebnisse der bakteriologischen und histologischen Untersuchung der Gebärmutter 88 4.2.4 Systematischer Gesamtablauf der Untersuchungen 91 4.3 Vergleichende Charakterisierung von neutrophilen Granulozyten
aus Blut und Uterus mit Hilfe des Endometritismodells 92 4.3.1 Morphologie von neutrophilen Granulozyten aus Blut und Uterus 92 4.3.2 Phänotypische Eigenschaften von neutrophilen Granulozyten
aus Blut und Uterus 93
Transmigration auf phänotypische und funktionelle Eigenschaften
equiner neutrophiler Granulozyten 99
4.4.1 Einfluss von rhIL-8 auf immunphänotypische Charakteristika equiner
neutrophiler Granulozyten in vitro 99
4.4.2 Einfluss von rhIL-8 auf funktionelle Eigenschaften equiner
neutrophiler Granulozyten in vitro 103
4.4.3 Einfluss der in-vitro-Transmigration auf immunphänotypische Eigenschaften
equiner neutrophiler Granulozyten 106
4.4.4 Einfluss der in-vitro-Transmigration auf funktionelle Eigenschaften equiner
neutrophiler Granulozyten 108
4.5 Anwendung des Endometritismodells zur Isolierung und Charakterisierung uteriner neutrophiler Granulozyten bei
Stuten mit degenerativen Veränderungen des Endometriums 110 4.5.1 Einfluss von rhIL-8-Konzentration und Einwirkzeit auf den intrauterinen
Leukozytengehalt endometriumveränderter Stuten 111 4.5.2 Einfluss degenerativer Veränderungen des Endometriums auf
immunphänotypische Eigenschaften uteriner PMN 113 4.5.3 Einfluss degenerativer Veränderungen des Endometriums auf funktionelle
Eigenschaften uteriner PMN 115
5 Diskussion 119
5.1 Konzeptionelle Überlegungen zu Untersuchungen von neutrophilen
Granulozyten im Zusammenhang mit der Endometritis des Pferdes 119 5.2 Teilschritte zur Etablierung eines Endometritismodells 120 5.2.1 Einsatz eines in-vitro-Systems zur Untersuchung des
Migrationsverhaltens equiner neutrophiler Granulozyten 120 5.2.2 Induktion eines reproduzierbaren Leukozyteneinstroms in
den endometriumgesunden Uterus von Stuten 122
5.2.3 Vergleichende Untersuchung von neutrophilen Granulozyten
aus Blut und Uterus endometriumgesunder Stuten 125 5.2.3.1 Phänotypische Charakterisierung von neutrophilen Granulozyten
aus Blut und Uterus 126
5.2.3.2 Funktionelle Eigenschaften neutrophiler Granulozyten aus Blut und Uterus 128 5.3 Auswirkungen degenerativer endometrialer Veränderungen auf
uterine neutrophile Granulozyten 130
5.4 Mögliche Nutzung des Endometritismodells für das Pferd 132
6 Zusammenfassung 134
7 Summary 136
8 Literaturverzeichnis 138
9 Anhang 155
a.a. amino acids (Aminosäuren)
Abb. Abbildung
BSA bovines Serumalbumin
C3a und C5a aktivierte Fragmente der Komplementkomponenten C3 und C5
CD cluster of differentiation (Bezeichnung zellulärer Differenzierungsantigene COPD chronic obstructive pulmonary disease (Chronisch obstruktive
Lungenerkrankung)
CR complement receptor (Komplementrezeptor) CV coefficient of variation (Variationskoeffizient)
CZ3.1, 3.2, 4, 5.15, 11 Bezeichnung monoklonaler Antikörper mit Spezifitäten gegen equine Zellen dest. destillata (einfach destilliert)
DHR 123 Dihydrorhodamin 123
DMSO Dimethylsulfoxid
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA enzyme linked immunosorbent assay (Enzym-gekoppelter Immunadsorbtionstest)
FACScan fluorescence activated cell scanner (Fluoreszenz-aktiviertes Zellanalysegerät)
Fc fragment cristalline (kristallisierbares Antikörperfragment) FCS fetal calf serum (fetales Kälberserum)
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FL-1, -2, -3 Fluoreszenz (1 = grün, 2 = orange, 3 = rot) fMLP Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht) g Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sec²)
G-CSF granulocyte colony stimulating factor (Granulozyten Wachstumsfaktoren) GCP granulocyte chemotactic protein (Synonym für Interleukin 8)
ggr. geringgradig
GL Gebrauchslösung
GM-CSF granulocyte macrophge colony stimulating factor (Granulozyten- Makrophagen-Wachstumsfaktoren)
h Stunde/Stunden
HAS Hefe-aktiviertes Serum
HEPES Hydroxyl-Piperazin-Ethan-Sulfonsäure
hgr. hochgradig
ICAM intercellular adhesion molecule (Interzelluläres Adhäsionsmolekül)
inakt. inaktiviert
IU international units
Ig Immunglobulin(e)
IL-8 Interleukin 8
LAI leukocyte adhesion inhibitor (Synonym für Interleukin 8)
LPS Lipopolysaccharide
LTB4 Leukotrien B4
mgr. mittelgradig
MDNCF monocyte derived neutrophil chemotactic factor (Synonym für Interleukin 8) MHC major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
MNZ mononukleäre Zellen
MIF Membranimmunfluoreszenz
min Minute
MONAP monocyte derived neutrophil activating peptide (Synonym für Interleukin 8)
MW Mittelwert
NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
NAF neutrophil activating factor (Synonym für Interleukin 8)
NAP-1 neutrophil attracting/activating factor 1 (Synonym für Interleukin 8) PAF Plättchen aktivierender Faktor
PBS phosphat buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung) PGF, PGE Prostaglandin F und E
PJ Propidiumjodid
PMA Phorbol-Myristat-Acetat
PMN polymorphkernige neutrophile Granulozyten rhIL-8 rekombinantes humanes Interleukin 8
ROS reactive oxygen species (reaktive Sauerstoffspezies)
R0+/- Zellkulturmedium RPMI 1640 mit HEPES-Puffer, L-Glutamin, NaHCO3, mit/ohne Antibiotika
R3F+/- Zellkulturmedium RPMI 1640 mit HEPES-Puffer, L-Glutamin, NaHCO3, 3% FCS, mit/ohne Antibiotika
Sc. Streptococcus
SD standard deviation (Standardabweichung) Sheath fluid Trägermedium für die Durchflusszytometrie SSC side scatter (Seitwärtsstreulicht)
Tab. Tabelle
TNF-α Tumor Nekrose Faktor α
tridest. tridestillata (dreifachdestilliert)
v/v Volumen pro Volumen
Well Vertiefung in einer Mikrotiterplatte oder einer Transmigrationskammer ZAS Zymosan-aktiviertes Serum
72.87 u. 25.32 Bezeichnung für Hybridomzellklone und die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper
HUGHES und LOY (1969) beobachteten in Stutenpopulationen Individuen die nach mikrobieller uteriner Exponierung nicht erkrankten (resistente Stuten) und solche, die eine erhöhte Krankheitsanfälligkeit (empfängliche Stuten) aufwiesen. Dies war der Ausgangspunkt dafür, dass sich die klinische Forschung alsbald mit den physischen, humoralen und zellulären Abwehrprinzipien im Zusammenhang mit der Endometritisbehandlung befasste.
Unter den uterinen Abwehrmechanismen spielt die mikrobizide Aktivität durch polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) eine wichtige Rolle. Nach jeder Kontamination des Endometriums setzt die Migration zirkulierender PMN in das Endometrium und in das Uteruslumen sehr rasch ein.
Der Gedanke, dass eine Fehlfunktion von PMN an der Pathogenese der persistierenden Endometritis beteiligt sein könnte, wurde deshalb schon vor geraumer Zeit in die wissenschaftliche Diskussion eingebracht. Genaue Kenntnisse über Qualität und Quantität der in den Uterus gewanderten PMN sowie Regulationsmöglichkeiten des Migrationsprozesses könnten von großer Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese und für die Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte der equinen Endometritis sein.
Da die Vielzahl von Einflussfaktoren die Charakterisierung funktioneller und immunphänotypischer Eigenschaften neutrophiler Granulozyten an der erkrankten Stute stört oder ausschließt, soll im ersten Teil der Arbeit ein Endometritismodell erarbeitet werden. Im Gegensatz zu bisherigen diesbezüglichen Bemühungen, bei denen zur Induktion der PMN- Immigration in das Uteruslumen unphysiologische Substanzen eingesetzt wurden, deren Wirkungsweise im Organismus und deren direkte Effekte auf PMN meist unerforscht blieben, ist das Ziel, mit Hilfe eines physiologischen Entzündungsmediators die PMN unter standardisierten und reproduzierbaren Bedingungen in den Stutenuterus zu locken, zu isolieren und zu charakterisieren.
Mit den damit gewonnenen Erkenntnissen zum Immunphänotyp und zur Funktionalität von PMN bei Stuten mit unverändertem Endometrium, soll im zweiten Teil der Arbeit mit Hilfe des etablierten Endometritismodells geklärt werden, ob es bei Stuten mit histologisch verändertem Endometrium zu Veränderungen beim PMN-Influx und zu Störungen der funktionellen Kapazität der uterinen Neutrophilen kommt.
2 Literaturübersicht 2.1 Endometritis der Stute
Die Reproduktionsrate bei Pferden ist im Vergleich zu anderen Haustierspezies als relativ gering einzustufen. Die jährliche Abfohlrate beträgt im Mittel 50 bis 60% (GINTHER 1992).
Die Kontamination des Uterus mit infektiösen Mikroorganismen nach dem Belegen (Paarung oder Besamung) oder dem Abfohlen kann eine Entzündung des Endometriums zur Folge haben, was Störungen des uterinen Milieus mit sich bringt und die Fertilität beeinträchtigt.
Ein kurzzeitiger, vorübergehender entzündlicher Prozess am Endometrium im Anschluss an eine Besamung wird als physiologisch angesehen. Es ist eine Reaktion des Organismus auf unterschiedliche Kontaminanten, wie das Hengstsperma, Bestandteile des verwendeten Verdünners oder auch auf in das Uteruslumen eingebrachte Bakterien (KOTILAINEN et al.
1994, TROEDSSON et al. 1995).
Persistierende Endometritiden stellen einen Hauptgrund verminderter Fertilität bei Zuchtstuten dar. Darüber hinaus werden sie neben Koliken und Störungen des Respirationsapparates als eines der wichtigsten Probleme in der Pferdepraxis eingestuft (DOIG et al. 1981, TRAUB-DARGATZ et al. 1991). Grundsätzlich ist der Uterus physikalisch durch anatomische Barrieren gegenüber einer Kontamination abgeschirmt. Dazu gehören die Vulva, das Vestibulum, die Vagina und die Zervix. Jede Schädigung dieser Barrieren prädisponiert die Stute zur Ausbildung einer chronischen Endometritis (COLLINS 1964, PASCOE 1979). Die Belegung stellt eine der wichtigsten Ursachen für eine Kontamination des Uterus dar. In einer neueren Studie wurde beobachtet, dass in einer repräsentativen Gruppe von Vollblut-Stuten etwa 15% der Tiere im Anschluss an die Belegung eine persistierende Endometritis entwickelt haben (ZENT und TROEDSSON 1998).
Bereits 1969 haben HUGHES und LOY eine natürliche Resistenz gegenüber einer künstlich erzeugten bakteriellen Infektion bei jungen Stuten postuliert. Eine andere Untersuchung brachte hervor, dass nach intrauteriner Verabreichung einer Streptococcus (Sc.) zooepidemicus- oder Pseudomonaden-Suspension häufiger multipare und güste Stuten eine
anhaltende Entzündung ausbildeten als Maidenstuten (PETERSON et al. 1969). Auf diesen Ergebnissen basierend hat man Stuten nach ihrer Fähigkeit, eine bakterielle Infektion zu eliminieren, in empfänglich und resistent gegenüber einer persistierenden oder chronischen Endometritis eingeordnet. Stuten, die zu einer anhaltenden Entzündung neigen, sind in der Mehrzahl älter, haben vorberichtlich wiederholt nach Belegung nicht konzepiert und/oder zeigen klinische Symptome einer Endometritis.
Eine Endometritis kann ernste Folgen für die Fertilität der betroffenen Stute haben. Häufig führt eine anhaltende Entzündung resultierend aus einem Anstieg der Prostaglandin (PG) F2α- Konzentration im Blut zu einer vorzeitigen Luteolyse und gegebenenfalls zu einem Abort (NEELY et al. 1979). Das Andauern einer Entzündung kann auch aufgrund persistierender embryotoxischer Substanzen zum Ausbleiben einer Trächtigkeit führen (ASBURY und LYLE 1992).
Meist gehören empfängliche Tiere gemessen am histologischen Endometriumbefund der Kategorie IIb oder III an (KENNEY und DOIG 1986, SCHOON et al. 1992). Diese Kategorisierung anhand einer Endometriumbiopsie schließt sowohl entzündliche als auch degenerative Veränderungen des Endometriums sowie den Reproduktionsstatus des Tieres ein. Degenerative Alterationen des Stutenendometriums werden unter dem Begriff
„Endometrose“ zusammengefasst (KENNEY 1992). In Tabelle 1 ist das Kategorisierungsschema zur Einteilung von histologischen Endometriumsbefunden wiedergegeben.
Tab. 1: Kategorisierungsschema und zu erwartende Abfohlrate in Abhängigkeit histologischer Endometriumbefunde und des Reproduktionsstatus * Histopathologische Befunde und Reproduktionsdaten Kategorie Erwartete
Abfohlrate normales Endometrium
ODER ggr. vereinzelte Fibrosierungs- und Entzündungsherde I 80-90%
ggr. bis mgr. diffuse Infiltrate** im Stratum compactum, zahlreiche disseminierte Herde im Stratum compactum und spongiosum
ODER ggr. bis mgr. disseminierte periglanduläre Fibrose und fibrotische Nester (1-3-Schichten, <2 Herde/5 mm)
ODER ggr. Lymphlakunen
ODER partielle Atrophie in der späten physiologischen Decksaison
IIa 50-80%
Kombination von zwei oder mehr Befunden aus IIa
ODER Befunde aus IIa bei Stuten, die mehr als 2 Jahre güst waren ODER mgr. diffuse oder hgr. fokale Infiltrate**
ODER mgr. gleichmäßig verteilte periglanduläre Fibrose und fibrotische Nester (5-10 Schichten, 2-4 Herde/5 mm)
ODER mgr. Lymphlakunen
IIb 10-50%
Kombination von zwei oder mehr Befunden aus IIb ODER hgr. diffuse Infiltrate**
ODER hgr. gleichmäßig verteilte periglanduläre Fibrose und fibrotische Nester (>10 Schichten, >4 Herde/5 mm)
ODER hgr. Lymphlakunen (rektal palpierbar) Atrophie während der physiologischen Decksaison
III 10%
* nach KENNEY und DOIG (1986), modifiziert nach SCHOON et al. (1992)
** Infiltrationen mit Entzündungszellen
2.2 Schutzmechanismen des Uterus gegen Infektionen
2.2.1 Drainage
Ein entscheidender Mechanismus bei der Elimination von Bakterien und Entzündungsprodukten aus dem Uterus ist die physikalische Reinigung. So wird Flüssigkeitsansammlung im Uterus im Anschluss an eine Infektion als einer der Hauptgründe für eine Empfänglichkeit angesehen (ALLEN und PYCOCK 1988, LeBLANC et al. 1989).
Bei Stuten mit einer persistierenden Endometritis ist nach Infektion eine verminderte myometriale Aktivität beobachtet worden, die zur Retention von Flüssigkeit im Uteruslumen
führte (NIKOLAKOPOULOS und WATSON 1997). In experimentellen Studien zeigten jüngere Tiere eine durchschnittlich bessere Elimination von intrauterin applizierten Kohle- und anderen Mikropartikeln (EVANS et al. 1986) oder auch von Radiokolloiden (LeBLANC et al. 1994) als zum Vergleich untersuchte ältere Stuten. In der letztgenannten Untersuchung waren neben den meisten resistenten Tieren während des Diöstrus aber auch einige Maidenstuten nicht in der Lage, den Uterus von den infundierten Radiokolloiden zu befreien.
Darüber hinaus wurde von einer verringerten Fähigkeit des lymphatischen Ableitens von Fremdstoffen aus dem Uterus von als empfänglich eingestuften Stuten berichtet (LeBLANC 1995). NIKOLAKOPOULOS und WATSON (1999) schlossen aus ihren Beobachtungen, dass eine funktionierende Kontraktilität der Gebärmuttermuskulatur zwar für eine Flüssigkeitsableitung aus dem Uterus von Bedeutung ist, allerdings keine Vorraussetzung für die Elimination von kontaminierenden Bakterien bildet.
2.2.2 Immunglobuline
Verschiedene an der Eliminierung einer bakteriellen Infektion beteiligte Faktoren wurden auch in Bezug auf die Endometritis der Stute untersucht. Aus dem Uterus konnten verschiedene Klassen von Immunglobulinen isoliert werden, so etwa IgGa, IgGb, IgGc, IgGT, IgA und IgM (MITCHELL et al. 1982, WIDDERS et al. 1985b). WIDDERS et al. (1985b) konnten zeigen, dass der Übergang von Immunglobulinen aus dem Blut in das Uteruslumen von untergeordneter Bedeutung ist und die Produktion von IgG und IgA vornehmlich im Endometrium selbst stattfindet. Eine Antikörper-vermittelte Abwehr ist gewiss von großer Bedeutung bei der Infektionsabwehr im Uterus, aber ausgehend von den Beobachtungen, dass im Uterussekret empfänglicher Stuten ähnliche oder höhere Immunglobulinkonzentrationen nachgewiesen wurden als im Vergleich zu resistenten Stuten, wird eine ungenügende Antikörper-vermittelte Abwehr im Endometrium als Ursache für eine Empfänglichkeit zur Ausbildung einer persistierenden Endometritis weitgehend ausgeschlossen (ASBURY et al.
1980, TROEDSSON et al. 1993a).
2.2.3 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
Der Influx von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) in das Gewebe ist kennzeichnend für eine akute Entzündungsreaktion. PMN sind neben Makrophagen als erste Leukozyten am Ort der Entzündung anzutreffen (LEHRER 1988). Bei Stuten erscheinen bereits eine Stunde im Anschluss an eine Belegung (KOTILAINEN et al. 1994, KATILA 1995) oder an eine experimentelle Infektion (WATSON et al. 1987b) die ersten PMN im Uteruslumen. Die meisten PMN konnten in einem Zeitraum zwischen 6 und 12 Stunden nach einer initialen Infektion gefunden werden. Allerdings differierte dabei die absolute Anzahl der PMN zwischen den empfänglichen und den resistenten Tieren nicht. Bei den empfänglichen Tieren bleibt jedoch die Anzahl der PMN für eine längere Zeit auf konstant höherem Niveau (LIU et al. 1986, WILLIAMSON et al. 1987), was darauf zurückgeführt wurde, dass die Rekrutierung neuer PMN in den Uterus bei anhaltender Infektion nachhaltig gefördert wird.
Bei gesunden Tieren fällt nach einem intrauterinen Initialreiz die anfänglich hohe Zellzahl langsam ab, bis nach etwa 48 Stunden fast keine PMN mehr im Uterus nachzuweisen sind (KATILA 1995). Aufgrund des massiven PMN-Influxes nach einer Infektion und der unter optimalen Bedingungen rasch ablaufenden Infektionsabwehr im Stuten-Uterus sind zahlreiche Untersuchungen bezüglich der Kompetenz uteriner PMN vorgenommen worden, auf die im Folgenden eingegangen werden soll.
2.3 Endometritismodelle
2.3.1 Endometritismodelle bei der Stute
Der Gedanke, dass eine Fehlfunktion von neutrophilen Granulozyten an der Pathogenese der persistierenden Endometritis beteiligt sein kann, wurde früh aufgenommen und wiederholt in modellhaften Untersuchungen bearbeitet. Prinzipiell geht es bei Endometritismodellen um das Setzen eines Entzündungsreizes im Uterus, in dessen Folge PMN zur Immigration in das Lumen bewegt werden, aus dem sie per Spülung gewonnen und einer in-vitro- Charakterisierung unterzogen werden können. Zunächst wurde vielfach eine Suspension eines
Sc. zooepidemicus-Feldstammes Versuchstieren intrauterin appliziert (CHEUNG et al. 1985, LIU et al. 1985 und 1986, WATSON et al. 1987b), was den Vorteil bot, gleichzeitig die Elimination des Keimes aus dem Uterus verfolgen zu können. Die in-vitro-Untersuchungen der PMN führten zu sehr widersprüchlichen Ergebnissen, was verständlich erscheint, da Zellen untersucht wurden, die bereits einem längerfristigen Kontakt mit der zu eliminierenden Noxe ausgesetzt waren. Dieser Überlegung Rechnung tragend, kam es zum Einsatz eines zellfreien Filtrats einer Sc. zooepidemicus-Suspension (ASBURY und HANSEN 1987).
WATSON et al. (1987b) und TROEDSSON et al. (1990) verwendeten 0,1, 1 oder 10%iges Austernglykogen als Stimulus, um PMN in den Uterus zu locken. Die beiden letztgenannten Ansätze sollten PMN liefern, die nicht durch vorausgegangene Abwehrarbeit, wie z.B.
Phagozytose, in ihrer Funktionalität beeinträchtigt wurden. Die Wirkungsweise dieser – unphysiologischen - Substanzen im Uterus bleibt dabei unklar. Daher ist auch die Charakterisierung der damit gewonnenen Zellen kritisch zu beurteilen. Die Autoren machen keine Aussagen über mögliche direkte Effekte der eingesetzten Stimuli auf PMN, die die gewonnenen Ergebnisse möglicherweise relativieren würden. Auch wenn im Stutenuterus mit Leukotrien B4 (LTB4) und PGE potentielle spezifische Chemoattraktanzien identifiziert wurden (WATSON et al. 1987a und 1987b, PYCOCK und ALLEN 1990), ist der Ansatz, einen körpereigenen chemotaktischen Lockstoff im Endometritismodell einzusetzen, nicht verfolgt worden.
2.3.2 Endometritismodelle anderer Tierarten
Auch beim Rind besteht der Verdacht, dass Dysfunktionen neutrophiler Granulozyten ursächlich am Krankheitsgeschehen der Endometritis puerperalis beteiligt sind. Um einen PMN-Influx in das Uteruslumen zu induzieren, wurde häufig auf Austernglykogen zurückgegriffen (FRANK et al. 1983, ANDERSON et al. 1984, SUBANDRIO und NOAKES 1992). Darüber hinaus kamen auch Bakteriensuspensionen aus Campylobacter-Isolaten, Suspensionen mit Bakterien-Lipopolysacchariden (LPS; KLUCINSKI et al. 1990) und Suspensionen inaktivierter Erreger zum Einsatz (BUTT 1991). Als sehr starker Stimulus
erwies sich der zellfreie Überstand einer Arcanobacterium pyogenes–Kultur (SUBANDRIO und NOAKES 1992).
So wurden auch beim Rind vornehmlich unphysiologische Stimuli eingesetzt, deren Wirkungsmechanismen und Nebenwirkungen auf die nachfolgend zu charakterisierenden Zellen unklar bleiben. Diesen Konflikt vermeidend, applizierten ZERBE et al. (1996) Rindern intrauterin LTB4, einen physiologischen Mediator der PMN-Migration, wodurch selektiv neutrophile Granulozyten zur Einwanderung in den Uterus bewegt wurden.
Um die chemotherapeutische Wirkung von Spiramycin zu testen, ist bei Schafen experimentell eine Endometritis mittels intrauteriner Applikation von Arcanobacterium pyogenes und Fusobacterium necrophorum erzeugt worden (CESTER et al. 1996).
2.4 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
Bei der unspezifischen zellulären Abwehr zählen PMN neben Makrophagen zu der wichtigsten Zellpopulation. Zur Abwehr von Fremdorganismen benötigen sie keine Spezifität gegenüber Antigenstrukturen. Ihre Hauptaufgabe verrichten sie bei akuten Entzündungen und in Zusammenarbeit mit Antikörpern und Komplementfaktoren bei der Bekämpfung parasitärer und bakterieller Infektionen. Nach ihrer Bildung im Knochenmark werden sie in den Blutstrom abgegeben, in dem sie nur wenige Stunden zirkulieren (WECKER 1990, KLEIN 1991). Bezogen auf kernhaltige Zellen hat das Pferd hat ein sogenanntes granulozytäres Blutbild. Beim gesunden Individuum stellen die segmentkernigen neutrophilen Granulozyten mit 50-80% die größte Leukozytenpopulation im Blut dar (BICKHARDT 1992).
2.4.1 Phänotypische Eigenschaften von neutrophilen Granulozyten
Auf der Oberfläche der PMN befinden sich eine Reihe von Strukturen, die durch Bindung von Mediatoren und Fremdstoffen eine wichtige Grundlage für Eigenschaften und Funktionen der Zelle bilden. Darüber hinaus kommen Oberflächenmoleküle bei Interaktionen mit anderen Zellen zum Tragen.
Entsprechend ihrer Funktion lassen sich zelluläre Oberflächenstrukturen in drei Gruppen einteilen:
Antigenspezifische Rezeptormoleküle finden sich auf der Oberfläche von Lymphozyten und vermitteln die Antigenerkennung. Bei Granulozyten kommen sie nicht vor (RÖNSCH 1992).
Die Transplantationsantigene („Major histocompatibility complex“, MHC) werden auf allen kernhaltigen Zellen des Körpers außer auf Spermien gefunden. Durch die Präsentation endogener Antigene ermöglichen sie T-Zellen die Unterscheidung zwischen körpereigenen und –fremden Proteinen sowie zwischen gesunden und entarteten Strukturen. MHC-Klasse-I- Moleküle werden innerhalb einer Spezies polymorph, innerhalb eines Individuums aber konstant exprimiert (SCHUBERTH et al. 1991). Dagegen kommen MHC-Klasse-II-Moleküle in der Regel nur auf monozytären Zellen und B-Lymphozyten vor. PMN können jedoch zu einer Expression angeregt werden. MHC-II-Moleküle vermitteln die Erkennung extrazellulärer Proteinsequenzen.
Beim Menschen sind bisher über 180 verschiedene Differenzierungsantigene bekannt. Sie werden je nach Funktion auf allen Zellen in unterschiedlicher Menge und Zusammensetzung exprimiert. Sie ermöglichen eine genauere Differenzierung von Zellpopulationen, als es aufgrund morphologischer Charakteristika möglich ist. Der Nachweis von Differenzierungsantigenen findet in diesem Fall über monoklonale Antikörper (mAk) statt.
Aufgrund des Reaktionsverhaltens von mAk gegenüber Zelloberflächenmolekülen werden diese einem „Cluster of differentiation“ (CD) zugeordnet (SCHUBERTH et al. 1991).
Unter den Differenzierungsantigenen sind für PMN v.a. funktionsassoziierte Oberflächenmoleküle, beispielsweise bei der transendothelialen Migration von Bedeutung.
Dieser Prozess kann nur unter Beteiligung der sogenannten CD11a/18-Integrine der PMN ablaufen. Diese Membranstruktur wird auch als Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen 1
(LFA-1) bezeichnet. Dieser Rezeptor bindet an interzellulären Adhäsionsmolekülen („Intercellular adhesion molecules“, ICAM-1), die auf aktivierten Endothelzellen exprimiert werden können. Bei der Leukozytenzytenadhäsionsdefizienz des Menschen, des Hundes und des Rindes ist die Adhäsion der PMN an Endothelzellen und somit ihre Extravasation gestört, da aufgrund einer Mutation ein Defekt des CD18-Moleküls vorliegt und somit keine funktionsfähigen CD18-abhängigen Oberflächenmoleküle ausgebildet werden (SMITH und ANDERSON 1991).
Die Aktivierung von Granulozyten durch Entzündungsmediatoren oder chemotaktische Substanzen führt zu einer Verminderung oder Erhöhung der Expressionsdichte von Oberflächenmolekülen. Da durch die Modulation membranständiger Strukturen die Funktionalität von Zellen beeinflusst werden kann, besitzt der Nachweis von Oberflächenmolekülen diagnostische Bedeutung (RÖNSCH 1992). Der Nachweis kann mittels fluorochromkonjugierter monoklonaler Antikörper unter Verwendung von immunzytochemischen Methoden (ELISA), der Fluoreszenzmikroskopie oder der Durchflusszytometrie geführt werden (GUIDRY et al. 1992, LOHMEYER et al. 1994, MAGYAR et al. 1995).
Für das Pferd stehen eine Reihe monoklonaler Antikörper zur Verfügung, die im Rahmen eines internationalen Arbeitskreises hergestellt und entsprechend ihrer Spezifität klassifiziert werden (LUNN et al. 1998).
2.4.2 Extravasation und Migration
Der Vorgang des Auswanderns von PMN aus dem peripheren Blut in extravaskuläres Gewebe – die sogenannte Extravasation - ist von entscheidender Bedeutung für die durch Granulozyten regulierte Entzündungsreaktion. Dieser Prozess kann einerseits durch die PMN selbst oder durch die Gefäßendothelzellen des betroffenen Gewebes in Gang gebracht werden (ZIMMERMANN et al. 1992, HOGG 1992). In einem entzündeten Gebiet wirken verschiedene chemoattraktive Substanzen auf die PMN ein. Das können z.B. Komplement- Komponenten, von ortständigen Zellen sezernierte Zytokine oder Produkte bakterieller Erreger sein (z.B. LPS). Die PMN reagieren auf diese Signale mit einer veränderten
Expression von Adhäsions-vermittelnden Oberflächenmolekülen. Dadurch kommt es zu reversiblen Anheftungen der PMN an die Endothelzellen, wodurch ihre Strömungsgeschwindigkeit verringert wird und sie im Entzündungsgebiet festgehalten werden. Daran beteiligt sind auf Seiten der PMN v.a. Leukozytenintegrine wie LFA-1, L- Selektine und Kohlenhydrat-Liganden. Die Endothelzellen des betroffenen Gebietes tragen ihrerseits zum Anheftungsprozess der PMN bei, indem sie selektiv Adhäsionsmoleküle expremieren. Dazu gehören interzelluläre Adhäsionsmoleküle (z.B. ICAM-1), E-Selektine und P-Selektine, welche als Gegenstücke zu Kohlenhydratepitopen auf Leukozyten agieren (JANEWAY und TRAVERS 1997). Die Regulation der Aktivität dieser Bindungsmoleküle auf den Endothelzellen resultiert aus einem Kontakt mit Entzündungsmediatoren wie Tumornekrose Faktor α (TNFα) oder auch dem bakteriellen LPS. Dabei läuft die Expression der P-Selektine innerhalb weniger Minuten ab, wohingegen die E-Selektine erst nach einigen Stunden aktiv werden können (NORMAN et al. 1995). Darüber hinaus sind derart stimulierte Endothelzellen selbst in der Lage, PMN-aktivierende Substanzen zu erzeugen, darunter den Plättchen-Aktivierenden-Faktor (PAF) und das potente chemoattraktive Zytokin Interleukin 8 (IL-8), welche zusätzlich die Adhäsion und die transendotheliale Migration der PMN fördern (HUBER et al. 1991). Unter Einfluss von IL-8 oder anderen Chemoattraktoren kommt es zu einer Konformationsänderung der β2-Integrine auf PMN, wodurch die Adhäsionskapazität dieser Moleküle stark erhöht wird. Die feste Bindung mit den Gefäßendothelzellen führt letztlich zur Diapedese der PMN durch die Gefäßwand. Die Basalmembran wird durch proteolytische Enzyme der Leukozyten für diese passierbar (JANEWAY und TRAVERS 1997).
Auch im Gewebe reagieren die neutrophilen Granulozyten auf chemotaktische Botenstoffe.
Hierbei kommt es zu einer Bindung von Mediatoren mit spezifischen G-Protein-gekoppelten Leukozytenoberflächenrezeptoren. Über das G-Protein wird abhängig vom Mediator eine spezielle Enzymkaskade aktiviert, die ihrerseits eine stimulierende Wirkung auf die Migration, Adhärenz oder Loslösung der Zelle sowie die Verformung des Zytoskeletts der Leukozyten besitzt (BOKOCH 1995).
2.4.3 In-vitro-Migrationsuntersuchungen
Um die Reaktivität von Leukozyten auf einen chemotaktischen Reiz und die Migrationsleistung von Leukozyten beurteilen zu können, ist eine Vielzahl von Analysesystemen entwickelt worden. Die zwei für das equine System gebräuchlichsten seien an dieser Stelle erwähnt.
2.4.3.1 Under-Agarose-Assay
Diese Methode wurde 1974 von CUTLER und MUNOZ entwickelt und ist anschließend von NELSON et al. (1975) für die Untersuchung humaner Leukozyten etabliert worden. Das Prinzip dieses Testes besteht darin, dass auf eine sterile Petrischale Agarose-Gel aufgetragen wird, in welches Vertiefungen eingebracht werden. In eine Vertiefung pipettierte PMN wandern unter dem Gel in Richtung auf ein Chemotaktikum in einer der weiteren Vertiefungen zu oder von einer Substanz weg (negative Chemotaxis). Nach Inkubation werden die Zellen am Schalenboden fixiert, gefärbt und ihre Wanderungsrichtung und - strecke mikroskopisch beurteilt.
Diese Methode ist von BLANCQUAERT et al. (1989) für das equine System optimiert worden.
2.4.3.2 Boyden-Kammer
Im Gegensatz zur Under-Agarose-Methode, wo Zellen in einer waagerechten Ebene migrieren, ist die Bewegungsrichtung bei der von BOYDEN (1962) entwickelten Methode vertikal. Bei diesem älteren, aber auch heute gebräuchlicheren Verfahren befinden sich Zellsuspension und Chemoattraktivum in zwei übereinandergelegenen Kammern und sind durch eine etwa 150 µm dicke Membran voneinander getrennt. Die in der oberen Kammer befindlichen Zellen wandern, durch die unten befindliche Substanz angelockt, in diese
Membran hinein. Bei einer Porengröße von 3 µm kann von einem aktiven Migrationsprozess ausgegangen werden. Nach der Wanderungszeit werden die Zellen im Filter fixiert, gefärbt und die Anzahl gewanderter Zellen sowie die Migrationsstrecke im Filter mikroskopisch beurteilt. Eine Modifikation von SEDGWICK et al. (1982), bei der die kostenaufwendige Plexiglaskammer durch Einwegmaterialen ersetzt wird, kam im equinen System häufiger zum Einsatz.
2.4.3.3 Auf equine neutrophile Granulozyten wirksame Chemotaktika
Unter Zuhilfenahme oben genannter Detektionssysteme sind unterschiedlichste Substanzen auf ihre migrationsinduzierende Wirkung gegenüber equinen PMN untersucht worden:
BLANCQUAERT et al. (1988) untersuchten die Wirksamkeit eines Sc. faecalis- Kulturüberstandes und beobachteten eine konzentrationsabhängige Chemotaxis als auch Chemokinesis bei equinen PMN. Dagegen konnten PYCOCK und ALLEN (1988) weder mit einem Sc. zooepidemicus-Kulturüberstand noch mit einer Suspension dieser Erreger eine Stimulation der in-vitro-Migration erzielen. Ähnliches berichteten MUHKTAR und TIMONEY (1988), die eine gerichtete PMN-Migration als Reaktion auf eine Sc. equi- Suspension oder deren Kulturüberstand nur indirekt über die Aktivierung von Komplementfaktoren erzielten. Der Überstand ohne Serumzusatz hatte eher eine hemmende Wirkung auf die Migrationsaktivität der PMN.
SEDGWICK et al. (1987) erreichten mit Zymosan-aktiviertem Serum (ZAS) eine gerichtete Migration von equinen neutrophilen Granulozyten in vitro. Durch Zugabe von Zymosan A und anschließender Inkubation werden im Serum (oder Plasma) die chemotaktischen Komplementfaktoren 5a (C5a) und 3a (C3a) gebildet, die eigentlich aktiven Substanzen. Diese Präparation diente im Anschluss vielfach als Standardchemoattraktivum für Migrationsassays.
DAWSON et al. (1988) sowie FOSTER et al. (1992) konnten mit Hilfe einer modifizierten Boyden-Kammer eine Migration equiner PMN (und eosinophiler Granulozyten) durch humanes PAF beobachten.
WATSON et al. (1987c) testeten im Rahmen ihrer Forschungsarbeit bezüglich der Endometritis bei der Stute die Chemoattraktivität der Arachidonsäuremetaboliten LTB4, PGF2α und PGE2 im „Under Agarose“-Verfahren. PMN-Chemotaxis war in Richtung LTB4 in einem Konzentrationsbereich von 1 bis 100 ng/ml und in Richtung PGE2 von 1 bis 10 ng/ml deutlich nachweisbar. PGF2α zeigte keine Migrationsstimulation.
Die synthetisch formylierten Oligopeptide, wie Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLP), dienen im humanen System immer wieder als Positivkontrolle für Migrationsassays.
Auf die Migration equiner PMN hat dieses Peptid allerdings keinen oder nur einen geringen Einfluss (SNYDERMAN und PIKE 1980, ZINKL und BROWN 1982, BLANCQUAERT et al. 1988).
2.4.3.4 Hemmung der Migration equiner neutrophiler Granulozyten
Mehrere nichtsteroidale antiinflammatorische Substanzen sind in der Lage, die PMN- Wanderung in vitro zu beeinflussen. Flunixin, Indomethacin, Oxyphenbutazon und Phenylbutazon hemmten in den auch für den therapeutischen Einsatz gebräuchlichen Konzentration Chemotaxis und Chemokinesis der PMN, wobei Flunixin den deutlichsten Effekt zeigte (DAWSON et al. 1987). PYCOCK et al. (1988) untersuchten in einer vergleichenden Studie antibakterielle Medikamente auf eine Migrationshemmung. Dabei wiesen sie für Neomycin sowohl in vitro als auch nach systemischer Applikation einen Hemmeffekt auf equine PMN nach. Trimethoprim/Sulfadoxin und Benzylpenizillin blieben dagegen ohne Wirkung. LEID et al. (1987) gelang die Hemmung der ZAS-vermittelten PMN- Migration mit Hilfe von Taeniastatin, einem Taenia taeniaformis-Proteinase-Inhibitor.
2.4.3.5 Interleukin 8
Das Zytokin Interleukin 8 (IL-8) ist unter den Synonymen Neutrophilen Attraktives/Aktivierendes Protein 1 (NAP-1), Neutrophile Aktivierender Faktor (NAF),
„Granulocyte chemotactic protein“ (GCP), „Leukocyte adhesion inhibitor“ (LAI), „Monocyte derived neutrophil activating peptide“ (MONAP), „monocyte derived neutrophil chemotactic factor“ (MDNCF) u.a.m. bekannt (GILLI 1999). Aus diesen Umschreibungen wird bereits die herausragende Eigenschaft des IL-8 deutlich: Die Aktivierung von vornehmlich PMN zur Migration. Diese Spezifität resultiert aus der Rezeptordichte für IL-8 auf der Oberfläche verschiedener Leukozytensubpopulationen. Sie beträgt bei Neutrophilen etwa 20.000/Zelle, bei T-Lymphozyten sind es etwa 300/Zelle (BAGGIOLINI und CLARK-LEWIS 1992).
IL-8 wird von Endothel- und Epithelzellen, sowie von Lymphozyten, Monozyten, Fibroblasten und neutrophilen Granulozyten gebildet (KUNKEL et al. 1991, BURMESTER und PEZZUTTO 1998). Die Freisetzung von IL-8 seitens der PMN wird durch die chemotaktisch induzierte Migration (SIDDIQUI et al. 1999) und auch durch phagozytotische Aktivität gesteigert (BAZZONI et al. 1991).
Man unterscheidet eine aus 72 Aminosäuren bestehende IL-8-Variante, die vorwiegend von Monozyten und Lymphozyten produziert wird, und ein 77-Aminosäuren-IL-8. Dieses wird u.a. von Endothelzellen sezerniert und dann durch Abkopplung von fünf Aminosäuren zur biologisch aktiven 72-Aminosäuren-Variante umgesetzt (BALDWIN et al. 1990).
Neben der Migrationsaktivierung bewirkt IL-8 bei Neutrophilen eine Voraktivierung zur Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten („priming“), führt zur Hochregulierung des Makrophagen Rezeptors 1 (Mac-1, CD11b/18) (ROBERTS et al. 1993) und fördert die Freisetzung lysosomaler Enzyme (SCHROEDER et al. 1987).
Die chemotaktische Wirksamkeit des IL-8 konnte sowohl beim Menschen als auch bei einer Reihe anderer Spezies gezeigt werden. ZWAHLEN et al. beobachteten einen PMN-Influx in das Gewebe nach intradermaler Applikation bei Ratte (1993) und Hund (1994).
SUGAWARA et al. (1995) zeigten in einer breit angelegten Vergleichsstudie humanes IL-8- Effekte auf PMN von Affe, Hund, Huhn, Kaninchen, Maus, Meerschweinchen, Ratte und Ziege. Beim Rind bewirkt humanes IL-8 eine transendotheliale in-vitro-Migration (BOCHSLER et al. 1994). Eine In-vivo-Applikation des Zytokins in die Zitzenzisterne des Euters ließ allerdings keine PMN-Immigration in das Lumen der Zitze oder die Zitzenwand folgen (PERSSON et al. 1993). Die Wirkung dieser spezifischen chemotaktischen Substanz auf die Migration equiner PMN ist bisher nicht untersucht worden. MARR et al. (1999) untersuchten lediglich dessen Wirkung auf das Adhäsionsverhalten equiner PMN an Fibronektin- und Serum-beschichtetem Plastik, wo es eine steigernde Wirkung besaß.
FRANCHINI et al. (1998) haben eine Beteiligung von IL-8 an Entzündungsprozessen des Pferdes in ihren Ausführungen vorrausgesetzt.
2.4.4 Phagozytose
Nachdem die PMN im Entzündungsgebiet angelangt sind, besteht ihre Hauptaufgabe darin, zu eliminierende Partikel aufzusuchen und zu neutralisieren. Bei diesen Partikeln handelt es sich meist um Bakterien. Um diese Aufgabe zu erfüllen, wird der Erreger meist inkorporiert.
Durch die sogenannte Opsonisierung wird der Prozess der Bindung zwischen Phagozyt und Bakterium verstärkt. Opsonine binden an der Oberfläche des zu eliminierenden Partikels und an entsprechenden Rezeptoren auf der PMN-Membran. Dabei sind drei Klassen an Opsonsinen zu unterscheiden: Immunglobuline vom Typ IgG, die an Fc-Rezeptoren der PMN binden, Spaltprodukte der Komplementkaskade (z.B. C3b, C4b), die von den korrespondierenden Komplementrezeptoren der PMN erkannt werden (hier CR3 und CR4), und schließlich membranständige Kohlenhydratgruppen auf Mikroorganismen, die seitens der PMN an Lektin-Rezeptoren binden (ROITT et al. 1991, JANEWAY und TRAVERS 1997).
Wurde ein Antigen über Rezeptoren der Granulozytenmembran fixiert, beginnt der Vorgang der Ingestion. Vorraussetzung ist, dass die Phagozytoseobjekte nicht zu groß sind. Ein Partikeldurchmesser von 1 µm oder auch mehr (etwa 10% des PMN-Durchmessers) lässt eine Phagozytose zu (DONNELLY et al. 1987, KLEIN 1991). Die PMN-Membran bildet unter Aktivierung von intrazellulären Aktin- und Myosinfilamenten Pseudopodien, die das zu inkorporierende Material becherartig umschließen und als Vakuole in die Zelle aufnehmen.
Diese als Phagosom bezeichnete Vakuole wird nach Verschmelzung mit zytoplasmatischen Granula der PMN zum Phagolysosom. Man unterscheidet die primären Granula - mit einem Anteil von etwa 10-20% - von den sekundären Granula. Die primären Granula enthalten Lysozym, Myeloperoxidase und Proteinasen. Dagegen beinhalten die sekundären Granula u.a.
Laktoferrin und Kollagenasen, die im Phagolysosom auf das phagozytierte Antigen einwirken (GEMSA et al. 1991, LONNERDAL u. IYER 1995). Die unverdaulichen Spaltprodukte der durch Enzymeinwirkung abgetöteten Bakterien werden exozytiert oder sammeln sich im
Granulozyten an und können dessen Absterben bedingen (KLEIN 1991). Zerfallsprodukte lysierter Bakterien und PMN wiederum dienen als Entzündungsmediatoren und fördern die weitere Rekrutierung von PMN aus dem Blutstrom sowie deren Aktivierung (GEMSA et al.
1991).
2.4.5 Die in-vitro-Beurteilung der Phagozytoseaktivität
Um die Phagozytoseaktivität equiner PMN in vitro bestimmen zu können, werden die isolierten Granulozyten mit präparierten Mikropartikeln zusammengebracht. Diese können von sehr unterschiedlichem Material und Markierung sein, und nach ihnen richtet sich die Art des Detektionssystems. Die Bewertung der funktionellen Kapazität der PMN kann u.a. mittels Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie, Szintillationszählung oder Durchflusszytometrie erfolgen. Als Mikropartikel für eine mikroskopische Auswertung haben im equinen System u.a. Blastosporen von Candida albicans (CHEUNG et al. 1985, LIU et al. 1985, WATSON et al. 1987b), Taylorella equigenitalis, Erreger der übertragbaren equinen Endometritis („contagious equine metritis“, CEM), Kolibakterien (BERTRAM et al. 1983) oder Staphylococcus aureus (MORRIS et al. 1988) gedient. WICHTEL et al. (1991) nutzen fluorochrommarkierte Sc. equisimilis. ASBURY und HANSEN (1987) bestimmten die Phagozytoseaktivität indirekt über die Chemiluminiszenz der PMN nach Ingestion opsonisierter Streptokokken. Mittels Durchflusszytometrie kann die Aufnahme fluoreszierender Latexpartikel (FOERSTER und WOLF 1990), fluoreszierender Hefezellen (GRONDAHL et al. 1997, RAIDAL et al. 1998) oder auch fluorochrommarkierter Streptokokken (CASTILHO 1997) durch Neutrophile bestimmt werden. Dabei wird über die Fluoreszenzintensität der Phagozyten die Anzahl inkorporierter Partikel abgeschätzt.
2.4.6 Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
Bereits die Anheftung opsonisierter Antigene an die Zelloberflächenrezeptoren der PMN verursacht Membranveränderungen und induziert damit biochemische Reaktionen. Diese führen u.a. zur Bildung einer Reihe mikrobizider Substanzen, die den PMN zur Infektionsabwehr zur Verfügung stehen. Darüber hinaus wird das phagozytierte Material in den Phagolysosomen zersetzt. Zu den angesprochenen Substanzen gehören antimikrobielle Proteine, Enzyme wie das Lysozym, Kompetitoren wie das Laktoferrin, Stickoxide (NOx) und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wie H2O2, O2-, u.a.m.. Ruhende PMN zeigen nur geringe Aktivität. Direkt nach einer Stimulation kommt es zur Steigerung des zellulären oxidativen Metabolismus, und der membranständige NADPH-Oxidase-Komplex wird aktiviert. Der nun vermehrt aufgenommene Sauerstoff führt zu einer vermehrten ROS-Bildung, deren spontane Freisetzung als „respiratory burst“ bezeichnet wird (KLEIN 1991). Dieser Prozess läuft begleitend zur Phagozytose ab, ist aber auch ohne die Ingestion möglich. Die Bindung von Antikörpern an den Fcγ-Rezeptoren der PMN (JANEWAY und TRAVERS 1997) sowie von komplementopsonisierten Bakterien an den Komplementrezeptoren oder die Ankopplung anderer Zellen über die Adhäsionsmoleküle CD11b/18 kann ebenso zu einer ROS- Ausschüttung führen (GOODMAN et al. 1995, RUIZ et al. 1995), wie der Kontakt mit Entzündungsmediatoren (z.B. TNFα; JANEWAY und TRAVERS 1997).
Die sauerstoffreichen Endprodukte dieser Aktivierung sind Oxidationsmittel von starker Toxizität gegenüber mikrobiellen Erregern und stellen damit einen wichtigen Teil der unspezifischen Abwehr des Wirtsorganismus dar. Die Toxizität erstreckt sich aber auch auf körpereigene Zellen. Somit kann das im Entzündungsbereich liegende Gewebe geschädigt werden (WECKER 1990, GEMSA et al. 1991). Beim Pferd wird dieser Nebeneffekt u.a. als ein bedeutender pathogenetischer Faktor der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung („Chronic obstructive pulmonary disease“, COPD) diskutiert (FRANCHINI et al. 1998).
2.4.7 Die in-vitro-Beurteilung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
Bei der Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) werden neben neueren Methoden, wie der Durchflusszytometrie, weiterhin ältere Verfahren, wie die Erfassung der Lichtemission über Photonenverstärker oder die photometrische Darstellung eingesetzt. Den Verfahren ist gemein, dass die Aktivität der Sauerstoffmetaboliten über die chemische Umsetzung eines Substrats analysiert wird.
BENBAREK et al. (1997 und 1998) erfassten die ROS-Bildung equiner PMN über die luminol-verstärkte Chemilumineszenz. Dabei diente LPS als Aktivator, welches alleine keine erkennbare Stimulation zeigte, aber dafür im Beisein von Blutplasma eine indirekte Reaktion bedingte. MARR et al. (1997) maßen die Superoxid-Anionen-Bildung mit Phorbol-Myristat- Azetat (PMA) stimulierter Granulozyten über die Reduktion von Cytochrom C, die spektrometrisch erfasst wird. Die Vorzüge des Durchflusszytometers nutzte CASTILHO (1998), der eine von EMMENDÖRFER et al. (1990) für das humane System entwickelte Methode verwendete, bei der die Myeloperoxidase-Aktivität die Umsetzung eines nicht- fluoreszierenden Substrats zu einem fluoreszierenden Stoff bewirkt.
2.5 Die Rolle der neutrophilen Granulozyten bei der Infektionsabwehr im equinen Uterus
Innerhalb von zwei Stunden nach einer Kontamination des Uterus mit Bakterien, Sperma oder anderen Kontaminanten kommt es zu einer Antwort der PMN auf chemotaktische Signale. Sie reagieren mit einem massiven Influx in das Uteruslumen (PYCOCK und ALLEN 1988).
Aktivierte Uterus-PMN beginnen mit der Phagozytose von Bakterien, Samenzellen und Zelltrümmern in Anwesenheit von Opsoninen, insbesondere Immunglobulinen als auch der Komplementfaktor C3b (TROEDSSON et al. 1993). Spaltprodukte der Komplementkaskade (C5a und C3a) sorgen wohl ebenso für eine anhaltende Rekrutierung der PMN aus dem Blut wie Leukotriene B4 (LTB4), Prostaglandin E (PGE) und Prostaglandin F2α (PGF2α) (LEES et al. 1986, WATSON et al. 1987a und 1987b, PYCOCK und ALLEN 1990).
Bei der vergleichenden Untersuchung von Uterus-PMN aus empfänglichen Stuten und resistenten Stuten mit Grad III- und Grad I- kategorisiertem Endometrium zeigten die Uterus- PMN der Grad-III-Stuten erheblich verringerte Phagozytosefähigkeit von opsonisierten Candida-Blastosporen (CHEUNG et al. 1985). Das entspricht den Beobachtungen von WATSON et al. (1987b). Ein ähnliches Ergebnis bezüglich der Funktionalität erzielten LIU et al. (1985), die den Uterus-PMN der Grad-III-Stuten eine verminderte Zellelastizität (als Maß für die Phagozytosefähigkeit) und Wanderungsbereitschaft attestierten. Allerdings wurden in diesen drei Studien zuvor die PMN mittels intrauteriner Infusion einer Sc.
zooepidemicus-Suspension angelockt und dann für die oben aufgeführten Untersuchungen herausgespült. Die Untersucher räumten ein, dass der unterschiedlich lange Kontakt der PMN mit den Bakterien schwer interpretierbare Ergebnisse erbringt.
In späteren Experimenten wurden die Uterus-PMN mit zellfreien Substanzen in das Lumen gelockt, so z.B. mit Hilfe eines Filtrats einer Sc zooepidemicus-Suspension.
Erstaunlicherweise zeigten bei diesen Untersuchungen mittels Chemilumineszenz die Granulozyten der empfänglichen Stuten eine höhere Aktivität als die der sogenannten resistenten Stuten. Ein Einfluss des Zyklusstandes wurde nicht beobachtet (ASBURY und HANSEN 1987). In einer zweiten Studie von HANSEN und ASBURY (1987) beschrieben diese für empfängliche Stuten ebenfalls eine bessere in-vitro-Funktionalität.
TROEDSSON et al. (1990) nutzten 0,1%iges Austernglykogen zum Anlocken der PMN in die equine Gebärmutter. Sie konnten den Uterus-PMN empfänglicher Tiere nicht grundsätzlich eine bessere Abwehrkapazität zusprechen. Nach ihren Beobachtungen phagozytierten diese uterinen PMN nur dann besser als die der resistenten Stuten, wenn die Phagozytoseobjekte mit Serum opsonisiert wurden. Dagegen führte die Inkubation mit Uterussekret der empfänglichen Tiere zu einer schlechteren Opsonisierung und somit verminderten Phagozytose. Die Untersucher schlussfolgerten, dass uterine PMN empfänglicher Tiere voll funktionstüchtig sind, wenn ihnen ein optimales Milieu geboten wird. Diese Aussage widerspricht den Ergebnissen von WATSON et al. (1987b), die für das zellfreie Uterussekret empfänglicher Stuten eine bessere Opsonisierung von Hefepartikeln für eine Phagozytose nachwiesen. Auch ASBURY et al. (1980) berichteten von einem erhöhten Gehalt an Opsoninen im Uterus empfänglicher Stuten.
Bei der Untersuchung eines möglichen Hormon- oder Zykluseinflusses auf PMN- Eigenschaften wurden ebenfalls unterschiedliche Ergebnisse erzielt. Bezüglich der in-vitro- Migration von Blut-PMN wurden keine Unterschiede gefunden, wenn die Zellen in Uterussekret aus Östrus oder Diöstrus inkubiert wurden (BLUE et al. 1984, STRZEMIENSKI et al. 1984).
In einem anderen Versuch wurde die antibakterielle Wirkung von Uterussekret über die Hemmung der Koloniebildung von Bakterien bestimmt. Hier zeigte sich, dass die Hemmwirkung von im Diöstrus gewonnener Uterusflüssigkeit stärker war als die Hemmwirkung von der im Östrus gewonnenen Uterusflüssigkeit (STRZIEMENSKI et al.
1984).
WASHBURN et al. (1982) untersuchten den Effekt von systemischen Progesteron- und Östrogen-Gaben auf die Kapazität zur Infektionsabwehr bei ovarektomierten Ponys. Dabei waren die unter Östrogen-Einfluss stehenden Tiere schneller in der Lage, eine artifizielle bakterielle Endometritis zu eliminieren. Auch die Blut-PMN dieser Individuen wiesen eine höhere Phagozytoseaktivität auf, als die der Progesteron-Gruppe.
In einer anderen Studie wurden ovarektomierte Stuten über einen längeren Zeitraum ebenfalls mit Östradiol oder Progesteron behandelt. Das Uterussekret der Östradiol-behandelten Tiere beeinflusste die in-vitro-Migration von neutrophilen Granulozyten negativ, das der Progesteron-behandelten Tiere allerdings positiv. Die Uterusgranulozyten dieser zwei Gruppen zeigten keine Beeinträchtigung ihrer Migrationseigenschaften durch eine dieser Behandlungen (WATSON 1988). Die unter Progesteroneinfluss stehenden Stuten zeigten somit zwar eine schlechtere Abwehrfähigkeit einer künstlichen Infektion, jedoch unveränderte in-vitro-Migrationseigenschaften der Uterus-PMN.
Dieser Auszug aus einigen Studien zu Eigenschaften uteriner PMN von empfänglichen Stuten und Stuten mit nachweislich verändertem Endometrium spiegelt die recht gegensätzlichen bisherigen Ergebnisse in diesem Forschungsbereich wider. TROEDSSON (1999) räumte ein, dass die Rolle der PMN beim Versagen, eine bakterielle Infektion effektiv aus dem equinen Uterus zu eliminieren, nicht geklärt werden konnte. Einer der Hauptgründe wird in den sehr unterschiedlichen Versuchsansätzen gesehen: Zur Induktion der PMN-Immigration in das Uteruslumen wurden nur unphysiologische Substanzen eingesetzt, deren Wirkungsweise im Organismus und deren direkter Einfluss auf die neutrophilen Granulozyten in fast allen Fällen verborgen blieb.
3 Material und Methoden 3.1 Geräte und Materialien
3.1.1 Geräte, Klinik- und Laborbedarf Geräte
Aqua dest.-Aufbereitungssystem Umkehr-Osmose-Anlage, Fa. Kloos, Langenhagen, Hannover
Durchflusszytometer mit Computereinheit Fluorescence Activated Cell Analyser (FACScanR), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
Eismaschine Typ UBE 30-10 Fa. Ziegra, Isernhagen Fluoreszenzmikroskop mit Ploemiluminator
und Phasenkontrasteinrichtung
Fa. Zeiss, Oberkochen Heißluftsterilisator Typ ST5050 Fa. Heraeus, Hanau
Laborwaage B6 Fa. Mettler, Zürich / Schweiz
Laborwaage L310 Fa. Sartorius GmbH, Göttingen
Magnetrührer mit Heizplatte Fa. Janke u. Kunkel, Staufen Sterile Werkbank, Heraeus LaminAir, HLB
2472
Fa. Heraeus-Christ GmbH, Hanau Wasserbad mit Temperaturregelung Fa. Köttermann KG, Uetze-Hänigsen Kühlzentrifuge Varifuge K Fa. Heraeus-Christ GmbH, Osterode Mini-Tischzentrifuge Wifug, Nr. 107-07 Fa. AB Wickelcentrifug, Schweden Tischzentrifuge mit Winkelrotor für
Reaktionsgefäße 1,5 ml
Fa. Hermle, Gosheim Plattenzentrifuge mit Plattenrotor, Typ UJ II
KS
Fa. Heraeus-Christ GmbH, Osterode
Geräte für Zellkulturarbeiten
Bunsenbrenner mit automatischer Zündung (Fireboy)
Fa. Tecnomara, Fernwald
CO2-Brutschrank (Baureihe 5060) Fa. Heraeus-Christ GmbH, Hanau Einmal-Filterhalter, 0,2 µm Fa. Renner(AX0558-3), Dannstadt
Feuchtkammer (Plastikbox mit Gittereinsatz)
Pinzette, gebogen, anatomisch Fa. Eickemeyer (170710), Tuttlingen PC-MB 25 x 80 mm, 3 µm Porengröße, PVP
Membranen
Fa. Cytogen (155812), Ober-Mörlen Transwell Membraneinsätze (permeabel)
Nr. 3402, 3 µm Porengröße
Fa. Costar GmbH, Bodenheim
Zellzählkammer nach BÜRKER Glaswarenfabrik K. Hecht, Sondheim 10-Well-Transmigrationskammer
400 µl/285 µl
Fa. Cytogen (442000), Ober-Mörlen
Klinikbedarf
Ultraschallgerät Fa. Aloka
Vaginalspekulum nach Polansky Fa. Hauptner, Solingen Zervixzange nach Albrechtsen Fa. Hauptner, Solingen Tupfergerät nach Merkt und von Lepel Fa. Hauptner, Solingen Uterusbiopsiegerät nach Roberts, modifiziert
nach Goetze
Fa. Hauptner, Solingen
Kanüle 1,1 x 50 mm Fa. Heiland (30 370 320), Hamburg Röhrchen, 10 ml mit Lithium-Heparin Fa. Sarstedt, Nümbrecht
Spülkatheter „Neustadt/Aisch“ Fa. W. Wörrlein, Medizintechnik, Ansbach Spritzen, 5, 10 und 20 ml Fa. Heiland, (370-173,-175,-177)Hamburg Spritzen, 50 ml mit 60-ml-Skalierung Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
Vacutainerröhrchen, 10ml, - ohne Antikoagulanz - mit Natrium-Heparin - mit Kalium-EDTA
Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
Vacutainer Brand Luer Adapters Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
Laborbedarf
Eppendorf-Reaktionsgefäß, 1,5 ml Fa. Greiner (616201), Frickenhausen Mikrotiterplatten, 96-Loch, Rundboden Fa. Nunc (439454), Wiesbaden Objektträger, 76 x 26 mm Fa. Jürgens (916145), Hannover Pipettenspitzen, gelb und blau Fa. Greiner (685290 und 686290),
Frickenhausen
Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 ml Fa. Becton Dickinson (2008), Heidelberg Probenröhrchen mit 4,5 ml Fa. Greiner (120161), Frickenhausen Probenröhrchen mit 12 ml Fa. Greiner (191161), Frickenhausen Röhrchen, 15 ml, Polypropylen Fa. Greiner (188261), Frickenhausen Röhrchen, 50 ml, Polypropylen Fa. Greiner (227261), Frickenhausen
Saugpipetten (12 ml) Fa. LAT, Hannover
Zellkulturflaschen, 260 ml Fa. Nunc (147589), Wiesbaden Laborflaschen mit Gewinde, 500 ml Fa. Jürgens (9.072995), Hannover
3.1.2 Medikamente, Reagenzien und andere Materialen
AccustainTM, Wright Stain, modified Fa. Sigma Diagnostics, St. Louis, USA
Acridinorange Fa. Sigma (A6014), Deisenhofen
Albumin, bovine, Fraktion V, 98%
pulverisiert (BSA, bovines Serumalbumin) Fa. Roth (8076.2), Karlsruhe Dihydrorhodamin 123 (DHR 123)
(Molekulargewicht: 346,38 g/mol) Fa. MoBiTec (D632), Göttingen GmbH Dimethylsulfoxid (DMSO) Fa. Baker (7157), Deventer, Holland Ethanol, absolut Fa. Riedel-de Haën (32205), Seelze
Ethidiumbromid Fa. Sigma-Aldrich (E87A51), Deisenhofen Fetales Kälberserum (FCS) Fa. Biochrom, Berlin
Ficoll® (1,077 g/ml bei 10°C) Fa. Cytogen, Ober-Mörlen
Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Fa. Sigma (F7250), St. Louis, USA Formaldehyd 37%, p.a., ACS, Rotipuran®
(Molekulargewicht 30,03 g/mol) Fa. Roth GmbH + Co, Karlsruhe HEPES, N-(2-Hydroxylethyl)piperazin-N’
(-ethan-sulfonsäure) Fa. Biochrom (L 1603), Berlin
Interleukin-8, human, rekombinant (72a.a.) Fa. Cell-Concept (C-2HG09-C), Umkirch Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat Fa. Roth (8175.1), Karlsruhe
Leukotrien B4
Fa. Cayman Chemical Company (20110), Ann Arbor, USA
N-Formyl-L-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenyl-
alanin (fMLP, MW:324,4 g/mol) Fa. Sigma (F-8506), Deisendorf Natriumazid, NaN3, >99%, reinst
(MW: 65,01 g/mol) Fa. Merck (6688), Darmstadt
Natriumchlorid Fa. Roth (9265.2), Karlsruhe
Natriumhydroxyd-Pellets, wasserfrei Fa. Sigma (S5881), Deisenhofen Natriumhypochlorit-Lösung 12% Fa. Roth (9062), Karlsruhe Omnisorbin® Cells (hitzeinaktivierte
Streptococcus sp.)
Fa. Calbiochem-Novabiochem GmbH (496250), Bad Soden/Taunus
Paraformaldehyd Fa. Sigma (P6148), Deisenhofen
PBS Dulbecco, Instant (9,55 g/l,
phosphatgepufferte Salzlösung) Fa. Biochrom (L-182-10), Berlin Penicillin-Streptomycin (10000 U/ml u. 10
mg/ml )
Fa. PAN Biotech GmbH (P06-07100), Aidenbach
Percoll® Fa. Pharmacia (17-0891-01), Freiburg
PMA, Phorbol-12-Myristat-13-Acetat Fa. Sigma (P-8139), Deisenhofen
Propidiumjodid Fa. Calbiochem-Novabiochem GmbH
(537059), Bad Soden/Taunus RPMI 1640-Medium (Trockensubstanz) Fa. Biochrom KG (T121-10), Berlin
Trockenbackhefe Fa. Dr. Oetker, Bielefeld
Trypanblau Fa. Biochrom (L-6232), Berlin
Türk’sche Lösung (Essigsäure-Gentiana-
Violettlösung) Fa. Merck (9277), Darmstadt
3.1.3 Lösungen, Medien und Puffer FITC-Puffer
Na2CO3
NaCl
Aqua tridest.
HCl (37%ig) FITC
1,06 g 0,59 g ad 100 ml ad pH 9,2
15 mg Natriumchloridlösung, 0,9%
NaCl
Aqua tridest. 8,77 g ad 1000 ml Phosphatpuffer (PBS/ 2fach PBS)
NaCl
Na2HPO4 x H2O KH2PO4
KCL
Aqua tridest.
8 g /16 g 1,24 g /2,48 g 0,2 g /0,4 g 0,2 g /0,4 g ad 1000 ml/1000 ml PBS mit 1% BSA und 0,01% NaN3
(MIF-Puffer) BSA
NaN3
PBS
1,0 g 0,01 g ad 100 ml
Medien für Zellkulturarbeiten
Zellkulturmedium R0- RPMI 1640 mit HEPES-Puffer 15 mmol/l, L- Glutamin 2 mmol/l, NaHCO3 18 mmol/l, ohne Antibiotika
Zellkulturmedium R0+ R0- mit Zusatz von G-Penicillin (100 IU/ml) und Streptomycin (100 µg/ml)
Fetales Kälberserum (FCS) FCS wurde bei 56°C für 60 min im Wasserbad komplement- und mykoplasmeninaktiviert.
Die Lagerung erfolgte bei -20°C.
Zellkulturmedium R3F- R0- mit Zusatz von FCS (3% v/v)
Zellkulturmedium R3F+ R3F- mit Zusatz von G-Penicillin (100 IU/ml) und Streptomycin (100 µg/ml)
3.1.4 Induktor der Leukozyteneinwanderung in den Uterus
Um die Leukozyteneinwanderung in den Uterus der Versuchsstuten zu stimulieren, wurde humanes rekombinantes Interleukin 8 (rhIL-8; s. 3.1.2) eingesetzt. Bei rhIL-8 handelt es sich um ein nicht-glykolisiertes Protein mit einer molaren Masse von 8,4 kDa, bestehend aus 72 Aminosäuren (72 a.a.). Eine Variante stellt ein am Aminoterminus um 5 Aminosäuren erweitertes Protein (77 a.a.) dar. Das 72-a.a.-IL-8, die biologisch aktive Form, wird beim Menschen vorwiegend von Monozyten und Lymphozyten produziert, das 77-a.a.-IL-8 wird dagegen u.a. bei Endothelzellen gefunden.
Das lyophilisierte Zytokin wurde in PBS rekonstituiert und in einer Konzentration von 1 µg/ml unter Zusatz von BSA (0,05%) in aliquoten Teilen zu 100 und 200 µl bei -20°C gelagert. Für die Verwendung am Tier wurde eine Konzentration von 10 und 25 ng rhIL-8/ml Trägermedium (PBS) gewählt. Dafür wurden die benötigten Aliquots unmittelbar vor der Applikation aufgetaut und in 50 ml PBS (s. 3.1.2) aufgenommen.
3.1.5 Materialien für die Separation und Differenzierung von Leukozyten Acridinorange-Ethidiumbromid
Die bei 4°C gelagerte Gebrauchslösung enthält 2,5 mg Acridinorange und 2,5 mg Ethidiumbromid, die in 1000 ml PBS mit 0,02% Natriumazid gelöst werden (alle Einzelsubstanzen s. 3.1.2). Sie wird zur Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung eingesetzt (s.
3.2.3).
TÜRK’sche-Lösung
Zur Bestimmung der Leukozytenkonzentration im Blut (s. 3.2.3) wurde TÜRK’sche-Lösung (Gentianaviolett 20 mg, Essigsäure 6,5 ml, Aqua dest. ad 100 ml, s. 3.1.2) eingesetzt.
WRIGHT-Lösung
WRIGHT-Lösung (s. 3.1.2) wurde, wie bezogen, zur Anfertigung von Differentialblutbildern (s. 3.2.4) verwendet.
Trypanblau-Lösung
Zur Färbung von separierten Leukozyten (s. 3.2.5) wurde eine 0,1%ige (v/v) Trypanblau- Lösung (s. 3.1.2) mit PBS verwendet.
Percoll
Dabei handelt es sich um Sol aus Silikapartikeln, die mit Polyvinyl-Pyrrolidon beschichtet sind. Percoll hat ein spezifisches Gewicht von 1,130 g/ml bei 20°C. Die Herstellung einer isotonen Percoll-Lösung erfolgte durch Zusatz von 840 mg NaCl zu 100 ml Percoll. Mit einem Osmometer wurde die Isotonie überprüft. Mit steriler 0,9%iger NaCl-Lösung (s.
3.2.4.3) wurden eine 55%ige und eine 78%ige Percoll-Lösung hergestellt.
3.1.6 Materialien für die Durchflusszytometrie Aqua tridest. und Natriumhypochlorit
Sterilfiltriertes Aqua tridest. (Porengröße des Sterilfilters: 0,2 µm, s. 3.1.2) und 1%ige Natriumhypochlorit-Lösung (s. 3.1.2) wurden zur Spülung und Reinigung des Messkanalsystems innerhalb des Durchflusszytometers verwendet.
Trägermedium zur Messung („Sheath fluid“)
Anstelle des kommerziell erhältlichen Trägermediums wurde sterilfiltriertes (bakteriendichter Filter, Porenweite 0,22 µm) PBS (s. 3.1.3) mit 0,1 g/l Natriumazid (s. 3.1.2) verwendet.
Propidiumjodid
Das Fluorochrom Propidiumjodid (PJ; s. 3.1.2) interkaliert mit doppelsträngiger DNA membrandefekter Zellen. Das Emissionsmaximum des Farbstoffes liegt bei 639 nm. PJ dient der Einschätzung der morphologischen Integrität der Zellen und damit ihrer Vitalität. Die kristalline Grundsubstanz wurde in PBS (100 µg/ml) gelöst. Die Gebrauchslösung lagerte in aliquoten Teilen zu 1 ml bei -20°C. Für durchflusszytometrische Messungen wurden 20 µl der Gebrauchslösung pro ml Zellsuspension verwendet, was einer Endkonzentration von 2 µg PJ/ml entspricht.
Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung
Als Referenzzellen wurden FITC-markierte (s. 3.1.2) bovine mononukleäre Zellen eingesetzt.
Diese wurden mit Hilfe eines Ficoll®-Dichtegradienten mit einer Reinheit von über 98% aus EDTA-Blut gewonnen. Nach hypotoner Lyse und zwei Waschgängen mit PBS (jeweils 300 x g, 8 min, 4°C) wurde die Zellsuspension mit mAk Bo1 (s. 3.1.7; 500 µl unverdünnte Lösung) versetzt und für 30 min bei 4°C inkubiert. Nun folgten drei weitere Waschgänge (jeweils 300 x g, 8 min, 4°C) mit MIF-Puffer (s. 3.1.3) und eine weitere Inkubation bei 4°C für 30 min mit dem FITC-konjugierten von Ziegen gewonnenen Antikörper gegen Mäuse-Immunglobuline („Ziege-Anti-Maus-Antikörper“; s. 3.1.7). Nach weiteren drei Waschgängen (s. oben) wurden die Zellen mit 4%igem Paraformaldehyd 12 – 24 Stunden fixiert. Nach der Fixierung wurden die Zellen dreimal mit MIF-Puffer gewaschen und dann in einer Endkonzentration von 0,8 - 10 x 105 Zellen/100µl Sheath-fluid-PJ-Lösung (2 µg PJ/ml Sheath fluid; s. 3.1.2) bei 4°C lichtgeschützt gelagert.
3.1.7 Materialien für die indirekte Membranimmunfluoreszenz Monoklonale Antikörper
Für die indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF; s. 3.2.8) sind als Primärantikörper monoklonale Antikörper (mAk) verwendet worden (Herkunft, Spezifität und Gebrauchsverdünnung der mAk sind aus Tabelle 2 zu entnehmen). Als Sekundärantikörper für die indirekte MIF dienten „Ziege-anti-Maus“-IgG und -IgM (schwere und leichte Ketten)
