Gewinnung und Isolierung uteriner Leukozyten Gewinnung von PMN aus dem Uterus

Aufgrund der Ergebnisse von in-vitro-Voruntersuchungen verschiedener chemotaktischer Substanzen bezüglich ihrer Kapazität, eine Migration equiner PMN zu induzieren, wurden PMN mit folgender Methodik in den Uterus der Versuchstiere gelockt:

Die Prozedur verlief in Anlehnung an das Embryotransferverfahren unter keimarmen Bedingungen. Ein Spülkatheter (Modell Neustadt a.d. Aisch, s. 3.1.2) wurde per vaginam eingeführt und nach der Zervixpassage in den Corpus uteri vorgeführt. In der Zervix wurde der Katheter mittels eines aufblasbaren Gummiballons fixiert, wodurch gleichzeitig ein Rückfluss von Spülflüssigkeit verhindert wurde. Die erste Spülung mit etwa 50 ml PBS (Nullspülung) diente der Feststellung des Zellgehaltes und einer eventuellen bakteriellen Kontamination des Uterus vor Applikation der chemoattraktiven Substanz. Die Spülflüssigkeit wurde mittels einer 60-ml-Spritze über den Katheter mit moderatem Druck in den Uterus gegeben. Über das Rektum wurde der Uterus manuell massiert, und die durch den

Katheter zurückfließende Flüssigkeit wurde in sterilen Polypropylenröhrchen aufgefangen.

Auf diese Weise konnte die Spülflüssigkeit nahezu vollständig zurückgewonnen werden, ohne dass eine stärkere Irritation des Endometriums durch ein „Ansaugen“ des Katheters entstand. Anschließend wurden 50 ml der chemoattraktiven Substanz, rekombinantes humanes Interleukin 8 (rhIL-8, s. 3.1.4), in einer Konzentration von 10 oder 25 ng/ml in 50 ml PBS in den Uterus gegeben.

Die Gewinnung der eingewanderten Leukozyten erfolgte 3, 6 und 24 Stunden nach der rhIL-8-Applikation nach dem Prinzip der Nullspülung. Die Probenröhrchen wurden nach Füllung auf Eis gelagert.

Vor und nach Durchführung der Uterusspülungen wurden die Versuchstiere klinisch und gynäkologisch untersucht. Der für die Aufzeichnung gynäkologischer Untersuchungsbefunde verwendete Schlüssel ist im Anhang 1 abgedruckt.

Isolierung der Uterus-PMN

Der Leukozytengehalt der zurückgewonnenen Spülflüssigkeit wurde sowohl mittels Zählkammer und Mikroskop als auch über Durchflusszytometrie und Referenzzellmethode bestimmt (s. 3.2.3). Anschließend wurden eventuelle Verunreinigungen der Suspension (Schleimhautteile, Uterusschleim) mit einer sterilen Absaugpipette entfernt und die Röhrchen zentrifugiert (140 x g, 8 min). Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen resuspendiert und noch zweimal mit PBS gewaschen. Schließlich wurden sie in Medium (R3F⁺) resuspendiert und auf 2 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt.

3.2.7 Durchflusszytometrie

Das Durchflusszytometer (s. 3.1.1) bietet die Möglichkeit, große Zellzahlen schnell und empfindlich bezüglich mehrerer Charakteristika auszuwerten. Das Gerät besteht aus einen Sensormodul als Tischmodell zur Messung optischer Eigenschaften von Zellen und anderen Partikeln sowie einem Rechner zur Datenerfassung, -analyse und -verwaltung. Das Gerät arbeitet nach folgendem Prinzip:

Die Zellen müssen als Einzelzellsuspension vorliegen. Diese wird durch Überdruck aus dem Probenröhrchen über eine Stahlkapillare in die Messküvette eingeführt. Beim Eintreten in die Messkammer werden die Zellen in der sie umgebenden Trägerflüssigkeit (Sheath fluid, s.

3.1.6.1) stark beschleunigt, wodurch Aggregate aufgetrennt und die Zellen aneinandergereiht werden. Damit wird erreicht, dass jede Zelle einzeln einen fokussierten Laserstrahl passiert.

Bei der Passage des Laserstrahles verursacht jede Zelle eine Lichtbeugung, die entsprechend der Zellmorphologie (Größe und Granularität/Komplexität) als Streulichtsignale von Lichtdetektoren in 1.024 Kanälen pro Parameter registriert werden. Das sogenannte Vorwärtsstreulicht („forward scatter“=FSC) verhält sich proportional zur Größe der Zellen, das Seitwärtsstreulicht („side scatter“=SSC) dagegen gibt Informationen über die intrazelluläre Beschaffenheit (Granularität) sowie über die Oberflächenstruktur der Zelle (Komplexität).

Trifft der Laserstrahl auf zusätzlich fluorochrommarkierte Partikel, so werden diese bei geeignetem Fluorochrom durch die Energie des einfallenden Lichtes angeregt und emittieren Photonen einer für jedes Fluorochrom typischen Wellenlänge. Für verschiedene Wellenlängen sensitive Lichtdetektoren registrieren diese Fluoreszenzsignale. Die Fluoreszenzintensität ist ein relatives Maß der Lichtquantenzahl einer Wellenlänge. Das zur Verfügung stehende Gerät hat einen Messbereich für die Grünfluoreszenzintensität (FL-1 : Wellenlänge 530 nm +/- 15 nm) und Messbereiche für die Orange- und Rotfluoreszenzintensität (FL-2: Wellenlänge 585 nm +/- 21 nm; FL-3: > 650 nm). Die Fluoreszenzintensität wird logarithmisch verstärkt und auf einer linearen Skala mit 1.024 Kanälen, die 4 Log-Dekaden (0-10.000) entspricht, dargestellt. Bei entsprechender Markierung können somit 5 verschiedene Eigenschaften (2x Morphologie, 3x Fluoreszenz) simultan gemessen werden.

Die zum Gerät gehörige Computereinheit mit Software (WinMDI; TROTTER 1998) ermöglicht eine gezielte Auswertung der Messungen mit Hilfe der Zweiparameterdarstellung.

Jeder der fünf beschriebenen Parameter kann mit einem anderen korreliert werden. Die Intensitätsachsen (lineare oder logarithmische Skalen) der beiden Parameter werden gegeneinander aufgetragen, und in die so gebildete Matrix wird jeweils dort ein Punkt eingezeichnet, an der sich die Intensitätswerte beider Parameter schneiden. Die Darstellungsart wird als korrelierte Zweiparameterdarstellung oder als Punktdiagramm („Dot plot“; s. Abb. 1) bezeichnet. Im Kontur-Diagramm wird im Gegensatz zum Punktdiagramm

nicht jedes gemessene Ereignis dargestellt, sondern eine definierte Anzahl von Ereignissen wird von Linien umfasst (s. Abb. 1). Dabei begrenzen periphere Linien meist niedrige Ereigniszahlen, zentrale Linien dagegen hohe Ereigniszahlen. Eine andere Darstellungsform ist das Histogramm (Einparameterdarstellung). Im Histogramm bezeichnet die horizontale Achse einen Parameter in 1.024 Kanälen und die vertikale Achse die Anzahl der Zellen je Kanal.

Die Software ermöglicht auch eine separate Auswertung von Zellsubpopulationen aus einem gemischten Probenansatz. In einen „Dot plot“ können bestimmte Areale definiert („gefenstert“) und gesondert analysiert werden. Zum Vergleich von Fluoreszenzverteilungen (z.B. mittlere Fluoreszenzintensität verschiedener Zellpopulationen) werden lineare Werte (0-10.000) herangezogen.

Durchflusszytometrische Leukozytendifferenzierung

Die einzelnen Leukozytenpopulationen unterscheiden sich morphologisch in ihrer Größe und Komplexität. Die Monozyten sind im Durchschnitt die größten Zellen. Granulozyten und Lymphozyten überschneiden sich zwar in ihrer Größenverteilung, weisen jedoch eine unterschiedliche Komplexität auf. Mit Hilfe der Streulichtsignale sind somit Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten unterscheidbar (s. Abb. 1)

Abb. 1: Durchflusszytometrische Darstellung equiner Leukozyten:

Punktdiagramm („Dot plot“) und Konturdiagramm („Contour plot“)

In beiden Abbildungen werden die morphologischen Eigenschaften der Leukozyten miteinander korreliert. FSC entspricht der Zellgröße und SSC der Zellkomplexität.

In der linken Teilabbildung ist ein Punktdiagramm einer gemischten Leukozytenpopulation dargestellt (G:

Granulozyten; M: Monozyten; L: Lymphozyten). Jeder Punkt entspricht einem durchflusszytometrisch analysierten Partikel. Die rechte Teilabbildung zeigt ein Konturdiagramm der identischen Leukozytenpopulation.

Jede Linie umfasst einen Bereich mit einer definierten Zelldichte.

Durchflusszytometrische Vitalitätsbeurteilung

Zur Einschätzung der morphologischen Integrität von Zellen eignet sich auch die Durchflusszytometrie. Geschädigte Zellen unterscheiden sich in Größe und Komplexität.

Außerdem können Zellen mit Defekten der Plasmamembran mittels Propidiumjodid (s. 3.1.6) nachgewiesen werden. Dieses Fluorochrom dringt nur durch defekte Membranen in die Zelle ein und interkaliert mit der DNA-Doppelhelix. Mit Hilfe der Fluoreszenzsignale im orangen oder roten Bereich (FL-2 oder 3) sind die Zellen mit defekter Membran von denen mit intakter differenzierbar.

0 1023

0 1023

0 1023

Seitwärtsstreulicht (SSC)

Vorwärtsstreulicht (FSC) G

M

L L

M G