Endokrinologie im Zentrum f¨ ur Lebensmittelwissenschaften der Tier¨ arztlichen Hochschule Hannover
und dem Forschungsbereich Fortpflanzungsbiologie des Forschungsinstituts f¨ ur die Biologie landwirtschaftlicher
Nutztiere, Dummerstorf
Auswirkungen einer GnRH-Analogon-Applikation post inseminationem auf LH- und Progesteronkonzentrationen und
Tr¨ achtigkeitsrate bei der Stute
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterin¨ armedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tier¨ arztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Claudia Unger (geb. Gilges) aus D¨ usseldorf
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. H.-O. Hoppen VR PD Dr. W. Kanitz, Dummerstorf
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. H.-O. Hoppen
2. Gutachter: Prof. Dr. A.-R. G¨unzel-Apel
Tag der m¨undlichen Pr¨ufung: 17. November 2003
1 Einleitung 11
2 Literatur 13
2.1 Aspekte der sexuellen Saisonalit¨at und Zyklusphasen bei Stuten . . . 13
2.1.1 Sexuelle Saisonalit¨at der Stute . . . 13
2.1.2 Definition der Zyklusphasen . . . 13
2.2 Endokrine Regulation des Sexualzyklus . . . 14
2.2.1 Allgemeines . . . 14
2.2.2 Endokrine Regulation von Follikelwachstum, Follikelreifung und Ovu- lation . . . 14
2.2.2.1 Follikelentwicklung im Verlauf des Zyklus . . . 14
2.2.2.2 Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH): Struktur, Se- kretion und Wirkungen . . . 16
2.2.2.3 Equine Gonadotropine: Struktur, Sekretion und Wirkungen 19 2.2.2.4 Steroide und Inhibin: Struktur, Sekretion und Wirkungen 24 2.2.3 Endokrine Regulation der Corpus luteum-Funktion . . . 28
2.2.3.1 Allgemeines . . . 28
2.2.3.2 Zellpopulationen im Corpus luteum . . . 28
2.2.3.3 Beeinflussung der Lutealfunktion . . . 30
2.2.3.4 Luteolyse . . . 30
2.3 Aspekte der Fr¨uhgravidit¨at bei Stuten . . . 34
2.3.1 Erkennung der Fr¨uhgravidit¨at . . . 34
2.3.2 Fr¨uhembryonale Verluste . . . 36
2.4 Versuche zur Beeinflussung fr¨uhembryonaler Verluste mittels GnRH . . . . 38
2.4.1 Buserelin . . . 38
2.4.2 Versuche an Rindern . . . 38
2.4.3 Versuche an Pferden . . . 40
3 Eigene Untersuchungen 42 3.1 Material und Methoden . . . 42
3.1.1 Allgemeines . . . 42
3.1.2 Versuchstiere . . . 42
3.1.3 Versuchsdurchf¨uhrung . . . 43
3.1.3.1 Versuchsreihe A . . . 43
3.1.3.2 Versuchsreihe B . . . 44
3.1.3.3 Probenaufbereitung . . . 46
3.1.4 Bestimmung von Progesteron . . . 46
3.1.5 Bestimmung von LH . . . 47
3.1.6 Statistische Auswertung . . . 47
3.2 Ergebnisse . . . 48
3.2.1 Versuchsreihe A . . . 48
3.2.1.2 Ergebnisse der Tr¨achtigkeitsdiagnostik . . . 49
3.2.2 Versuchsreihe B . . . 51
3.2.2.1 Ergebnisse der Progesteron-Analytik . . . 51
3.2.2.2 Ergebnisse der LH-Analytik an den Zyklustagen 9–11 . . . 52
3.2.2.3 Ergebnisse der Tr¨achtigkeitsdiagnostik . . . 56
4 Diskussion 58 4.1 Zielsetzung der eigenen Arbeit . . . 58
4.2 Versuchsreihe A . . . 59
4.2.1 Ergebnisse der Progesteronanalytik . . . 59
4.2.2 Ergebnisse der Tr¨achtigkeitsdiagnostik . . . 59
4.3 Versuchsreihe B . . . 61
4.3.1 Ergebnisse der Progesteronanalytik . . . 61
4.3.1.1 Progesteronkonzentrationen an den Zyklustagen 0–8 . . . 61
4.3.1.2 Progesteronkonzentrationen an den Zyklustagen 9–11 . . . 61
4.3.2 Ergebnisse der LH-Analytik . . . 62
4.3.2.1 LH-Konzentrationen am Zyklustag 9 . . . 62
4.3.2.2 LH-Konzentrationen am Zyklustag 10 . . . 62
4.3.2.3 LH-Konzentrationen am Zyklustag 11 . . . 63
4.3.3 Ergebnisse der Tr¨achtigkeitsdiagnostik . . . 63
4.4 Gesamtbetrachtung der Hormonanalysen . . . 64
5 Zusammenfassung 65
6 Summary 68
7 Anhang 92
ATP Adenosintriphosphat BIO In-Vitro-Bioassay
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat DG Diacylglycerol
E2 Ostradiol, 17β- ¨¨ Ostradiol eCG equines Choriogonadotropin eLH equines Luteinisierendes Hormon FSH Follikelstimulierendes Hormon GDP Guanosindiphosphat
GnRH Gonadotropin Releasing Hormon G-Protein Guanylnucleotidbindungsprotein GTP Guanosintriphosphat
hCG humanes Choriogonadotropin
hFSH humanes Follikelstimulierendes Hormon i. m. intramuskul¨ar
IP3 Inositoltriphosphat LH Luteinisierendes Hormon
LSMEAN Mittelwert, arithmetisches Mittel µg Mikrogramm (10−6 Gramm)
MHz Megahertz
min Minute
ml Milliliter (10−3 Liter) mm Millimeter (10−3 Meter) µm Mikrometer (10−6 Meter) mRNA messenger Ribonucleins¨aure
ng Nanogramm (10−9 Gramm) pg Pikogramm (10−12 Gramm) PGF2α Prostaglandin F2α
PGFM 13,14-Dihydro-15-Keto-Prostaglandin F2α
PIP2 Phosphatidylinositolbiphosphat rFSH FSH der Ratte
RIA Radioimmunoassay rLH LH der Ratte SEM Standardfehler
TSH Thyreostimulierendes Hormon
U Umdrehungen
VK Variationskoeffizient
ZfdP Zuchtverband f¨ur deutsche Pferde
1 Einleitung
In der Pferdezucht sind fr¨uhembryonale Verluste ein Hauptfaktor f¨ur Subfertilit¨at bei Stu- ten, und die dadurch verminderte Reproduktionsleistung der Zuchtstuten ist von großer z¨uchterischer und enormer wirtschaftlicher Bedeutung. Als m¨ogliche Ursachen f¨ur eine fr¨uhembryonale Sterblichkeit kommen maternale, embryonale sowie exogene Faktoren in Betracht.
Seitens der maternalen Einflussfaktoren ist besonders die Progesteronsynthese bedeut- sam. Fraglos ist luteales Progesteron essentiell f¨ur viele Mechanismen, die im Zusam- menhang mit der Fr¨uhtr¨achtigkeit stehen. So ist Progesteron beispielsweise notwendig f¨ur die Embryomobilit¨at. Die dadurch entstehenden Interaktionen zwischen Embryo und Uterus stellen f¨ur den m¨utterlichen Organismus ein entscheidendes Signal zur Erkennung der Gravidit¨at dar. Progesteron wird im Corpus luteum synthetisiert. Die Regulation der Progesteronsynthese erfolgt ¨uber die Hormone Gonadotropin-Releasing Hormon (GnRH) und Luteinisierendes Hormon (LH). Das Corpus luteum und dessen Funktion m¨ussen ¨uber den Weg der Tr¨achtigkeitserkennung f¨ur die Fortsetzung der Gravidit¨at aufrecht erhalten werden.
Unter Ber¨ucksichtigung der genannten Aspekte erscheint die Beeinflussung der Progeste- ronsynthese durch ein GnRH-Analogon ein ¨uberpr¨ufenswerter Ansatz, um bei Vorliegen einer m¨oglichen Gelbk¨orperinsuffizienz bei der Stute das Corpus luteum durch eine der- artige Behandlung zu unterst¨utzen und damit den Anteil fr¨uhembryonaler Mortalit¨at zu reduzieren. Bei Rindern wurde in mehreren Untersuchungen gepr¨uft, ob durch Applikation von GnRH-Agonisten w¨ahrend der Lutealphase eine Verbesserung der Tr¨achtigkeitsrate zu erreichen ist. Die Arbeiten f¨uhrten zu widerspr¨uchlichen Ergebnissen (MACMILLAN et al., 1986; JUBB et al., 1990; SHELDON und DOBSON, 1993; DREW und PETERS, 1994;
RYAN et al., 1994; MANN et al., 1995; JAYAKUMAR und VAHIDA, 2000; PETERS et al., 2000). F¨ur das Pferd wurden bisher die Ergebnisse zweier Studien zur Thematik ver¨of- fentlicht (PYCOCK und NEWCOMBE, 1996; NEWCOMBE et al., 2001). Beide Studien wurden von einer Arbeitsgruppe durchgef¨uhrt. In beiden Publikationen wird ¨uber einen
12
positiven Einfluss einer GnRH-Applikation zwischen den Tagen 8 bis 12 nach Bedeckung auf die Tr¨achtigkeitsrate berichtet.
Da in den o. g. Arbeiten wesentliche Faktoren mit Einfluss auf die Tr¨achtigkeitsrate (Zucht- status der Stuten, Zeitpunkt der genutzten Rosse, Art der Spermakonservierung, Hengst) unber¨ucksichtigt blieben, und da dar¨uber hinaus keine Untersuchungen zur m¨oglichen Be- einflussung von Hormonkonzentrationen vorgenommen wurden, bestand das Ziel der ei- genen Arbeit in der Pr¨ufung des m¨oglichen Einflusses einer GnRH-Analogon-Applikation am 10. Tag post ovulationem auf die Tr¨achtigkeitsrate sowie bedeutsame endokrine Pa- rameter wie Progesteron und LH, um eine eventuelle Beeinflussung des Corpus luteums durch eine derartige Behandlung erkennen zu k¨onnen. In die biostatistische Auswertung der Daten sollten die genannten, ergebnisbestimmenden Faktoren einbezogen werden.
2 Literatur
2.1 Aspekte der sexuellen Saisonalit¨ at und Zyklusphasen bei Stuten
2.1.1 Sexuelle Saisonalit¨at der Stute
Stuten sind in aller Regel und in Abh¨angigkeit von der Tageslichtl¨ange saisonal-poly¨os- trisch. Dabei ist zwischen An¨ostrus (eingestellte zyklische Aktivit¨at der Ovarien) und der Phase der zyklischen Ovaraktivit¨at jeweils eine ¨Ubergangsphase zu beobachten. Der Zeit- punkt dieser ¨Ubergangsphase wird maßgeblich durch die Photoperiode bestimmt (SHARP, 1998). Zu beachten ist, dass zwischen Stuten erhebliche individuelle Unterschiede bez¨ug- lich des saisonal bedingten Beginns bzw. der Einstellung der zyklischen Ovaraktivit¨at bestehen k¨onnen. Auf welche Weise zu- und abnehmende Tageslichtl¨angen den Reproduk- tionsrhythmus von Stuten beeinflussen, ist noch nicht vollst¨andig gekl¨art. Als bewiesen gilt die Wahrnehmung von Lichtdauer und -intensit¨at durch Photorezeptoren der Retina und deren Weiterleitung ¨uber neuronale Bahnen an die Epiphyse. ¨Uber in der Epiphyse gebil- detes Melatonin werden Informationen an den Hypothalamus vermittelt, und nachfolgend wird die GnRH-Sekretion beeinflusst (KILMER et al., 1982; SHARP, 1988; CLEAVER et al., 1991; GINTHER, 1992).
2.1.2 Definition der Zyklusphasen
Der Zyklus der Stute erstreckt sich ¨uber einen Zeitraum von durchschnittlich 21 Tagen und l¨asst sich in Follikelphase und Lutealphase mit einer Dauer von f¨unf bis sieben Tagen bzw. 14 bis 15 Tagen einteilen. W¨ahrend des ¨Ostrus entwickelt sich der dominante Follikel und sezerniert als Hauptprodukt ¨Ostradiol. In der Lutealphase produziert der entstandene Gelbk¨orper (Corpus luteum) Progesteron. Mit der Luteolyse endet die Lutealphase.
14
2.2 Endokrine Regulation des Sexualzyklus
2.2.1 Allgemeines
Die hormonelle Steuerung der Fortpflanzung wird bei S¨augern durch einen komplexen Regelkreis zwischen Hypothalamus, Hypophyse und Gonaden reguliert. ¨Uber Feedback- mechanismen, in denen Peptid-, Glykoprotein- und Steroidhormone wichtige Schl¨ussel- faktoren sind, werden die verschiedenen Abschnitte des Sexualzyklus reguliert. ¨Uber den Hypothalamus und die Epiphyse (Glandula pinealis) stehen Stuten in einer funktionel- len Beziehung mit der Umwelt, da diese Organe endo- und exogene Signale empfangen und ¨uber die Hypophyse ihre Wirkung auf den Reproduktionstrakt vermitteln. Neben der neuroendokrinen Regulation des Sexualzyklus erfolgen auf lokaler Ebene regulatorische Prozesse ¨uber parakrine, autokrine und juxtakrine Mechanismen.
2.2.2 Endokrine Regulation von Follikelwachstum, Follikelreifung und Ovu- lation
2.2.2.1 Follikelentwicklung im Verlauf des Zyklus
Im Verlauf des Zyklus zeichnen sich Phasen einer verst¨arkten Follikelentwicklung, soge- nannte
”Follikelreifungswellen“ ab. Eine Follikelreifungswelle zeichnet sich durch die Pro- zesse der Rekrutierung (Zusammenstellung einer Gruppe von Follikeln, die nachfolgend in eine Follikelreifungswelle eingehen), der Selektion (Angleichung der Anzahl wachsender Follikel an die speziesspezifische Ovulationsanzahl) sowie der Dominanz (Unterdr¨uckung des Wachstums von Follikeln durch einen privilegierten Follikel) aus. Den Follikelrei- fungswellen zeitlich vorausgehende FSH-Konzentrationsanstiege sind f¨ur die Rekrutierung von Follikeln in eine Reifungswelle verantwortlich (BERGFELT und GINTHER, 1993;
GINTHER und BERGFELT, 1993). Unter sinkenden FSH- und zunehmenden LH-Kon- zentrationen kommt es nachfolgend zur Selektion eines dominanten Follikels, welcher sich
privilegiert und dann das Wachstum anderer Follikel hemmt. Im Rahmen der Privilegie- rung ist die Erh¨ohung der Inhibin- und ¨Ostradiolsynthese von Bedeutung (BERGFELT und GINTHER, 1985; GREMMES, 1990; BERGFELT et al., 1991; ROSER et al., 1994).
Hinsichtlich des wellenartigen Auftretens ovarieller Follikelpopulationen im Zyklus der Stute bestehen in der Literatur unterschiedliche Ansichten. So gehen EVANS und IRVINE (1975) in ihrem Modell von einer sich entwickelnden Follikelkohorte pro Zyklus, also ei- ner Gruppe ¨ahnlicher Follikel, aus. Unter Nutzung der transrektalen Sonographie konnten andere Autoren jedoch neben einer auch zwei Follikelreifungswellen pro Zyklus feststellen (PIERSON und GINTHER, 1987; SIROIS et al., 1989; BECKER et al., 1994; BURATINI et al., 1997). IRVINE (1981) sowie GINTHER und BERGFELT (1993) sind der Auffas- sung, dass beim Auftreten von zwei Follikelreifungswellen diese an den Zyklustagen 0–4 und 9–12 beginnen, wobei die Rekrutierung einer neuen Gruppe kleiner Follikel FSH-indu- ziert ist. Dabei erreicht eine Follikelkohorte an den Tagen 16–18 des Zyklus das LH-abh¨an- gige Entwicklungsstadium. Da zu diesem Zeitpunkt ausreichend LH verf¨ugbar ist, kann sich diese Follikelgruppe weiterentwickeln, wohingegen die andere Kohorte dieses Stadium bereits am 5.–7. Zyklustag erreicht und aufgrund unzureichender LH-Konzentrationen in dieser Zyklusphase atretisch wird. Liegt in einem Zyklus nur eine Follikelreifungswelle vor, so l¨asst sich nach BECKER et al. (1994) sowie RAUN und SYNNESTVEDT (1997) der dominante Follikel ab dem 12.–15. Zyklustag sicher erkennen. Beim Auftreten zweier Reifungswellen sind die jeweils dominanten Follikel der ersten bzw. zweiten Reifungswelle ab dem 7. bzw. 17. Tag des Zyklus zu identifizieren. Nach BECKER et al. (1994) und BURATINI et al. (1997) sind Zyklen mit zwei Follikelreifungswellen von l¨angerer Dauer (20–24 Tage) als solche mit nur einer Reifungswelle (Dauer 17–19 Tage).
16
2.2.2.2 Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH): Struktur, Sekretion und Wirkungen
Das Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) der S¨auger ist ein Dekapeptid des Hy- pothalamus, bestehend aus der Aminos¨auresequenz pGluc-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg- Pro-GlyNH2(MATSUO et al., 1971). W¨ahrend die Synthese des Hormons bei einigen Spe- zies auf ein Neuronennetzwerk in bestimmten Regionen des Hypothalamus beschr¨ankt ist, findet man beim Pferd eine relativ gleichm¨aßige GnRH-Verteilung im Hypothalamus. Die den Hypothalamus verlassenden GnRH-Axone gelangen haupts¨achlich zu den Kapillaren der Eminentia mediana. Dort werden die Sekretionsprodukte in terminale Granula eingela- gert (IRVINE und ALEXANDER, 1993a). Studien an Ratten und Schafen (DOMANSKI et al., 1980) sowie an Ponies (STRAUSS et al., 1979) best¨atigen die Eminentia media- na als Lokalisation hoher GnRH-Aktivit¨at und unterst¨utzen die Annahme, dass dies der wichtigste Ort zur GnRH-Akkumulation vor der Freisetzung in das Portalvenensystem ist (HART et al., 1984). Bei Depolarisation der GnRH-Neuronen wird GnRH freigesetzt und
¨uber das Portalvenensystem zur Hypophyse transportiert.
Die GnRH-Freisetzung erfolgt pulsatil. F¨ur die Regulation dieser pulsatilen Sekretion postuliert KNOBIL (1980) bei Affen einen Zeitgeber im Nucleus arcuatus des Hypothala- mus, der sich unabh¨angig von ¨außeren Einfl¨ussen regelm¨aßig entl¨adt. Dieser Schrittmacher scheint die große Anzahl der GnRH-Neurone zu synchronisieren (CALDANI et al., 1995).
Im saisonalen An¨ostrus, in der ¨Ubergangszeit und im Di¨ostrus zeigen Stuten eine unregel- m¨aßige GnRH-Sekretion mit zwischenzeitlichen Phasen, w¨ahrend derer GnRH nicht mess- bar ist. Im ¨Ostrus hingegen ist die Sekretion kontinuierlich (SHARP und GRUBAUGH, 1987).
Bei Stuten unterscheiden sich die Sekretionsmuster um den Zeitpunkt der Ovulation deut- lich von denen in der mittleren Lutealphase. In der Lutealphase herrscht eine niedrige Pulsfrequenz (1–3 Pulse pro Tag) mit hoher Amplitude und langer Pulsdauer vor, wo- hingegen w¨ahrend des Zeitraumes um die Ovulation die Frequenz hoch (2–5 Pulse pro
Stunde), die Peakdauer jedoch mit 5–7 Minuten gering ist (IRVINE und ALEXANDER, 1994; ALEXANDER und IRVINE, 1996).
Wichtigstes Zielorgan f¨ur GnRH ist die Adenohypophyse. Dort bewirkt es die Synthese und pulsatile Freisetzung der Gonadotropine LH und FSH in den Blutkreislauf. Vorausset- zung daf¨ur sind Pulsatilit¨at und eine niedrige, physiologische Konzentration des GnRH;
pharmakologisch dauerhaft erh¨ohte GnRH-Konzentrationen wirken hemmend auf die ge- nannten Prozesse (CONN, 1994; KANITZ et al., 2001).
Neben der Hypophyse gibt es weitere m¨ogliche Wirkungsorte. Beispielsweise existieren GnRH-Rezeptoren in den Gonaden von Ratte (CLAYTON et al., 1979; JONES et al., 1980) und Mensch (LATOUCHE et al., 1989), nicht aber in denen von Schaf, Rind und Schwein (BROWN und REEVES, 1983). Desweiteren lassen sich GnRH-Bindungsorte in der Nebenniere (EIDNE et al., 1985a), in Krebsgewebe (EIDNE et al., 1985b; FEKETE et al., 1989) sowie im ZNS (REUBI et al., 1987; JENNES et al., 1988; JENNES et al., 1990) nachweisen. Unklar ist allerdings, in welchem Umfang eine physiologische Wirkung durch die Besetzung von GnRH-Rezeptoren im peripheren Gewebe erzielt werden kann (BRADEN und CONN, 1991).
Der erste Schritt zur Stimulation der Gonadotropinsekretion ist die Bindung von GnRH an entsprechende Rezeptoren der basophilen gonadotropen Hypophysenvorderlappenzellen.
Diese Rezeptoren sind Plasmamembranproteine (MARIAN und CONN, 1983), besitzen ei- ne hohe Affinit¨at f¨ur GnRH und sind s¨attigbar (CLAYTON und CATT, 1981; MARIAN et al., 1981). Im Anschluss an die Rezeptorbindung des Liganden kommt es zur Aktivierung eines Guanylnucleotidbindungsproteins (G-Protein), welches dann die Phospholipase C aktivieren kann. Die aktivierte Phospholipase C hydrolysiert Phosphatidylinositolbiphos- phat (PIP2) zu Diacylglycerol (DG) und Inositoltriphosphat (IP3). DG und IP3 fungieren als second messenger. IP3 f¨uhrt zu einer Erh¨ohung der Kalziumfreisetzung, und durch DG wird die Ca2+-abh¨angige Proteinkinase C aktiviert. Die Proteinkinase C ist f¨ur die Synthese und auch f¨ur die Exozytose der Gonadotropine verantwortlich (NISWENDER, 1993).
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Ver¨anderungen in der Intensit¨at der GnRH-Signale spielen eine wichtige Rolle im Jahres- und im ovulatorischen Zyklus der Stute. Ist das GnRH-Signal unzureichend, um mehr als einen Gonadotropinpuls pro Tag auszul¨osen, bleibt die Stute im An¨ostrus. Induziert GnRH 2–4 Gonadotropinpulse pro Tag, ¨uberwiegt die FSH-Sekretion. Sind die GnRH- Pulse von ad¨aquater Frequenz und Gr¨oße zur Induktion von Gonadotropinpulsen mit Intervallen von zwei Stunden oder weniger, so dominiert die LH-Freisetzung (IRVINE und ALEXANDER, 1993a).
Die Mehrheit der GnRH- und Gonadotropinpulse tritt in zeitlicher ¨Ubereinstimmung auf. Einige GnRH-Pulse sind jedoch nicht von einer entsprechenden Gonadotropinsekre- tion begleitet. Die Funktion dieser
”ineffektiven“ GnRH-Pulse ist unklar. IRVINE und ALEXANDER (1993b) vermuten in ihnen eine Stimulation der Gonadotropinsynthese.
Die Amplitude der GnRH-Peaks korreliert positiv mit der in entsprechenden Peaks frei- gesetzten Gonadotropinmenge.
Neben der Gonadotropinfreisetzung aus der Hypophyse reguliert GnRH auch die Gonado- tropinbiosynthese, die Auf- und Abregulation der GnRH-Rezeptoren sowie deren Desen- sibilisierung, die GnRH-Rezeptorbiosynthese und die Produktion der mRNA f¨ur die Go- nadotropinuntereinheiten. Die vielf¨altigen Wirkungen des GnRH sind durch verschiedene intrazellul¨are second-messenger-Systeme gesteuert. Auf diese Weise stellen die Wirkungen des GnRH die F¨ahigkeit eines einzelnen Hormons dar, durch Nutzung nur eines Rezeptors in einem einzigen Zelltyp mehrere verschiedene intrazellul¨are Mechanismen zu aktivieren (BRADEN und CONN, 1991).
In einer Studie von PORTER et al. (1997) konnte f¨ur das Pferd eine Down-Regulation und Desensibilisierung der GnRH-Rezeptoren nicht festgestellt werden. ¨Uberdies wird bei Stuten im Vergleich zu anderen Spezies eine relative Resistenz gegen¨uber einer GnRH- Rezeptor-Downregulation angenommen (GARCIA und GINTHER, 1975; TURNER und IRVINE, 1992).
2.2.2.3 Equine Gonadotropine: Struktur, Sekretion und Wirkungen
Die equinen hypophys¨aren Gonadotropine luteinisierendes Hormon (LH) und follikelsti- mulierendes Hormon (FSH), deren Quelle die Adenohypophyse ist, z¨ahlen biochemisch zu den Glykoproteinhormonen und bestehen, wie auch eCG (equines Choriongonadotro- pin) und TSH (Thyreotropin), aus zwei Untereinheiten (α und β), die nicht-kovalent gebunden sind. W¨ahrend die α-Untereinheit speziesspezifisch und identisch bei den vier oben genannten Hormonen ist, ist dieβ-Untereinheit speziesspezifisch und dar¨uberhinaus spezifisch f¨ur die biologische Funktion des jeweiligen Hormons (PIERCE und PARSONS, 1981). Beide Untereinheiten werden in der Zelle separat synthetisiert, verbinden sich dann spontan und formen so das vollst¨andige Molek¨ul. Die α-Untereinheit wird im ¨Ubermaß produziert, wohingegen die Synthese der β-Untereinheit der limitierende Schritt in der Gonadotropinsynthese zu sein scheint. Dissoziierte Untereinheiten haben keine oder nur geringe biologische Aktivit¨at.
Trotz struktureller ¨Ahnlichkeit zeigen LH und FSH der meisten non-equinen S¨auger, wenn
¨uberhaupt, nur geringe Kreuzreaktivit¨at (ROSER et al., 1986). Equines LH bildet jedoch eine Ausnahme, da es sowohl wirksame LH- als auch intrinsische FSH-Aktivit¨at nach Injektion bei nicht-equinen Spezies zeigt. Im Gegensatz zu equinem LH zeigt LH von Esel bzw. Zebra diese intrinsische FSH-Aktivit¨at nicht (MATTERI et al., 1987).
Die equinen Gonadotropine LH und FSH bestehen zu ca. 24 % aus Kohlenhydraten, den Rest bilden Proteine. Hinsichtlich der Hormonaktivit¨at haben Kohlenhydrat- und Protein- anteile der Gonadotropine unterschiedliche Rollen. Der Polypeptid-Teil ist ausschließlich f¨ur die spezifische Membranrezeptorerkennung verantwortlich. Die Kohlenhydratanteile sind einerseits wichtig, um die Hormone in der Zirkulation zu halten, andererseits sind sie nach der Bindung an spezifische Rezeptoren direkt an der ¨Ubertragung der Hormonwir- kung durch die Zellmembran beteiligt (COMBARNOUS, 1988).
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Eine Besonderheit der equinen Gonadotropine ist deren hoher Sialins¨auregehalt. Unter- schiedliche Sialinisierungsgrade der Kohlenhydrat-Seitenketten resultieren in einer He- terogenit¨at der Gonadotropine, weshalb sich die Isoformen des eLH und eFSH in ih- rer Rezeptorbindungsaktivit¨at und der biologischen Aktivit¨at unterscheiden (IRVINE, 1979; MATTERI und PAPKOFF, 1987, 1988). Die Bedeutung des Sialins¨auregehaltes f¨ur den Polymorphismus der Gonadotropine zeigen verschiedene Untersuchungen (eLH:
MATTERI und PAPKOFF, 1987; rLH: HATTORI et al., 1985; hFSH: WIDE, 1982;
rFSH: BLUM et al., 1985), in deren Rahmen sich nach Entfernung der Sialins¨aurereste der Polymorphismus signifikant ver¨andert.
Die Pr¨asenz terminaler Sialins¨aurereste ist mit entscheidend f¨ur die Plasmahalbwertzeit der Gonadotropine, da sie die Aufnahme der Hormone durch Leberlectine verhindert und somit deren Abbau verz¨ogert. Mit einem Sialins¨auregehalt von 6–7 % weist eLH eine ho- he biologische Potenz auf und zeigt eine sehr lange Plasmahalbwertzeit von 5 Stunden (IRVINE, 1979). FSH hat mit 5–7 % Sialins¨aure eine entsprechend lange Halbwertzeit (SHERWOOD und McSHAN, 1977). Jedoch halten AGGARWAL und PAPKOFF (1981) die Menge der in einem Glykoprotein enthaltenen Sialins¨aure nicht f¨ur die alleinige Deter- minante der Plasmahalbwertzeit, da beispielsweise eCG (equines Choriongonadotropin) und hCG (humanes Choriongonadotropin) ungeachtet des gleichen Sialins¨auregehaltes unterschiedliche Halbwertzeiten zeigen. Dieselben Autoren beobachteten bei einer Unter- suchung der Halbwertzeiten sialinisierter und desialinisierter equiner Glykoproteine eine zweiphasige Eliminationskinetik. Sie zeigten f¨ur sialinisiertes eLH im schnelleren Abschnitt der Kurve eine Halbwertzeit von ca. 17 Minuten im Vergleich zu etwa 5 Minuten f¨ur de- sialinisiertes eLH. Im langsameren Abschnitt hingegen gab es im Gegensatz zu eFSH und eCG f¨ur sialinisiertes bzw. desialinisiertes eLH mit ca. 253 bzw. 255 Minuten kaum einen Unterschied (AGGARWAL und PAPKOFF, 1985).
W¨ahrend des Zyklus ver¨andert sich das Verh¨altnis der zirkulierenden Isoformen des equi- nen LH und FSH zueinander. Messbar wird das durch die Anwendung von In-vitro-Bio- assay (BIO) und Immunoassays (RIA). So waren im Gegensatz zu den FSH-RIA-Werten die FSH-BIO-Werte in der Lutealphase deutlich h¨oher als in der Follikelphase. Mit dem
Beginn der Luteolyse zeigte sich ein Absinken der FSH-BIO-Werte durch eine Verringe- rung der B:I-Ratio (ENGEL, 1989).
F¨ur eLH zeigte MICHEL (1989) in der Lutealphase ein Absinken der B:I-Ratio ab dem 3. Tag post ovulationem, w¨ahrend im Verlauf der Follikelphase eine kontinuierliche Zu- nahme des Verh¨altnisses zu beobachten war.
1979 nahmen EVANS et al. als erste hochfrequente Blutproben bei Stuten. In einigen F¨allen stellten sie LH-Pulse fest, die sie als
”episodic release“ bezeichneten. Auf eine sys- tematische Auswahl der untersuchten Zyklusphasen sowie eine mathematische Pulsanalyse wurde dabei allerdings verzichtet. In einem Zeitraum von 48 Stunden zeigten zwei Stu- ten in der mittleren Lutealphase drei bzw. vier LH-Pulse. Ein ¨ahnliches Sekretionsmuster zeigte eine Stute im periovulatorischen Zeitraum. Bei zwei anderen war hingegen in dieser Zyklusphase keine LH-Pulsatilit¨at nachweisbar. Auch bei zwei Stuten in der fr¨uhen und einer in der sp¨aten Follikelphase stellten die Autoren keine LH-Pulse fest.
FITZGERALD et al. (1985) untersuchten die pr¨a- und postovulatorische LH-Pulsatilit¨at bei Stuten post partum. Pr¨aovulatorisch zeigten drei der sieben untersuchten Stuten in jeweils einem der drei Intervalle ein bis zwei LH-Pulse. Zwischen Tag f¨unf und acht post ovulationem beobachteten sie bei sechs Stuten ein bis drei LH-Pulse in acht Stunden mit einer durchschnittlichen Amplitude von 3,7±0,7 ng/ml.
1987 entwickelten IRVINE und ALEXANDER eine Methode zur Gewinnung von ven¨osem Hypophysenblut aus dem Sinus intercavernosus. In einer Studie konnten dieselben Autoren (ALEXANDER und IRVINE, 1987) im Hypophysenblut in der fr¨uhen Follikelphase und im periovulatorischen Zeitraum hochfrequente eLH-Pulse hoher Amplitude messen, die zeitlich zu 98 % mit GnRH- und zu 83 % mit FSH-Pulsen assoziiert waren. Vier bis sechs Tage vor der Ovulation beobachteten sie im Mittel 0,45 LH-Pulse/h, am Tag der Ovulation 1,87 Pulse/h und am zweiten Tag post ovulationem 0,67 Pulse/h mit entsprechenden eLH-Sekretionsraten von 0,10 bis 0,23µg/min, 2,58–4,41µg/min bzw. 0,64µg/min an den Tagen −6 bis −4, 0 und +2.
22
Bei Stuten im Di¨ostrus konnten PANTKE et al. (1991) 1,4 Pulse/24 h mit einer Puls- dauer von 20–40 min. (zentral) bzw. 2–4 h (peripher) und extrem niedrigem LH-Basalwert zwischen den Pulsen messen.
W¨ahrend der mittleren Lutealphase ist im peripheren Blut nur eine geringe LH-Konzen- tration messbar, die dann ansteigt und eine Kurve formt, welche einige Tage vor Anfang des ¨Ostrus beginnt und gew¨ohnlich am Tag nach der Ovulation einen Peak bildet. Dieser Konzentrationsverlauf mit postovulatorischem Peak ist einzigartig f¨ur die Stute. Periphe- re LH-Spitzenkonzentrationen werden somit ein bis zwei Tage post ovulationem erreicht, gefolgt von einem allm¨ahlichen Absinken auf die niedrige Di¨ostruskonzentration etwa vier Tage sp¨ater (GINTHER, 1992). Vermutlich ist dieser verz¨ogerte LH-Abfall wichtig f¨ur die Etablierung des Corpus luteum (GINTHER, 1992).
IRVINE und ALEXANDER (1997) zeigten anhand der Analyse von Blutproben aus Hy- pophyse und Vena jugularis, dass das peripher sehr langsame Absinken der ovulatorischen LH-Konzentrationen um weniger als 50 % pro Tag (ALEXANDER und IRVINE, 1982) bei Stuten nicht durch eine hohe Frequenz an GnRH-Peaks mit konsekutiver Gonadotropinse- kretion bedingt ist. Als m¨ogliche Ursache f¨ur dieses Ph¨anomen vermuteten sie die zwischen den Peaks fortgesetzte Freisetzung der Gonadotropine und die lange Plasmahalbwertzeit des equinen Lutropins.
Anders als eLH zeigt eFSH w¨ahrend des Zyklus ein biphasisches Sekretionsprofil mit Wel- len in 10–12t¨agigem Intervall, wobei eine der Wellen direkt zur oder unmittelbar nach der Ovulation, die andere w¨ahrend der mittleren Lutealphase, etwa 10 Tage vor der n¨achsten Ovulation zu beobachten ist (ALEXANDER und IRVINE, 1993). Im Verlauf der mitt- leren Lutealphase erreicht die FSH-Konzentration maximale Werte und sinkt im fr¨uhen Ostrus auf ein Minimum, bevor wieder ein Konzentrationsanstieg mit Peak am 2.–3. Tag¨ post ovulationem erfolgt. Anschließend sinken die Werte bis zur n¨achsten Welle in der folgenden mittleren Lutealphase (EVANS und IRVINE, 1975).
URWIN und ALLEN (1983) verweisen auf die große Variation der Gonadotropinkonzen- trationen im Zyklus einzelner Stuten. In der von ihnen durchgef¨uhrten Studie zeigten alle
Stuten einen ausgepr¨agten Anstieg der FSH-Konzentration im Di¨ostrus auf Werte von 80–120 ng/ml. Nach niedrigsten Konzentrationen im Bereich von 20–40 ng/ml im sp¨aten Ostrus zeigten jedoch nur einige Stuten einen zweiten FSH-Anstieg.¨
FSH ist das verantwortliche Gonadotropin f¨ur die Bildung, Reifung und Vaskularisierung der Follikel. Außerdem wird unter FSH-Einfluss die Steroidhormonsynthese in den Go- naden stimuliert (IRVINE, 1983). F¨ur die endg¨ultige Follikelreifung und die Ausl¨osung der Ovulation ist LH erforderlich (EVANS et al., 1981). Außerdem ist LH verantwort- lich f¨ur die Stimulation der Prostaglandin- und Steroidbiosynthese in den Granulosazellen (LIPNER, 1988). Nach MERKT und KLUG (1979) f¨ordert LH auch die Induktion pro- teolytischer Enzyme, welche ben¨otigt werden, damit die Follikelwand rupturieren kann, und nachfolgend ist LH f¨ur den Beginn der Anbildung des Corpus luteum verantwortlich.
Eine notwendige Voraussetzung f¨ur die Vermittlung der biologischen Wirkung der Gona- dotropine ist die Bindung intakter Molek¨ule, bestehend aus einer α- und β-Untereinheit, an den entsprechenden Rezeptor (BUTNEV et al., 1998). Rezeptoren f¨ur LH und FSH sind membrangebundene Glykoproteine, welche sieben transmembrane Dom¨anen aufwei- sen. Diese Dom¨anen sind ebenfalls G-Protein-gebundene Rezeptoren. Nach der Bindung des Liganden an den Rezeptor kommt es zu einer Konformations¨anderung im Rezeptor.
Diese Konformations¨anderung wird auf ein Kopplungsprotein, Guanylnucleotidbindungs- protein (G-Protein), ¨ubertragen. Nach der Bindung des Liganden verliert die α-Unter- einheit des G-Proteins seine hohe Affinit¨at gegen¨uber Guanosindiphosphat (GDP). Es kommt zu einem Austausch von GDP gegen Guanosintriphosphat (GTP). Zusammen mit dem gebundenen GTP l¨ost sich die aktivierteα-Untereinheit vom Rezeptor und kann nun das Adenylatzyklasesystem aktivieren. Nachfolgend entsteht so aus Adenosintriphosphat (ATP) das zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP), welches im Zytosol seine Wirkung entfaltet, indem es durch Bindung an Proteinkinasen dieselben aktiviert. Die aktivierten Proteinkinasen katalysieren ihrerseits die Phosphorylierung von Enzymen oder anderen regulatorischen Proteinen (THEMMEN u. HUHTANIEMI, 2000).
24
Im tiefen saisonalen An¨ostrus zeigen Stuten im Regelfall niedrige FSH-Konzentrationen.
Jedoch wurden auch gelegentlich hohe Werte gemessen, die allerdings ohne palpierba- re Follikelaktivit¨at einhergingen. Daher scheint die unregelm¨aßige FSH-Freisetzung im An¨ostrus nicht in der Lage zu sein, die Follikelentwicklung zu stimulieren, denn zu die- ser Zeit blieb der Follikeldurchmesser unter 2 cm, und es bestanden keinerlei Anzeichen einer Follikelproliferation (EVANS und IRVINE, 1979). Wurde Stuten in diesem Stadi- um nach einem bestimmten Regime ein Hypophysenextrakt verabreicht, welches eLH und eFSH enthielt, ließ sich ein Follikelwachstum bis zur pr¨aovulatorischen Gr¨oße induzieren (DOUGLAS et al., 1974; LAPIN und GINTHER, 1977), was bei alleiniger Gabe von hCG (LH-Wirkung) nicht zu erreichen war (DAY, 1940).
2.2.2.4 Steroide und Inhibin: Struktur, Sekretion und Wirkungen
Alle Steroidhormone haben Cholesterol (C 27) zur Vorstufe und weisen mit vier Ring- molek¨ulen die gleiche chemische Grundstruktur auf. Jedoch unterscheiden sie sich durch die anh¨angenden funktionellen Gruppen sowie hinsichtlich der Anzahl und Lokalisation der Doppelbindungen. Im Rahmen der Steroidbiosynthese werden aus Lipoproteinen ¨uber Cholesterol die Hormone Progesteron, Androstendion und ¨Ostradiol-17β gebildet. Dabei findet eine enge Interaktion zwischen der Thekazellschicht und den Granulosazellen statt.
Nach der
”Zwei Zellen- Zwei Hormon-Theorie“ bilden die Zellen der Theka interna unter LH-Einfluss ¨uber Cholesterol und Progesteron das Androstendion. Aus Androstendion wird Testosteron synthetisiert, welches dann in den Granulosazellen unter FSH-Einfluss zu ¨Ostradiol-17β umgewandelt wird. Folglich liefern die Zellen der Theka interna nicht nur Androgene, die in Granulosazellen aromatisiert werden, sondern sie nutzen auch das in den Granulosazellen synthetisierte Progesteron zur Androgensynthese. Voraussetzung f¨ur die Steroidbiosynthese ist jedoch auch die Synthese der f¨ur die jeweiligen Reakti- onsschritte verantwortlichen Enzyme. Die notwendige Proteinbiosynthese dieser Enzyme wird durch die LH- bzw. FSH-induzierte Genexpression eingeleitet (CONLEY et al., 1995;
BERNDTSON et al., 1995; XU et al., 1995).
Bei der nicht tragenden Stute ist ¨Ostradiol (17β- ¨Ostradiol; E2) das vorherrschende ¨Ostro- gen in der Follikelfl¨ussigkeit sowie im Blut. Zu Beginn des ¨Ostrus, also etwa am 14. Tag des Zyklus, steigt unter FSH-Einfluss die ¨Ostradiol-Konzentration im Blut gleichm¨aßig an und erreicht ein bis zwei Tage vor der Ovulation ein Maximum (PATTINSON et al., 1974; HILLMAN u. LOY, 1975; NODEN et al., 1975; IRVINE, 1981). Nach der Ovulation sinkt der Plasma¨ostrogenspiegel und erreicht am Ende des ¨Ostrus die geringen Basal- werte des Di¨ostrus (PATTINSON et. al., 1974; MANTRI et al., 1985; MEINECKE et al., 1987). In einer Untersuchung von NODEN et al. (1975) stieg der ¨Ostradiolbasalwert von etwa 2,2 pg/ml, gemessen am zweiten und dritten Tag vor ¨Ostrusbeginn, auf Kon- zentrationen von 11,5 pg/ml ein bis zwei Tage ante ovulationem an. Nach Angaben von HOPPEN (1995) schwanken die Plasma¨ostradiolkonzentrationen bei der Stute w¨ahrend des gesamten ¨Ostrus in Bereichen zwischen 10 und 20 pg/ml.
W¨ahrend des ¨Ostrus liegt die Plasmaprogesteronkonzentration in einem Bereich von
<1 ng/ml (ALLEN u. HADLEY, 1972; ALLEN u. HADLEY, 1974; TERBLANCHE u.
MAREE, 1981; MEINECKE et al., 1987; MICHEL, 1989). Etwa sechs Tage nach erfolgter Ovulation werden bei der zu dieser Zeit maximalen Syntheseleistung des Corpus luteum im Plasma Progesteronh¨ochstwerte von 9–12 ng/ml erreicht (HUGHES et al., 1980; FAY u. DOUGLAS, 1987; WATSON u. SERTICH, 1990), welche w¨ahrend der Lutealphase gehalten werden. NODEN et al. (1975) konnten in dieser Plateauphase Serumprogeste- ronwerte von 16 ng/ml messen. Dann erfolgt im Zuge der Luteolyse ein rapider Abfall
¨
uber einen Zeitraum von 24–48 Stunden (TERBLANCHE u. MAREE, 1981) auf niedrige Basalwerte des nachfolgenden ¨Ostrus.
26 PSfrag replacements
Ovulation Ovulation
Zyklustag Ostradiol¨
Ostrus¨ Ostrus¨
LH FSH
FSH,LH(ng/ml)
0
0 1
2 3
4 5
6 7
8 9
10
10 12 14 16 18 20
20 30
40 50
Progesteron PGF2α
Progesteron (ng/ml) Placebo Buserelin
Abbildung 1: Plasmakonzentrationen von LH und FSH der nicht tragenden Stute nach DAELS und HUGHES (1993), ¨Ostradiol qualitativ
PSfrag replacements
Ovulation Ovulation
Zyklustag Ostradiol¨
Ostrus¨ Ostrus¨
LH FSH FSH, LH (ng/ml)
0
0 1
2 2
3
4 4
5
6 6
7
8 8
9
10 10
12 14 16 18 20 30
40 50
Progesteron PGF2α
Progesteron(ng/ml)
Placebo Buserelin
Abbildung 2: Plasmakonzentrationen von Progesteron der nicht tragenden Stute nach DAELS und HUGHES (1993), PGF2α qualitativ
Im Gegensatz zu Angaben ¨uber Steroidhormonkonzentrationen im Plasma liegen Daten zu Steroidhormonkonzentrationen in der Follikelfl¨ussigkeit von Pferden nur in begrenztem Umfang vor. COLLINS et al. (1997) f¨uhrten Untersuchungen zu Hormonkonzentrationen in der Follikelfl¨ussigkeit im Verlauf der Follikelentwicklung durch. W¨ahrend des domi- nanten Stadiums des Follikels konnte ein Anstieg der ¨Ostradiolkonzentrationen gemessen werden (1083±489 ng/ml). Im pr¨aovulatorischen Follikel zeigte sich mit ¨Ostradiolkon- zentrationen von 3102±510 ng/ml ein Peak, gefolgt von einem geringen und nicht signi- fikantem Absinken der Konzentrationen im Ovulationsfollikel (2039±234 ng/ml) sowie einem signifikantem Abfall der ¨Ostradiolkonzentrationen im pr¨aovulatorisch luteinisier- ten Follikel auf 248±131 ng/ml. Zwischen den verschiedenen Follikelentwicklungsstadien unterschieden sich die mittleren Progesteronkonzentrationen mit 13±2 ng/ml im domi- nanten, 43±10 ng/ml im pr¨aovulatorischen, 819 ±53 ng/ml im Ovulationsfollikel und 6964±1262 ng/ml im pr¨aovulatorisch luteinisierten Follikel deutlich. Die Untersuchun- gen von R ¨ODIGER (2000) decken sich bez¨uglich der Progesteronkonzentrationen in der Follikelfl¨ussigkeit mit den Ergebnissen von COLLINS et al. (1997).
Ostradiol stimuliert bei der Stute das typische Rosseverhalten und bedingt Ver¨anderungen¨ am Uterus in Form von Proliferation und verst¨arkter Durchblutung des Endometriums.
Sonographisch stellt sich die entstehende ¨Odematisierung des Endometriums in Form der charakteristischen
”Radspeichenstruktur“ dar. Zwischen Auftreten und Verschwinden der
”Radspeichenstruktur“ und dem ¨außeren Rosseverhalten der Stute besteht ein zeitlicher Zusammenhang (HAYES et al., 1985). ¨Ostradiol und Progesteron sind Teil eines komple- xen Feedback-Mechanismus. So stimuliert ¨Ostradiol w¨ahrend des ¨Ostrus die LH-Sekre- tion und hemmt die FSH-Freisetzung (PATTINSON et al., 1974; NODEN et al., 1975;
GARCIA et al., 1979), w¨ahrend Progesteron im Di¨ostrus die FSH-Sekretion stimuliert und die LH-Freisetzung vermindert (IRVINE, 1981).
Neben den genannten Steroidhormonen hat auch das Hormon Inhibin Einfluss auf das Re- produktionssystem. Inhibin, welches in Sertolizellen bzw. Granulosazellen gebildet wird, geh¨ort zur Gruppe der Proteohormone und setzt sich aus einer α- und einer β-Unterein- heit zusammen, welche ¨uber Disulfidbr¨ucken miteinander verbunden sind. Innerhalb einer
28
Spezies gibt es nur eine α-Untereinheit, w¨ahrend es zwei verschiedene β-Untereinheiten, genannt βA und βB, gibt. Die Kombination einer α-Untereinheit mit einer der β-Unter- einheiten ergibt das biologisch aktive Inhibin (Inhibin A oder Inhibin B). Unter Einfluss von Inhibin kommt es zu einem rapiden Absinken der mRNA-Menge f¨ur die FSH-β-Un- tereinheit. Im Gegensatz dazu ist der Effekt des Inhibins auf die FSH-Sekretion relativ langsam, was zu der Hypothese f¨uhrte, dass der Wirkungsmechanismus der durch Inhibin verminderten FSH-Sekretion in der Hemmung der FSH-Synthese begr¨undet ist. Die LH- Synthese wird durch Inhibin nicht beeinflusst (NETT, 1993).
2.2.3 Endokrine Regulation der Corpus luteum-Funktion
2.2.3.1 Allgemeines
Nach der Ovulation entwickelt sich der Gelbk¨orper (Corpus luteum). Das Hauptprodukt des Corpus luteum ist Progesteron, welches vielf¨altige Funktionen, einschließlich der des Erhaltes der Tr¨achtigkeit hat. Aufgrund der besonderen Struktur des equinen Ovars ist das Corpus luteum in das Ovarstroma eingebettet. Etwa am 3. Tag post ovulationem erreicht der Gelbk¨orper der Stute bereits einen maximalen Durchmesser, w¨ahrend eine maximale Progesteronsekretion nicht vor dem 9. Tag nach der Ovulation messbar ist (NETT et al., 1976b).
2.2.3.2 Zellpopulationen im Corpus luteum
Nach den Ergebnissen histologischer Untersuchungen von HARRISON (1946) und VAN NIEKERK et al. (1975) scheinen die sekretorischen Elemente zur Steroidhormonsynthese und -sekretion des equinen Corpus luteum prim¨ar, wenn nicht sogar ausschließlich aus Granulosazellen hervorzugehen. Auch BROADLEY et al. (1994) wiesen mittels Zellisola- tion aus equinen Gelbk¨orpern nach, dass offenbar nur Granulosazellen an der Bildung des Corpus luteum der Stute beteiligt sind.
Kurz vor der Ovulation zeigen die Thekazellen verschiedene Degenerationsstadien. Die Degeneration dieser Zellen ist etwa 24 Stunden post ovulationem nahezu abgeschlossen.
Im Gegensatz dazu zeigen die Granulosazellen 24 Stunden nach der Ovulation eine Zu- nahme des Durchmessers von ca. 10µm zum Zeitpunkt der Ovulation auf etwa 15µm und durchlaufen im Rahmen der Luteinisierung charakteristische zytologische Ver¨anderungen.
Zu diesem Zeitpunkt beginnt der Progesteronspiegel im Blut zu steigen. Drei Tage nach der Ovulation ist die Luteinisierung der Granulosazellen abgeschlossen. An den Tagen vier und f¨unf post ovulationem betr¨agt der prozentuale Anteil großer Zellen an der gesamten Luteinzellpopulation (große und kleine) 46 % (WATSON und SERTICH, 1990).
Am neunten Tag post ovulationem erreichen die Granulosazellen eine maximale Hyper- trophie (durchschnittlicher Zelldurchmesser 37,5µm). Zu diesem Zeitpunkt liegt auch die maximale sekretorische Aktivit¨at vor und etwa 15 % der Luteinzellen sind kleine Zellen mit einem mittleren Durchmesser von 11µm. Diese kleinen Luteinzellen sind eosinophil.
VAN NIEKERK et al. (1975) vermuten in ihnen eine Art
”Wartestadium“, welches dann zu großen Luteinzellen konvertiert.
Liegt keine Tr¨achtigkeit vor, so beginnt um den 12. Tag nach der Ovulation die funktionelle Luteolyse. Zu diesem Zeitpunkt zeigten die großen Luteinzellen abnehmende Durchmesser, welche am 16. Tag nur noch ca. 20µm betrugen. Diese Gr¨oßenabnahme war mit einem absinkenden Progesteronspiegel korreliert. WATSON und SERTICH (1990) wiesen mit zunehmendem Alter des Corpus luteum einen Anstieg des Anteils kleiner Luteinzellen nach. Dieselben Autoren konnten f¨ur den Zeitraum des 12. bis 13. Zyklustages einen Anteil von 24 % großer Luteinzellen, bezogen auf die gesamte Zellpopulation, messen.
Am 20. Tag des Zyklus befanden sich die meisten großen Luteinzellen in einem fort- geschrittenen Regressionsstadium (Zytoplasma kondensiert oder fragmentiert, Kernpy- knose). Die meisten zu diesem Zeitpunkt noch vorhandenen Luteinzellen waren kleine Zellen (GINTHER, 1992).
30
2.2.3.3 Beeinflussung der Lutealfunktion
Unter LH-Einfluss rupturiert der reife Follikel und setzt die Eizelle frei. Die Follikelwand kollabiert, und unter dem Einfluss angiogener und mitogener Faktoren bilden sich in dem sich entwickelnden Corpus luteum Kapillaren (McCRACKEN et al. 1999). W¨ahrend dieser Zeit sind die peripheren Gonadotropinkonzentrationen, d. h. steigende FSH-Konzentratio- nen und insbesondere die postovulatorisch noch einige Tage erh¨ohten LH-Konzentratio- nen, wichtig f¨ur die fr¨uhe Entwicklung des Corpus luteum sowie f¨ur die Stimulation der lutealen Progesteronsynthese. Untersuchungen von PINEDA et al. (1972, 1973) an Stuten zeigten, dass nach Applikation von Antik¨orpern gegen equine Gonadotropine eine Gelb- k¨orperregression zu beobachten war. Gleichlautend dazu stellten KELLY et al. (1988) in In-vitro-Studien mit equinen Gelbk¨orpern fest, dass die luteale Progesteronprodukti- on durch Stimulation mit eLH oder hCG erh¨oht werden konnte. Nach JOHNSON et al.
(1988) f¨uhrten auch exogene GnRH-Gaben ¨uber kurzzeitig erh¨ohte LH-Konzentrationen zu einem Anstieg der Progesteronkonzentrationen.
2.2.3.4 Luteolyse
Formen des Zelltodes w¨ahrend der lutealen Regression
In Zyklen, in denen keine Befruchtung und fr¨uhe Embryonalentwicklung stattfindet, er- streckt sich die Funktionalit¨at des equinen Corpus luteum ¨uber eine Zeitspanne von et- wa 14–15 Tagen. Die luteale Regression, welche durch sinkende Progesteronproduktion (funktionelle Regression; Eintritt etwa ab Tag 10–12 des Zyklus) und den zellul¨aren Un- tergang lutealen Gewebes (strukturelle Regression; Eintritt etwa ab Tag 16 des Zyklus) charakterisiert ist. Die genauen zellul¨aren und molekularen Mechanismen der Luteolyse sind jedoch, und das gilt insbesondere f¨ur das Pferd, noch nicht vollst¨andig gekl¨art (AL- ZI’ABI et al., 2002). Die Apoptose, der programmierte Zelltod, ist die vorherrschende Form des physiologischen Zelltodes (VAUX, 1994). Die Apoptose ist ein energieverbrau- chender Prozess und wird ¨uber Transkription oder Translation reguliert. Umwelteinfl¨usse
oder physiologische Stimuli k¨onnen zur Ausl¨osung der Apoptose f¨uhren. Es kommt zur Zellschrumpfung durch Chromatinkondensation und der Reduzierung des Zytoplasmas.
Durch Proteolyse wird die Kernmembran aufgel¨ost und der irreversible Bruch des Karyo- lemm tritt ein. Hinsichtlich dieser Charakteristika unterscheidet sich die Apoptose von der Nekrose, welche eine pathologische Form des Zelltodes repr¨asentiert. Die Nekrose ist das Ergebnis einer Zellsch¨adigung und wird charakterisiert durch Schwellung und Lysis der Zellen (TERRANOVA u. TAYLOR, 1998).
AL-ZI’ABI et al. (2002) untersuchten die Formen des Zelltodes im equinen Corpus lu- teum, indem sie Stuten zu unterschiedlichen Stadien der Lutealphase ovariektomierten.
Die gewonnenen Gelbk¨orper wurden biochemisch und ultrastrukturell untersucht. Die Er- gebnisse dieser Studie zeigten den Beginn der strukturellen Regression in der mittleren Lutealphase (Tag 10). Im Rahmen der nat¨urlichen Gelbk¨orperregression waren struktu- relle Ver¨anderungen deutlich am 14. Zyklustag erkennbar. Nach induzierter Regression (Applikation von Cloprostenol am 10. Zyklustag) war dies schon 12 Stunden post ap- plicationem der Fall. Dabei schien die Apoptose als Form des Zelltodes im Rahmen der Luteolyse involviert zu sein, jedoch konnten die Autoren w¨ahrend der lutealen Regression auch andere, nicht-apoptotische Ver¨anderungen in einigen Gelbk¨orperzellen beobachten.
Prostaglandin F2α: Struktur, Sekretion und Wirkung
Prostaglandin F2α (PGF2α), ein Derivat der mehrfach unges¨attigten Arachidons¨aure, ge- h¨ort zur Familie der C20-Fetts¨auren. F¨ur die Synthese der Prostaglandine wird zun¨achst durch eine Phospholipase A2 Arachidons¨aure aus Membranphospholipiden abgespalten.
Die Umwandlung der Arachidons¨aure in Prostaglandine erfolgt ¨uber Cyclooxygenasen unter Einbeziehung eines mikrosomalen Enzymkomplexes, der Prostaglandin-Synthetase (ALLEN und COOPER, 1993). Die PGF2α-Synthese wird hormonell reguliert. So stimu- liert ¨Ostradiol die Aktivit¨at der Phospholipase A2 (BONNEY et al., 1987, DEY et al., 1982) und der PG-Synthetase (KEUHL et al., 1976; WLODAWER et al., 1976). Unter- suchungen an Ratten zeigten eine erh¨ohte Lipidakkumulation unter Progesteroneinfluss
32
(BOSHIER und HOLLOWAY, 1973), weshalb Progesteron vermutlich durch die Akkumu- lation von Lipiden im Endometrium einen sogenannten
”priming-Effekt“ auf die PGF2α- Synthese hat. Ebenso scheinen ¨Ostradiol und Progesteron die endometriale PGF2α-Syn- these ¨uber die Regulation der Konzentration von Oxytocin-Rezeptoren im Endometrium zu beeinflussen (McCRACKEN, 1980). KING und EVANS (1987) steigerten durch Oxy- tocin die PGF2α-Produktion im endometrialen Gewebe. Auch die Ergebnisse von STOUT und ALLEN (1999) st¨utzen die Hypothese, dass bei der Stute endometriales Oxytocin auf parakrinem Weg die PGF2α-Freisetzung stimuliert, welche dann zur Luteolyse f¨uhrt.
TETZKE et al. (1987) beobachteten zum Zeitpunkt der Luteolyse maximale Konzen- trationen zirkulierenden Oxytocins. Im Rahmen anderer Untersuchungen konnte im sp¨a- ten Di¨ostrus eine Korrelation zwischen der gesteigerten Reaktivit¨at gegen¨uber Oxytocin und einer simultanen Erh¨ohung der endometrialen Bindungskapazit¨at f¨ur dieses Hormon (STARBUCK et al., 1998) festgestellt werden. Die genaue Rolle des Oxytocins bei der Freisetzung von PGF2α ist allerdings noch nicht vollst¨andig belegt (GINTHER, 1992).
Da bei der Stute die vaskul¨are Versorgung von Uterus und Ovar anders als bei Rind und Schaf keine Verflechtung der Vena uterina und Arteria ovarica aufweist, ist eine
”counter- current-Perfusion“ des endometrialen PGF2α in die Ovararterie nicht m¨oglich. Aufgrund dieser anatomischen Verh¨altnisse kann das aus dem Endometrium freigesetzte PGF2α nur
¨
uber den systemischen Blutkreislauf zum Ovar gelangen und unterliegt somit im Orga- nismus einem rapiden Metabolismus, welcher sowohl am Ort der Produktion, als auch in Lunge, Leber und Niere stattfindet. Bei der Stute wird PGF2α uber 15-Keto-PGF¨ 2α und 13,14-Dihydro-15-Keto-PGF2α (PGFM) zu 11-Ketotetranor-PGF metabolisiert (ALLEN und COOPER, 1993). VANDERWALL et al. (2000) vermuteten, dass wegen des raschen Metabolismus von PGF2αim systemischen Blutkreislauf m¨oglicherweise PGFM als Haupt- metabolit biologische Aktivit¨at besitzt. Durch ihre Untersuchungen konnten die Autoren ihre Hypothese jedoch nicht st¨utzen, da sie zwischen den mit PGFM-behandelten Tieren und Stuten der Kontrollgruppe hinsichtlich der Gelbk¨orperfunktion keine Unterschiede feststellen konnten.
NEELY et al. (1979) untersuchten mittels Messungen der peripheren PGFM-Konzentra- tionen die PGF2α-Sekretion zyklischer Stuten und stellten eine pulsatile Freisetzung aus dem Endometrium fest. Die jeweiligen PGF2α-Pulse waren von nur kurzer Dauer und zwi- schen Tag 14–17 post ovulationem zu messen. Dabei ging der erste messbare PGF2α-Puls einem ersten messbaren Absinken der Progesteronkonzentration etwa drei bis vier Stun- den voraus. Innerhalb eines Zeitraumes von 24–48 Stunden sanken die Progesteronkon- zentrationen auf Basalwerte von < 1 ng/ml, w¨ahrend eine fortgesetzte pulsatile PGF2α- Sekretion noch ein bis zwei Tage nach erfolgter Luteolyse nachweisbar war. Dieselben Au- toren beobachteten bei nicht tr¨achtigen Stuten, die eine verl¨angerte Lutealphase zeigten, eine herabgesetzte oder sogar fehlende Sekretion von PGF2α-Pulsen aus dem Endometri- um. Weiter wurde festgestellt, dass eine mechanische Stimulation des Endometriums (im Versuch F¨ullung des Uterus mit Kochsalzl¨osung) zur PGF2α-Freisetzung f¨uhrte.
Mit dem Nachweis der luteolytischen Wirkung von PGF2α bei pseudograviden Ratten gelang PHARRISS und WYNGARDEN (1969) ein Durchbruch in der Erforschung bio- chemischer Signale bei der Luteolyse. Sp¨ater zeigten auch Untersuchungen an Rindern (LAUDERDALE, 1972; LOUIS et al., 1972; ROWSON et al., 1972), Schweinen (DIEHL und DAY, 1973; GLEESON, 1974), Schafen (McCRACKEN et al., 1970; THORBURN et al., 1971), Ziegen (OTT et al., 1980), Meerschweinchen (CHAICHAREON et al., 1974) und Pferden (DOUGLAS und GINTHER, 1972; ALLEN und ROWSON, 1973;
NODEN et al., 1974) den luteolytischen Effekt von PGF2α. Einen weiteren deutlichen Beweis f¨ur diese Wirkung lieferten Studien an Schafen (SCARAMUZZI und BAIRD, 1976; FAIRCLOUGH, 1976), Rindern (FAIRCLOUGH et al., 1981) und Meerschwein- chen (POSER und HORTON, 1975), in denen durch aktive oder passive Immunisierung dieser Spezies gegen PGF2α die Gelbk¨orperregression unterdr¨uckt wurde.
Das equine Corpus luteum besitzt eine relativ hohe Bindungsaffinit¨at f¨ur PGF2α. Sie ist etwa zehnfach h¨oher als die des bovinen Gelbk¨orpers f¨ur PGF2α (KIMBALL und WYNGARDEN, 1977). Diese h¨ohere Affinit¨at gegen¨uber PGF2α k¨onnte zumindest teil- weise die h¨ohere Wirksamkeit geringer systemischer PGF2α-Konzentrationen und auch die
34
im Vergleich zu Schafen etwa 18fach h¨ohere Sensitivit¨at der Stute gegen¨uber der luteoly- tischen Wirkung systemisch verabreichten PGF2α erkl¨aren (DOUGLAS und GINTHER, 1973a, 1973b).
F¨ur die Erkl¨arung der luteolytischen Wirkung von PGF2α werden verschiedene Mechanis- men angenommen, die nachfolgend aufgef¨uhrt werden.
1. schneller und starker Abfall des Blutflusses zum Corpus luteum (NETT et al., 1976a;
NISWENDER et al., 1976)
2. Reduktion der LH-Rezeptor-Anzahl (BEHRMAN et al., 1978)
3. Entkopplung des LH-Rezeptors von der Adenylat-Zyklase (FLETCHER und NISWENDER, 1982)
4. Aktivierung von Protein-Kinase C (WILTBANK et al., 1989a)
5. Einstrom hoher Calciumkonzentrationen (WILTBANK et al., 1989b; HOYER und MARION, 1989)
6. zytotoxischer Effekt (SILVIA et al., 1984).
Auf dem Gebiet der Luteolyse bestehen jedoch speziesspezifische Unterschiede, und in vivo nachweisbare Effekte weichen zum Teil von den in vitro beobachteten ab (NISWENDER und NETT, 1994).
2.3 Aspekte der Fr¨ uhgravidit¨ at bei Stuten
2.3.1 Erkennung der Fr¨uhgravidit¨at
Eine fortgesetzte Progesteronsekretion, ¨uber den Zeitpunkt der endogenen Luteolyse hin- aus, ist zur Erhaltung der Gravidit¨at essentiell. Der Prozess, wodurch der Konzeptus die fortgesetzte luteale Progesteronsekretion ¨uber die Regulation der Gelbk¨orperregres- sion durch Blockade der uterinen Luteolysemechanismen bewirkt, wird als
”maternale Tr¨achtigkeitserkennung“ bezeichnet, wobei der jeweils zugrunde liegende Mechanismus von Spezies zu Spezies variiert.
Bei der Spezies Pferd gibt es das Ph¨anomen, dass im Ovidukt von Stuten ein selekti- ver Transport von Embryonen im 16-Zellstadium oder ¨alterer Stadien erfolgt, w¨ahrend Eizellen nicht weiter transportiert werden (VAN NIEKERK und GERNECKE, 1966;
BETTERIDGE et al., 1979). Offen ist, ob dieser Prozess schon im Zusammenhang mit der Erkennung der Fr¨uhgravidit¨at zu betrachten ist.
Die Erkennung der Tr¨achtigkeit muss vor dem Zeitpunkt stattfinden, ab dem die endogene Luteolyse beginnt. HERSHMAN und DOUGLAS (1979) legten diese kritische Phase nach einer Studie auf den Zeitraum zwischen dem 14. und 16. Tag post ovulationem fest. Diese Zeitangabe ist jedoch fraglich, da bei vielen zyklischen Stuten die Luteolyse bereits vorher einsetzt. Nach BETTERIDGE et al. (1985) und GOFF et al. (1987) hat der Embryo be- reits ab dem 11. Tag der Tr¨achtigkeit einen inhibitorischen Effekt auf die PGF2α-Synthese.
Die Tage 11 bis 15 der Gravidit¨at sind auch der Zeitraum der maximalen Embryomobili- t¨at (LEITH und GINTHER, 1984). W¨ahrend dieser Phase wird das Endometrium einem st¨andigen Kontakt mit dem Embryo ausgesetzt. Versuche, in denen durch Ligaturen der Kontakt zwischen Endometrium und Embryo aufgrund der eingeschr¨ankten Mobilit¨at auf kleine Uterusabschnitte reduziert wurde, resultierten in einer Luteolyse (McDOWELL et al., 1988).
Nach SHARP et al. (1984) kann der equine Embryo theoretisch auf folgenden Wegen die Luteolyse verhindern:
a) Die Synthese oder Sekretion von PGF2α wird geblockt.
b) Der luteolytische Effekt des PGF2α wird durch ein Luteotropin ¨uberlagert.
c) Der Transport von PGF2α zum Gelbk¨orper wird verhindert.
d) Die Bindung von PGF2α am Corpus luteum wird verhindert.
Bei der Stute sprechen die folgenden Forschungsergebnisse f¨ur den unter a) genannten Mechanismus:
Bei Stuten wurde am Tag 14 der Gravidit¨at im uterinen ven¨osen Blut nur eine geringe Prostaglandinkonzentration gemessen (DOUGLAS und GINTHER, 1976), und periphere
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Konzentrationen des Prostaglandinmetaboliten PGFM waren sehr gering oder nicht mess- bar (NEELY et al., 1979; KINDAHL et al., 1982). Desweiteren waren der PGF2α-Gehalt im Endometrium und im Uteruslumen in vivo sowie die endometriale PGF2α-Produkti- on in vitro bei graviden Stuten reduziert (SHARP, 1980; ZAVY et al., 1984). Außerdem zeigten In-vitro-Untersuchungen bei Stuten am 14. Tag der Tr¨achtigkeit eine reduzier- te endometriale PGF2α-Sekretion (FRANKLIN et al., 1989). WATSON (1991) fand bei tragenden Stuten eine Hemmung der mikrosomalen Prostaglandin-F-Synthese.
Anhand dieser Ergebnisse l¨asst sich schlussfolgern, dass bei der Stute die Hemmung der Prostaglandinsynthese und damit die Verhinderung der Luteolyse zur maternalen Tr¨ach- tigkeitserkennung entscheidend ist (GINTHER, 1992). Ob bei Stuten ¨ahnlich wie bei Wiederk¨auern vom Embryo ein Antiluteolysin, also ein Trophoblastprotein, zur Erken- nung der Gravidit¨at beteiligt ist, ist derzeit nicht bewiesen, wenngleich Untersuchungen die Synthese und Freisetzung einiger Polypeptide durch den equinen Embryo nachweisen (McDOWELL et al., 1990).
2.3.2 Fr¨uhembryonale Verluste
Die fr¨uhembryonale Sterblichkeit ist einer der Hauptursachen f¨ur die Subfertilit¨at von Stuten und deshalb von großer wirtschaftlicher Bedeutung in der Pferdezucht.
Hinsichtlich des zeitlichen Auftretens von Verlusten kann zwischen solchen vor und nach der Untersuchung auf Tr¨achtigkeit mittels Ultrasonographie bzw. transrektaler Palpati- on unterschieden werden. Angaben bez¨uglich der H¨aufigkeit von Verlusten variieren im internationalen Schrifttum. So stellten CHEVALIER und PALMER (1982) eine Resorp- tionsrate von 5 % zwischen den Tagen 23 und 43 der Gravidit¨at fest, SIMPSON et al.
(1982) errechneten 5 % f¨ur den Zeitraum vom 20. bis 45. Tag post ovulationem. Nach GINTHER et al. (1985) lag die embryonale Sterblichkeit bei 10 % zwischen den Tagen 10 bis 40, w¨ahrend sie in einer Studie von VILLAHOZ et al. (1985) f¨ur die Tage 15–50 bei 17 % lag. WOODS et al. (1985, 1987) gaben f¨ur den Zeitraum vom Tag 14–48 eine Sterblichkeitsrate von 10,4 % bzw. 13 % an. Nach CHEVALIER-CL ´EMENT (1989) lag der selbe Parameter bei 8,9 % zwischen den Tagen 22–44. BALL et al. (1986, 1989) gaben
bei fertilen bzw. subfertilen Stuten f¨ur den Zeitraum bis zum 40. Tag der Tr¨achtigkeit eine Sterblichkeitsrate von 20 % bzw.>70 % an.
Bei subfertilen Stuten tritt der fr¨uhembryonale Tod mit gr¨oßter Inzidenz im Zeitraum vor dem 10.–14. Tag auf. Das ist vor der Phase der maternalen Tr¨achtigkeitserkennung. Auch bei fertilen Stuten ereignet sich der embryonale Fruchttod h¨aufiger in dieser fr¨uhen Phase, allerdings nicht mit dieser hohen Inzidenz, wie sie f¨ur subfertile Stuten angegeben wird (BALL, 1993).
F¨ur die fr¨uhembryonale Sterblichkeit kommen bei Stuten verschiedene Faktoren als m¨ogli- che Ursachen in Betracht. Dazu z¨ahlen maternale Faktoren wie z. B. eine Gelbk¨orperinsuf- fizienz, Eileiter- und Uteruserkrankungen oder altersbedingte Einfl¨usse, externe Ursachen wie Stress, saisonale Einfl¨usse, iatrogene Ursachen und m¨oglicherweise auch Einfl¨usse sei- tens des eingesetzten Hengstes sowie embryonale Faktoren wie genetische Defekte und immunogene Ursachen. Endokrine Insuffizienzen wie verminderte Progesteronkonzentra- tionen k¨onnen durch Versagen der maternalen Tr¨achtigkeitserkennung, durch endome- triale Irritationen (z. B. Endometritis) mit nachfolgender Luteolyse oder aber auch durch eine prim¨are Lutealinsuffizienz, also die Unterfunktion des Corpus luteum, bedingt sein (GINTHER, 1985). So haben Embryonen, deren Entwicklung verz¨ogert ist, eine h¨ohere Sterblichkeitsrate als normal entwickelte Embryonen. Es besteht dann eine Asynchronit¨at der Entwicklung zwischen Embryo und Endometrium, und die Luteolyse setzt ein. Obwohl eine Lutealinsuffizienz f¨ur viele Spezies als wichtige Ursache fr¨uhembryonaler Mortalit¨at angenommen wird, ist sie schwer nachzuweisen (BALL, 1993). In diesem Zusammenhang wird der Nutzen einer prophylaktischen Progesteronsupplementierung kontrovers disku- tiert (VOLLER et al., 1991; ALLEN, 1993, 2001).
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2.4 Versuche zur Beeinflussung fr¨ uhembryonaler Verluste mit- tels GnRH
In den meisten Studien, in denen die Beeinflussung der Tr¨achtigkeitsrate mittels eines GnRH-Agonisten untersucht wurde, kam zu diesem Zweck der Wirkstoff Buserelin zur Anwendung. Aus diesem Grund wird den Ergebnissen, die mit Buserelin erreicht wurden, eine Information ¨uber den Wirkstoff vorangestellt.
2.4.1 Buserelin
Das Peptidhormon Buserelin ist ein synthetisches GnRH-Derivat, welches im Vergleich zum nat¨urlichen GnRH eine erheblich st¨arkere biologische Wirkung hat. Im Tierversuch wurde bei m¨annlichen Ratten durch Buserelin-Applikation eine 18mal h¨ohere LH- und 15,7mal h¨ohere FSH-Freisetzung erzielt. Beim Kaninchen ließ sich eine 20fach st¨arkere follikelstimulierende Wirkung sowie eine 8mal h¨ohere ovulatorische Aktivit¨at als bei na- t¨urlichem GnRH nachweisen. Untersuchungen zur Organverteilung von Buserelin bei der Ratte zeigen eine Anreicherung in Leber, Niere und Hypophyse, wobei die Hypophyse das Zielorgan von Buserelin darstellt. Etwa 60 Minuten nach der Buserelin-Applikation findet eine starke Anreicherung im Hypophysenvorderlappen statt. Die Plasmaeliminati- on erfolgt rasch (initiale Plasmahalbwertzeiten bei der Ratte etwa 3–4,5 Minuten), die hormonale Wirkung hingegen h¨alt ¨uber mehrere Stunden an (SANDOW et al., 1979).
2.4.2 Versuche an Rindern
Mit dem Ziel einer Verbesserung der Tr¨achtigkeitsrate wurde beim Rind eine Vielzahl an Behandlungskonzepten getestet, darunter auch der Einsatz von GnRH bzw. von GnRH- Analoga. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind jedoch nicht einheitlich.
So erzielten MACMILLAN et al. (1986) mit einer einmaligen intramuskul¨aren Injektion von 5µg Buserelin bei Milchk¨uhen in der fr¨uhen Lutealphase (Tage 1–6 nach der ersten Besamung) eine Tr¨achtigkeitsrate von 61,8 % gegen¨uber 71,9 % in der Kontrollgruppe.
Bei Injektion im sp¨ateren Di¨ostrus (Tage 7–13 nach der ersten Besamung) lag bei behan- delten Tieren die Tr¨achtigkeitsrate bei 62,0 % gegen¨uber 63,6 % bei unbehandelten Tieren.
Daraus ergab sich eine durchschnittliche Tr¨achtigkeitsrate von 61,9 % in der Gruppe der behandelten Tiere im Vergleich zu 65,7 % in der Kontrollgruppe. Eine Injektion von 10µg Buserelin i.m. im Zeitraum vom 7.–10. Tag nach der ersten Besamung hatte keinen Ein- fluss auf die Tr¨achtigkeitsrate (Versuch: 64,9 %; Kontrolle 65,4 %). Eine Applikation der selben Dosis zwischen den Tagen 11–13 nach der Besamung steigerte hingegen die Tr¨ach- tigkeitsrate um 11,5 % (behandelt: 72,4 %; unbehandelt 60,9 %). Die durchschnittliche Tr¨achtigkeitsrate nach der zweiten k¨unstlichen Insemination war nach Injektion von 10µg Buserelin im Zeitraum vom 11.–13. Tag post inseminationem bei behandelten Tieren mit 85,1 % gegen¨uber 69,2 % bei Kontrolltieren um 15,6 % h¨oher. JUBB et al. (1990) hinge- gen erreichten bei Milchk¨uhen durch die Injektion von 10µg Buserelin i.m. im Zeitraum vom 11.–13. Tag post inseminationem im Vergleich zu Kontrollgruppen keine signifikan- te Erh¨ohung der Tr¨achtigkeitsrate (erste Insemination: Tr¨achtigkeitsrate Versuch: 54,6 %;
Tr¨achtigkeitsrate Kontrolle 54,8 %; zweite Insemination: Tr¨achtigkeitsrate Versuch 62,4 %;
Tr¨achtigkeitsrate Kontrolle 63.0 %). SHELDON und DOBSON (1993) wiederum konnten durch eine intramuskul¨are Injektion von 10µg Buserelin am 11. Tag nach der ersten Be- samung f¨ur Tiere der Kontrollgruppe bzw. der behandelten Gruppe eine Tr¨achtigkeitsrate von 50,6 % bzw. 60,0 % erzielen. F¨ur die zweite Besamung wurde bei Kontrolltieren bzw.
behandelten Tieren eine Tr¨achtigkeitsrate von 41,2 % bzw. 54,4 % erreicht.
DREW und PETERS (1994) konnten durch eine Buserelin-Injektion von 10µg am Tag 12 nach der Besamung die Tr¨achtigkeitsrate bei behandelten Tieren um 12 % gegen¨uber Tie- ren der Kontrollgruppe steigern (Versuch: 65,4 %; Kontrolle 53,4 %). Bei Applikation am Tag der Besamung oder am 8. bzw. 10. Tag post inseminationem wurden hingegen keine signifikanten Effekte erzielt.
RYAN et al. (1994) erreichten bei Milchk¨uhen durch Injektion von 10µg Buserelin weder nach Applikation zum Zeitpunkt der Besamung noch am 12. Tag nach der Inseminati- on eine Steigerung der Tr¨achtigkeitsrate. MANN et al. (1995) untersuchten ebenfalls den
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Effekt einer intramuskul¨aren Applikation von 10µg Buserelin am 12. Tag nach der In- semination. Von 29 Tieren der Kontrollgruppe waren 15 tragend, bei 11 Tieren setzte die Luteolyse ein. In der Gruppe der 26 behandelten Tiere blieben 13 Tiere tragend, 13 Tiere waren nicht tragend. JAYAKUMAR und VAHIDA (2000) erreichten bei K¨uhen nach intramuskul¨arer Injektion von 10µg Buserelin am 12. Tag nach der Insemination eine Tr¨achtigkeitsrate von 40,0 % gegen¨uber 33,3 % bei Tieren der Kontrollgruppe. Dieser Unterschied konnte statistisch nicht gesichert werden.
Aufgrund der uneinheitlichen Aussagen hinsichtlich des Nutzens einer GnRH-Applikation im Zeitraum von 11–14 Tagen nach der Insemination zur Erh¨ohung der Tr¨achtigkeitsrate beim Rind nahmen PETERS et al. (2000) eine Meta-Analyse der Daten aus verschiedenen Untersuchungen vor. Sechs Studien erf¨ullten seitens des Datenmaterials die erforderlichen Voraussetzungen f¨ur die Meta-Analyse. Auf der Basis dieser Auswertung stellten die Au- toren eine signifikante Verbesserung der Tr¨achtigkeitsrate bei behandelten Rindern fest (Odds-Ratio = 1,33,p <0,01).
2.4.3 Versuche an Pferden
PYCOCK und NEWCOMBE (1996) untersuchten den Einfluss einer intramuskul¨aren In- jektion von 40µg Buserelin bei Stuten am 10. oder 11. Tag nach der Ovulation (Versuch A) bzw. im Zeitraum vom 8.–10. Tag post ovulationem (Versuch B). Die Auswertung der Ver- suchsreihe A ergab eine Tr¨achtigkeitsrate von 72,5 % bei behandelten Stuten gegen¨uber einer Tr¨achtigkeitsrate von 66,6 % bei Kontrolltieren an Tag 14 bzw. 15 der Tr¨achtigkeit sowie eine geringere Resorptionsrate bei behandelten Stuten zum Zeitpunkt der zweiten Tr¨achtigkeitsuntersuchung am 28.–30. Tag der Gravidit¨at (4,1 % bzw. 7,4 %). Auch die Auswertung der Versuchsreihe B ergab eine gesteigerte Tr¨achtigkeitsrate bei behandelten Stuten gegen¨uber Kontrolltieren (57,2 % bzw. 53,5 %). Auch in dieser Auswertung war die Resorptionsrate zum Zeitpunkt der zweiten Tr¨achtigkeitsuntersuchung bei behandel- ten Stuten geringer als bei Stuten aus der Kontrollgruppe (6,5 % bzw. 12,0 %). Bei der Datenauswertung wurden jedoch die Einflussfaktoren Alter und Zuchtstatus der Stute und Hengst nicht ber¨ucksichtigt.
NEWCOMBE et al. (2001) zeigten in einer Gesamtauswertung von Versuchsreihen meh- rerer Jahre bei Stuten eine signifikante Erh¨ohung der Tr¨achtigkeitsrate um etwa 10 % nach einer Buserelin-Applikation von 20–40µg zu einem Zeitpunkt zwischen dem 8.–12. Tag nach der Ovulation. Allerdings wurden auch hier keine weiteren Einflussfaktoren in die statistische Auswertung einbezogen.
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3 Eigene Untersuchungen
3.1 Material und Methoden
3.1.1 Allgemeines
Entsprechend der in der Einleitung genannten Zielsetzung der Arbeit wurden zwei Ver- suchsreihen durchgef¨uhrt, welche nachfolgend als Versuchsreihe A und B bezeichnet wer- den. Das Ziel der Versuchsreihe A bestand in der Untersuchung des m¨oglichen Einflusses einer Applikation des GnRH-Agonisten Buserelin auf die Tr¨achtigkeitsrate, w¨ahrend in der Versuchsreihe B die Untersuchung des m¨oglichen Einflusses einer solchen Behandlung auf periphere Hormonkonzentrationen untersucht werden sollte. Dazu erhielten die Stu- ten am 10. Tag nach der Ovulation eine intramuskul¨are Injektion eines GnRH-Analogons bzw. eines Placebos. Je nach Versuchsreihe erfolgte nach einem bestimmten Schema die Entnahme der Blutproben aus der Vena jugularis externa (siehe 3.1.3). Die Tr¨achtigkeits- untersuchungen der Stuten erfolgten am 16. Tag post ovulationem.
3.1.2 Versuchstiere
Von April bis August 2000 wurden die f¨ur die Untersuchungen ben¨otigten Stuten von ei- nem privaten Zuchtbetrieb in Mecklenburg-Vorpommern, in dem 500 Zuchtstuten gehalten werden, zur Verf¨ugung gestellt. Dabei handelte es sich vorwiegend um Warmblutstuten der Zuchtgebiete Oldenburg, Hannover und Zangersheide. In geringerer Anzahl waren auch Warmblutstuten anderer Zuchtgebiete sowie eine Vollblutstute vertreten (Tabelle 1). Das Alter der eingesetzten Zuchtstuten der Versuchsreihe A betrug 2 bis 20 Jahre (durchschnittlich sieben Jahre), das der Tiere der Versuchsreihe B 4 bis 14 Jahre (durch- schnittlich neun Jahre). Die Tiere wurden in Einzelinnenboxen bzw. Laufst¨allen gehalten und hatten zum Teil Weidegang. Die F¨utterung erfolgte zweimal t¨aglich mit Hafer und Pellets sowie Heu und frischem Gras. ¨Uber Selbsttr¨anken stand Wasser ad libitum zur Verf¨ugung.
Tabelle 1: Einteilung der Stuten nach Zuchtgebieten und Rassen
Versuchsreihe A Versuchsreihe B Warmblut-Zuchtgebiet Anzahl (n) Anteil (%) Anzahl (n) Anteil (%)
Oldenburg 91 53,22 15 75,0
Zangersheide 27 15,79 2 10,0
Hannover 27 15,79 1 5,0
Westfalen 11 6,43
Holstein 6 3,51 1 5,0
Rheinland 2 1,17 1 5,0
Baden-W¨urttemberg 1 0,58
Bayern 1 0,58
Hessen 1 0,58
Mecklenburg 1 0,58
Rheinland-Pfalz-Saar 1 0,58
ZfdP 1 0,58
Anzahl (n) Anteil (%) Anzahl (n) Anteil (%)
Vollblut xx 1 0,58
Summe 171 20
3.1.3 Versuchsdurchf¨uhrung
3.1.3.1 Versuchsreihe A
Die Untersuchungen in dieser Versuchsreihe erfolgte an insgesamt 171 Stuten (56 Maiden- stuten bis zu einem Alter von maximal sechs Jahren, 115 Stuten mit Fohlen bei Fuß) im Alter von 2–20 Jahren. Bei Stuten mit Fohlen bei Fuß wurden die erste und zweite Rosse nach der Fohlenrosse genutzt, w¨ahrend bei Maidenstuten die erste, und bei anschließender Nichttr¨achtigkeit auch die zweite genutzte Rosse innerhalb der Zuchtsaison ber¨ucksichtigt wurden. Dadurch ergibt sich die Anzahl von insgesamt n = 224 auswertbaren Zyklen
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einer ersten (n = 153) und einer zweiten genutzten Rosse (n = 71) von insgesamt 171 verschiedenen Stuten.
Alle Stuten des Versuchskollektivs waren genitalgesund und zyklisch. Die Feststellung des Ovulationszeitpunktes (Tag 0) erfolgte bei allen Stuten durch Palpation und transrektale Ultrasonographie (5 MHz Linear Array Scanner, Pie Medical 480, Pie Data, Dorsten). Die Stuten wurden mit Frischsperma (n = 81; ein bis drei Besamungen bis zur Feststellung der Ovulation) bzw. Tiefgefriersperma (n= 143; einmalige Besamung bis maximal sechs Stunden post ovulationem) inseminiert. Insgesamt wurde daf¨ur Sperma von 32 verschie- denen Hengsten eingesetzt. Die Stuten wurden in chronologischer Reihenfolge des Ovula- tionstages alternierend der Kontrollgruppe (n = 106) bzw. Buserelin-Gruppe (n = 118) zugeordnet.
Am Tag 10 post ovulationem erhielten die Stuten der Buserelin-Gruppe eine einmalige intramuskul¨are Injektion von 40µg Buserelin (10 ml Receptal , Intervet Deutschland, Un- terschleißheim), w¨ahrend bei Stuten der Kontrollgruppe ein entsprechendes Volumen eines Placebos (10 ml isotone Kochsalz-L¨osung 0,9 %, Braun, Melsungen ) appliziert wurde.
Bei den Stuten der Versuchsreihe A erfolgte am Tag 10 post ovulationem, vor Injektion des GnRH-Analogons Buserelin bzw. des Placebos, eine einmalige Blutprobenentnahme (Monovetten , Sarstedt, N¨umbrecht) zur Bestimmung der peripheren Progesteronkonzen- tration. Hierzu wurde die Vena jugularis externa nach vorheriger Desinfektion der Haut punktiert (1,2×40 mm Kan¨ule, Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien).
Die Tr¨achtigkeitsuntersuchung erfolgte am 16. Tag post ovulationem mittels Palpation und transrektaler Ultrasonographie.
3.1.3.2 Versuchsreihe B
F¨ur die Untersuchungen dieser Versuchsreihe wurde eine Gruppe von insgesamt 20 Stuten im Alter von 4–14 Jahren mit Fohlen bei Fuß zusammengestellt.
