Induktion eines reproduzierbaren Leukozyteneinstroms in den endometriumgesunden Uterus von Stuten

Um die Wirksamkeit von intrauterin appliziertem rhIL-8 auf eine PMN-Immigration grundlegend abschätzen zu können, wurde es zunächst in einer Konzentration von 25 ng/ml nur zwei Tieren verabreicht und mit dem Infusionseffekt der Trägersubstanz PBS ohne rhIL-8 bei zwei weiteren Tieren verglichen (s. 4.2.1). Bereits die intrauterine Verabreichung von 50 ml PBS führte zu einer Leukozyteneinwanderung in den Uterus (durchschnittlich 3,6 x 10⁶ Leukozyten/Spülung), was etwa Beobachtungen anderer Untersucher entspricht (KOTILAINEN et al. 1994). Wurden allerdings 25 ng rhIL-8/ml auf 50 ml PBS intrauterin appliziert, so konnte die Anzahl der in den Uterus migrierten Leukozyten um den Faktor 80 gesteigert werden. Der PMN-Anteil in der Spülflüssigkeit betrug >95% (PBS) und >99%

(rhIL-8). Auch wenn aufgrund der eingesetzten kleinen Tierzahl keine statistische Signifikanz zu erreichen war, so deuteten die Ergebnisse bereits an, dass rhIL-8 in der Lage sein würde, effektiv PMN in das Uteruslumen zu locken. Somit war sein Einsatz bei zusätzlichen Versuchstieren gerechtfertigt.

Ziel des folgenden Entwicklungsschrittes war es, mit möglichst geringem Tierversuchsumfang notwendige Informationen für das Endometritismodell zu erhalten.

Neben der rhIL-8-Konzentration von 25 ng/ml sollten auch 10 ng/ml in vivo untersucht werden, da dies in vitro einen noch relativ starken Transmigrationseffekt lieferte (s. 4.1.4.3), andererseits aber mögliche funktionelle Nebeneffekte bei den PMN minimieren könnte. Zur Ermittlung des optimalen Zeitpunktes zur Gewinnung uteriner Granulozyten, wurden die Stuten 3, 6, und 24 h nach rhIL-8-Stimulation gespült.

Nach dem Einsatz von 25 ng rhIL-8/ml in 50 ml PBS konnten bei 4 histologisch und bakteriologisch uterusgesunden Stuten nach 6 h durchschnittlich etwa 5,7 x 10⁸ Leukozyten mit einem PMN-Anteil von mehr als 99% aus dem Uteruslumen isoliert werden. Mit 10 ng rhIL-8/ml waren es durchschnittlich 1,4 x 10⁸ Leukozyten. Diese Zellmengen entsprechen den Beobachtungen anderer Untersucher, die nach experimenteller Infektion mit Sc.

zooepidemicus etwa 1 x 10⁸ bis 1 x 10⁹ PMN (LIU et al. 1986) und nach intrauteriner Applikation von 1%igem Austernglykogen etwa 1-5 x 10⁸ PMN (TROEDSSON et al. 1990)

aus dem Uterus gewinnen konnten. Darüber hinaus war zu den drei gewählten Spülzeitpunkten (3, 6 und 24 h) ein glockenkurvenartiger Verlauf der PMN-Gewinnung auszumachen: Anfangs war ein Anstieg der Anzahl uteriner PMN von 0 über 3 bis 6 h nach Stimulation und daraufhin ein Abfall nach 24 h zu vermerken. Damit entspricht der Verlauf nach rhIL-8-Applikation etwa den Beobachtungen zum PMN-Influx, die nach Besamung (KATILA 1995) oder experimenteller bakterieller Infektion (WILLIAMSON et al. 1987) gemacht werden konnten.

Über die Ursachen dieser Kinetik können folgende Vermutungen angestellt werden: Bei den Untersuchungen zur rhIL-8-induzierten in-vitro-Transmigration wanderten bereits nach 2 h die meisten PMN zum Ort des Chemokins (s. 4.1.4.5). Hier handelt es sich jedoch um einen direkten Effekt. Es ist anzunehmen, dass bei Applikation in den Uterus rhIL-8 erst resorbiert wird, um dann zeitverzögert auf die zirkulierenden PMN wirken zu können. Außerdem ist es denkbar, dass rhIL-8 nach einem kaskadenartigen Prinzip im Endometrium lokalisierte Zellen (Leukozyten, Epithelzellen) aktiviert und die zirkulierenden PMN erst durch deren Sekretionsprodukte zur Immigration in den Uterus bewegt werden. Für die letzte Hypothese spricht, dass es schon nach PBS-Infusion zu einem wenn auch deutlich schwächeren PMN-Influx in den Uterus kommt. Das ist ein Indiz dafür, dass zumindest bei der rossigen Stute neutrophile Granulozyten vermehrt in der Gebärmutterschleimhaut lokalisiert sind, die auf einen adäquaten Reiz hin aktiviert und/oder relativ schnell ins Uteruslumen migrieren können.

Der Abfall der PMN-Anzahl von 6 h nach 24 h kann verschiedene Ursachen haben: Möglich ist, dass der PMN-Influx etwa 6 h nach initialem Reiz sein Maximum erreicht hat und anschließend abschwächt. Darüber hinaus könnte es zu einem Verlust uteriner PMN durch rossebedingte sekretorische Aktivität des Endometriums und Ausfluss über die Zervix gekommen sein. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass die PMN im Uterus desintegrieren und nicht mehr nachweisbar sind.

Die Ausbeute der Uterusspülungen schwankte interindividuell und zu allen Spülzeitpunkten recht stark (s. 4.2.2). Eine Ursache dafür kann eine individuell unterschiedliche Ansprechbarkeit auf das Zytokin sein. Allerdings müssen auch andere mögliche Einflussfaktoren berücksichtigt werden. So kann mit einem Verlust der applizierten rhIL-8-Lösung über die Zervix gerechnet werden, oder die rhIL-8-rhIL-8-Lösung kann aufgrund der Sekretionsaktivität des Endometriums oder durch zurückgebliebene Anteile der Nullspülung

in unterschiedlichem Maße verdünnt werden. Bei den durchgeführten Spülungen konnte nicht in jedem Fall die in den Uterus eingebrachte Flüssigkeit komplett zurückgewonnen werden.

Außerdem muss bedacht werden, dass die PMN untereinander aggregieren oder aber an der Schleimhaut sowie an den Probengefäßen unterschiedlich stark adhärieren und sich somit einer genaueren Quantifizierung entziehen. Eine Interpretation der Quantität uteriner PMN in den Spülproben sollte daher vorsichtig erfolgen.

In den Uterusspülproben konnte nach wiederholten Spülungen zunehmend eine bakterielle Kontamination ausgemacht werden (s. 4.2.4). Während die „Nullspülungen“ bakteriologisch negativ waren, wurde nach 3 h in einer von zehn, nach 6 h in vier von 15 und nach 24 h in vier von zehn Spülproben ein geringgradiger unspezifischer Keimgehalt nachgewiesen.

Dieser wurde als unbedeutend eingeschätzt, da es sich um keine nach derzeitigem Kenntnisstand uteruspathogenen Keime handelte und zudem kein Zusammenhang zur uterinen Leukozytenzahl bestand. Diese Beurteilung ist übereinstimmend mit vorhergehenden Untersuchungen (KOTILAINEN 1994). In einer 24-h-Spülprobe wurde ein hochgradiger Keimgehalt diagnostiziert, der zum Ausschluss des Tieres aus den Experimenten führte.

Allerdings ist der Umstand einer wenn auch nur geringfügigen bakteriellen Kontamination der Spülflüssigkeit als Mangel des Endometritismodells zu sehen. Um dem vorzubeugen, wurde bei der Manipulation der Spülkatheter im Untersuchungshandschuh geschützt bis zur Zervix vorgeschoben, sowie die Auffangröhrchen während der Spülung weitgehend gegen sekundäre Kontamination außerhalb des Tieres abgeschirmt. Hier wird die größte Kontaminationsgefahr vermutet.

Mit rhIL-8 wurde eine chemisch definierte Substanz für die Infusion in den Uterus identifiziert, die bei allen untersuchten Stuten zuverlässig einen PMN-Einstrom in das Uteruslumen bewirkte. Die Zellzahlen, die 6 h nach Stimulation mit 25 ng rhIL-8/ml in 50 ml PBS gewonnen wurden, sind mit denen einer experimentellen bakteriellen Infektion vergleichbar und gewährleisten umfangreiche nachfolgende in-vitro-Analysen. Nach der letzten Uterusspülung entnommene Uterusbioptate zeigen zudem, dass die rhIL-8-Infusion verhältnismäßig gewebsschonend ist. Unabhängig von der rhIL-8-Konzentration (0-25 ng/ml) kam es in allen Fällen zu einer geringgradigen akuten Endometritis, die schon nach 24 h

wieder zurückging, wie die abnehmenden Zellzahlen in den entsprechenden Spülproben belegen.

5.2.3 Vergleichende Untersuchung von neutrophilen Granulozyten aus Blut