Equine Gonadotropine: Struktur, Sekretion und Wirkungen 19

Die equinen hypophys¨aren Gonadotropine luteinisierendes Hormon (LH) und follikelsti-mulierendes Hormon (FSH), deren Quelle die Adenohypophyse ist, z¨ahlen biochemisch zu den Glykoproteinhormonen und bestehen, wie auch eCG (equines Choriongonadotro-pin) und TSH (ThyreotroChoriongonadotro-pin), aus zwei Untereinheiten (α und β), die nicht-kovalent gebunden sind. W¨ahrend die α-Untereinheit speziesspezifisch und identisch bei den vier oben genannten Hormonen ist, ist dieβ-Untereinheit speziesspezifisch und dar¨uberhinaus spezifisch f¨ur die biologische Funktion des jeweiligen Hormons (PIERCE und PARSONS, 1981). Beide Untereinheiten werden in der Zelle separat synthetisiert, verbinden sich dann spontan und formen so das vollst¨andige Molek¨ul. Die α-Untereinheit wird im ¨Ubermaß produziert, wohingegen die Synthese der β-Untereinheit der limitierende Schritt in der Gonadotropinsynthese zu sein scheint. Dissoziierte Untereinheiten haben keine oder nur geringe biologische Aktivit¨at.

Trotz struktureller ¨Ahnlichkeit zeigen LH und FSH der meisten non-equinen S¨auger, wenn

¨uberhaupt, nur geringe Kreuzreaktivit¨at (ROSER et al., 1986). Equines LH bildet jedoch eine Ausnahme, da es sowohl wirksame LH- als auch intrinsische FSH-Aktivit¨at nach Injektion bei nicht-equinen Spezies zeigt. Im Gegensatz zu equinem LH zeigt LH von Esel bzw. Zebra diese intrinsische FSH-Aktivit¨at nicht (MATTERI et al., 1987).

Die equinen Gonadotropine LH und FSH bestehen zu ca. 24 % aus Kohlenhydraten, den Rest bilden Proteine. Hinsichtlich der Hormonaktivit¨at haben Kohlenhydrat- und Protein-anteile der Gonadotropine unterschiedliche Rollen. Der Polypeptid-Teil ist ausschließlich f¨ur die spezifische Membranrezeptorerkennung verantwortlich. Die Kohlenhydratanteile sind einerseits wichtig, um die Hormone in der Zirkulation zu halten, andererseits sind sie nach der Bindung an spezifische Rezeptoren direkt an der ¨Ubertragung der Hormonwir-kung durch die Zellmembran beteiligt (COMBARNOUS, 1988).

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Eine Besonderheit der equinen Gonadotropine ist deren hoher Sialins¨auregehalt. Unter-schiedliche Sialinisierungsgrade der Kohlenhydrat-Seitenketten resultieren in einer He-terogenit¨at der Gonadotropine, weshalb sich die Isoformen des eLH und eFSH in ih-rer Rezeptorbindungsaktivit¨at und der biologischen Aktivit¨at unterscheiden (IRVINE, 1979; MATTERI und PAPKOFF, 1987, 1988). Die Bedeutung des Sialins¨auregehaltes f¨ur den Polymorphismus der Gonadotropine zeigen verschiedene Untersuchungen (eLH:

MATTERI und PAPKOFF, 1987; rLH: HATTORI et al., 1985; hFSH: WIDE, 1982;

rFSH: BLUM et al., 1985), in deren Rahmen sich nach Entfernung der Sialins¨aurereste der Polymorphismus signifikant ver¨andert.

Die Pr¨asenz terminaler Sialins¨aurereste ist mit entscheidend f¨ur die Plasmahalbwertzeit der Gonadotropine, da sie die Aufnahme der Hormone durch Leberlectine verhindert und somit deren Abbau verz¨ogert. Mit einem Sialins¨auregehalt von 6–7 % weist eLH eine ho-he biologischo-he Potenz auf und zeigt eine sehr lange Plasmahalbwertzeit von 5 Stunden (IRVINE, 1979). FSH hat mit 5–7 % Sialins¨aure eine entsprechend lange Halbwertzeit (SHERWOOD und McSHAN, 1977). Jedoch halten AGGARWAL und PAPKOFF (1981) die Menge der in einem Glykoprotein enthaltenen Sialins¨aure nicht f¨ur die alleinige Deter-minante der Plasmahalbwertzeit, da beispielsweise eCG (equines Choriongonadotropin) und hCG (humanes Choriongonadotropin) ungeachtet des gleichen Sialins¨auregehaltes unterschiedliche Halbwertzeiten zeigen. Dieselben Autoren beobachteten bei einer Unter-suchung der Halbwertzeiten sialinisierter und desialinisierter equiner Glykoproteine eine zweiphasige Eliminationskinetik. Sie zeigten f¨ur sialinisiertes eLH im schnelleren Abschnitt der Kurve eine Halbwertzeit von ca. 17 Minuten im Vergleich zu etwa 5 Minuten f¨ur de-sialinisiertes eLH. Im langsameren Abschnitt hingegen gab es im Gegensatz zu eFSH und eCG f¨ur sialinisiertes bzw. desialinisiertes eLH mit ca. 253 bzw. 255 Minuten kaum einen Unterschied (AGGARWAL und PAPKOFF, 1985).

W¨ahrend des Zyklus ver¨andert sich das Verh¨altnis der zirkulierenden Isoformen des equi-nen LH und FSH zueinander. Messbar wird das durch die Anwendung von In-vitro-Bio-assay (BIO) und ImmunoIn-vitro-Bio-assays (RIA). So waren im Gegensatz zu den FSH-RIA-Werten die FSH-BIO-Werte in der Lutealphase deutlich h¨oher als in der Follikelphase. Mit dem

Beginn der Luteolyse zeigte sich ein Absinken der FSH-BIO-Werte durch eine Verringe-rung der B:I-Ratio (ENGEL, 1989).

F¨ur eLH zeigte MICHEL (1989) in der Lutealphase ein Absinken der B:I-Ratio ab dem 3. Tag post ovulationem, w¨ahrend im Verlauf der Follikelphase eine kontinuierliche Zu-nahme des Verh¨altnisses zu beobachten war.

1979 nahmen EVANS et al. als erste hochfrequente Blutproben bei Stuten. In einigen F¨allen stellten sie LH-Pulse fest, die sie als

”episodic release“ bezeichneten. Auf eine sys-tematische Auswahl der untersuchten Zyklusphasen sowie eine mathematische Pulsanalyse wurde dabei allerdings verzichtet. In einem Zeitraum von 48 Stunden zeigten zwei Stu-ten in der mittleren Lutealphase drei bzw. vier LH-Pulse. Ein ¨ahnliches Sekretionsmuster zeigte eine Stute im periovulatorischen Zeitraum. Bei zwei anderen war hingegen in dieser Zyklusphase keine LH-Pulsatilit¨at nachweisbar. Auch bei zwei Stuten in der fr¨uhen und einer in der sp¨aten Follikelphase stellten die Autoren keine LH-Pulse fest.

FITZGERALD et al. (1985) untersuchten die pr¨a- und postovulatorische LH-Pulsatilit¨at bei Stuten post partum. Pr¨aovulatorisch zeigten drei der sieben untersuchten Stuten in jeweils einem der drei Intervalle ein bis zwei LH-Pulse. Zwischen Tag f¨unf und acht post ovulationem beobachteten sie bei sechs Stuten ein bis drei LH-Pulse in acht Stunden mit einer durchschnittlichen Amplitude von 3,7±0,7 ng/ml.

1987 entwickelten IRVINE und ALEXANDER eine Methode zur Gewinnung von ven¨osem Hypophysenblut aus dem Sinus intercavernosus. In einer Studie konnten dieselben Autoren (ALEXANDER und IRVINE, 1987) im Hypophysenblut in der fr¨uhen Follikelphase und im periovulatorischen Zeitraum hochfrequente eLH-Pulse hoher Amplitude messen, die zeitlich zu 98 % mit GnRH- und zu 83 % mit FSH-Pulsen assoziiert waren. Vier bis sechs Tage vor der Ovulation beobachteten sie im Mittel 0,45 LH-Pulse/h, am Tag der Ovulation 1,87 Pulse/h und am zweiten Tag post ovulationem 0,67 Pulse/h mit entsprechenden eLH-Sekretionsraten von 0,10 bis 0,23µg/min, 2,58–4,41µg/min bzw. 0,64µg/min an den Tagen −6 bis −4, 0 und +2.

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Bei Stuten im Di¨ostrus konnten PANTKE et al. (1991) 1,4 Pulse/24 h mit einer Puls-dauer von 20–40 min. (zentral) bzw. 2–4 h (peripher) und extrem niedrigem LH-Basalwert zwischen den Pulsen messen.

W¨ahrend der mittleren Lutealphase ist im peripheren Blut nur eine geringe LH-Konzen-tration messbar, die dann ansteigt und eine Kurve formt, welche einige Tage vor Anfang des ¨Ostrus beginnt und gew¨ohnlich am Tag nach der Ovulation einen Peak bildet. Dieser Konzentrationsverlauf mit postovulatorischem Peak ist einzigartig f¨ur die Stute. Periphe-re LH-Spitzenkonzentrationen werden somit ein bis zwei Tage post ovulationem erPeriphe-reicht, gefolgt von einem allm¨ahlichen Absinken auf die niedrige Di¨ostruskonzentration etwa vier Tage sp¨ater (GINTHER, 1992). Vermutlich ist dieser verz¨ogerte LH-Abfall wichtig f¨ur die Etablierung des Corpus luteum (GINTHER, 1992).

IRVINE und ALEXANDER (1997) zeigten anhand der Analyse von Blutproben aus Hy-pophyse und Vena jugularis, dass das peripher sehr langsame Absinken der ovulatorischen LH-Konzentrationen um weniger als 50 % pro Tag (ALEXANDER und IRVINE, 1982) bei Stuten nicht durch eine hohe Frequenz an GnRH-Peaks mit konsekutiver Gonadotropinse-kretion bedingt ist. Als m¨ogliche Ursache f¨ur dieses Ph¨anomen vermuteten sie die zwischen den Peaks fortgesetzte Freisetzung der Gonadotropine und die lange Plasmahalbwertzeit des equinen Lutropins.

Anders als eLH zeigt eFSH w¨ahrend des Zyklus ein biphasisches Sekretionsprofil mit Wel-len in 10–12t¨agigem Intervall, wobei eine der WelWel-len direkt zur oder unmittelbar nach der Ovulation, die andere w¨ahrend der mittleren Lutealphase, etwa 10 Tage vor der n¨achsten Ovulation zu beobachten ist (ALEXANDER und IRVINE, 1993). Im Verlauf der mitt-leren Lutealphase erreicht die FSH-Konzentration maximale Werte und sinkt im fr¨uhen Ostrus auf ein Minimum, bevor wieder ein Konzentrationsanstieg mit Peak am 2.–3. Tag¨ post ovulationem erfolgt. Anschließend sinken die Werte bis zur n¨achsten Welle in der folgenden mittleren Lutealphase (EVANS und IRVINE, 1975).

URWIN und ALLEN (1983) verweisen auf die große Variation der Gonadotropinkonzen-trationen im Zyklus einzelner Stuten. In der von ihnen durchgef¨uhrten Studie zeigten alle

Stuten einen ausgepr¨agten Anstieg der FSH-Konzentration im Di¨ostrus auf Werte von 80–120 ng/ml. Nach niedrigsten Konzentrationen im Bereich von 20–40 ng/ml im sp¨aten Ostrus zeigten jedoch nur einige Stuten einen zweiten FSH-Anstieg.¨

FSH ist das verantwortliche Gonadotropin f¨ur die Bildung, Reifung und Vaskularisierung der Follikel. Außerdem wird unter FSH-Einfluss die Steroidhormonsynthese in den Go-naden stimuliert (IRVINE, 1983). F¨ur die endg¨ultige Follikelreifung und die Ausl¨osung der Ovulation ist LH erforderlich (EVANS et al., 1981). Außerdem ist LH verantwort-lich f¨ur die Stimulation der Prostaglandin- und Steroidbiosynthese in den Granulosazellen (LIPNER, 1988). Nach MERKT und KLUG (1979) f¨ordert LH auch die Induktion pro-teolytischer Enzyme, welche ben¨otigt werden, damit die Follikelwand rupturieren kann, und nachfolgend ist LH f¨ur den Beginn der Anbildung des Corpus luteum verantwortlich.

Eine notwendige Voraussetzung f¨ur die Vermittlung der biologischen Wirkung der Gona-dotropine ist die Bindung intakter Molek¨ule, bestehend aus einer α- und β-Untereinheit, an den entsprechenden Rezeptor (BUTNEV et al., 1998). Rezeptoren f¨ur LH und FSH sind membrangebundene Glykoproteine, welche sieben transmembrane Dom¨anen aufwei-sen. Diese Dom¨anen sind ebenfalls G-Protein-gebundene Rezeptoren. Nach der Bindung des Liganden an den Rezeptor kommt es zu einer Konformations¨anderung im Rezeptor.

Diese Konformations¨anderung wird auf ein Kopplungsprotein, Guanylnucleotidbindungs-protein (G-Protein), ¨ubertragen. Nach der Bindung des Liganden verliert die α-Unter-einheit des G-Proteins seine hohe Affinit¨at gegen¨uber Guanosindiphosphat (GDP). Es kommt zu einem Austausch von GDP gegen Guanosintriphosphat (GTP). Zusammen mit dem gebundenen GTP l¨ost sich die aktivierteα-Untereinheit vom Rezeptor und kann nun das Adenylatzyklasesystem aktivieren. Nachfolgend entsteht so aus Adenosintriphosphat (ATP) das zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP), welches im Zytosol seine Wirkung entfaltet, indem es durch Bindung an Proteinkinasen dieselben aktiviert. Die aktivierten Proteinkinasen katalysieren ihrerseits die Phosphorylierung von Enzymen oder anderen regulatorischen Proteinen (THEMMEN u. HUHTANIEMI, 2000).

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Im tiefen saisonalen An¨ostrus zeigen Stuten im Regelfall niedrige FSH-Konzentrationen.

Jedoch wurden auch gelegentlich hohe Werte gemessen, die allerdings ohne palpierba-re Follikelaktivit¨at einhergingen. Daher scheint die unpalpierba-regelm¨aßige FSH-Fpalpierba-reisetzung im An¨ostrus nicht in der Lage zu sein, die Follikelentwicklung zu stimulieren, denn zu die-ser Zeit blieb der Follikeldurchmesdie-ser unter 2 cm, und es bestanden keinerlei Anzeichen einer Follikelproliferation (EVANS und IRVINE, 1979). Wurde Stuten in diesem Stadi-um nach einem bestimmten Regime ein Hypophysenextrakt verabreicht, welches eLH und eFSH enthielt, ließ sich ein Follikelwachstum bis zur pr¨aovulatorischen Gr¨oße induzieren (DOUGLAS et al., 1974; LAPIN und GINTHER, 1977), was bei alleiniger Gabe von hCG (LH-Wirkung) nicht zu erreichen war (DAY, 1940).

2.2.2.4 Steroide und Inhibin: Struktur, Sekretion und Wirkungen

Alle Steroidhormone haben Cholesterol (C 27) zur Vorstufe und weisen mit vier Ring-molek¨ulen die gleiche chemische Grundstruktur auf. Jedoch unterscheiden sie sich durch die anh¨angenden funktionellen Gruppen sowie hinsichtlich der Anzahl und Lokalisation der Doppelbindungen. Im Rahmen der Steroidbiosynthese werden aus Lipoproteinen ¨uber Cholesterol die Hormone Progesteron, Androstendion und ¨Ostradiol-17β gebildet. Dabei findet eine enge Interaktion zwischen der Thekazellschicht und den Granulosazellen statt.

Nach der

”Zwei Zellen- Zwei Hormon-Theorie“ bilden die Zellen der Theka interna unter LH-Einfluss ¨uber Cholesterol und Progesteron das Androstendion. Aus Androstendion wird Testosteron synthetisiert, welches dann in den Granulosazellen unter FSH-Einfluss zu ¨Ostradiol-17β umgewandelt wird. Folglich liefern die Zellen der Theka interna nicht nur Androgene, die in Granulosazellen aromatisiert werden, sondern sie nutzen auch das in den Granulosazellen synthetisierte Progesteron zur Androgensynthese. Voraussetzung f¨ur die Steroidbiosynthese ist jedoch auch die Synthese der f¨ur die jeweiligen Reakti-onsschritte verantwortlichen Enzyme. Die notwendige Proteinbiosynthese dieser Enzyme wird durch die LH- bzw. FSH-induzierte Genexpression eingeleitet (CONLEY et al., 1995;

BERNDTSON et al., 1995; XU et al., 1995).

Bei der nicht tragenden Stute ist ¨Ostradiol (17β- ¨Ostradiol; E2) das vorherrschende ¨ Ostro-gen in der Follikelfl¨ussigkeit sowie im Blut. Zu Beginn des ¨Ostrus, also etwa am 14. Tag des Zyklus, steigt unter FSH-Einfluss die ¨Ostradiol-Konzentration im Blut gleichm¨aßig an und erreicht ein bis zwei Tage vor der Ovulation ein Maximum (PATTINSON et al., 1974; HILLMAN u. LOY, 1975; NODEN et al., 1975; IRVINE, 1981). Nach der Ovulation sinkt der Plasma¨ostrogenspiegel und erreicht am Ende des ¨Ostrus die geringen Basal-werte des Di¨ostrus (PATTINSON et. al., 1974; MANTRI et al., 1985; MEINECKE et al., 1987). In einer Untersuchung von NODEN et al. (1975) stieg der ¨Ostradiolbasalwert von etwa 2,2 pg/ml, gemessen am zweiten und dritten Tag vor ¨Ostrusbeginn, auf Kon-zentrationen von 11,5 pg/ml ein bis zwei Tage ante ovulationem an. Nach Angaben von HOPPEN (1995) schwanken die Plasma¨ostradiolkonzentrationen bei der Stute w¨ahrend des gesamten ¨Ostrus in Bereichen zwischen 10 und 20 pg/ml.

W¨ahrend des ¨Ostrus liegt die Plasmaprogesteronkonzentration in einem Bereich von

<1 ng/ml (ALLEN u. HADLEY, 1972; ALLEN u. HADLEY, 1974; TERBLANCHE u.

MAREE, 1981; MEINECKE et al., 1987; MICHEL, 1989). Etwa sechs Tage nach erfolgter Ovulation werden bei der zu dieser Zeit maximalen Syntheseleistung des Corpus luteum im Plasma Progesteronh¨ochstwerte von 9–12 ng/ml erreicht (HUGHES et al., 1980; FAY u. DOUGLAS, 1987; WATSON u. SERTICH, 1990), welche w¨ahrend der Lutealphase gehalten werden. NODEN et al. (1975) konnten in dieser Plateauphase Serumprogeste-ronwerte von 16 ng/ml messen. Dann erfolgt im Zuge der Luteolyse ein rapider Abfall

¨

uber einen Zeitraum von 24–48 Stunden (TERBLANCHE u. MAREE, 1981) auf niedrige Basalwerte des nachfolgenden ¨Ostrus.

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Abbildung 1: Plasmakonzentrationen von LH und FSH der nicht tragenden Stute nach DAELS und HUGHES (1993), ¨Ostradiol qualitativ

PSfrag replacements

Abbildung 2: Plasmakonzentrationen von Progesteron der nicht tragenden Stute nach DAELS und HUGHES (1993), PGF2α qualitativ

Im Gegensatz zu Angaben ¨uber Steroidhormonkonzentrationen im Plasma liegen Daten zu Steroidhormonkonzentrationen in der Follikelfl¨ussigkeit von Pferden nur in begrenztem Umfang vor. COLLINS et al. (1997) f¨uhrten Untersuchungen zu Hormonkonzentrationen in der Follikelfl¨ussigkeit im Verlauf der Follikelentwicklung durch. W¨ahrend des domi-nanten Stadiums des Follikels konnte ein Anstieg der ¨Ostradiolkonzentrationen gemessen werden (1083±489 ng/ml). Im pr¨aovulatorischen Follikel zeigte sich mit ¨ Ostradiolkon-zentrationen von 3102±510 ng/ml ein Peak, gefolgt von einem geringen und nicht signi-fikantem Absinken der Konzentrationen im Ovulationsfollikel (2039±234 ng/ml) sowie einem signifikantem Abfall der ¨Ostradiolkonzentrationen im pr¨aovulatorisch luteinisier-ten Follikel auf 248±131 ng/ml. Zwischen den verschiedenen Follikelentwicklungsstadien unterschieden sich die mittleren Progesteronkonzentrationen mit 13±2 ng/ml im domi-nanten, 43±10 ng/ml im pr¨aovulatorischen, 819 ±53 ng/ml im Ovulationsfollikel und 6964±1262 ng/ml im pr¨aovulatorisch luteinisierten Follikel deutlich. Die Untersuchun-gen von R ¨ODIGER (2000) decken sich bez¨uglich der Progesteronkonzentrationen in der Follikelfl¨ussigkeit mit den Ergebnissen von COLLINS et al. (1997).

Ostradiol stimuliert bei der Stute das typische Rosseverhalten und bedingt Ver¨anderungen¨ am Uterus in Form von Proliferation und verst¨arkter Durchblutung des Endometriums.

Sonographisch stellt sich die entstehende ¨Odematisierung des Endometriums in Form der charakteristischen

”Radspeichenstruktur“ dar. Zwischen Auftreten und Verschwinden der

”Radspeichenstruktur“ und dem ¨außeren Rosseverhalten der Stute besteht ein zeitlicher Zusammenhang (HAYES et al., 1985). ¨Ostradiol und Progesteron sind Teil eines komple-xen Feedback-Mechanismus. So stimuliert ¨Ostradiol w¨ahrend des ¨Ostrus die LH-Sekre-tion und hemmt die FSH-Freisetzung (PATTINSON et al., 1974; NODEN et al., 1975;

GARCIA et al., 1979), w¨ahrend Progesteron im Di¨ostrus die FSH-Sekretion stimuliert und die LH-Freisetzung vermindert (IRVINE, 1981).

Neben den genannten Steroidhormonen hat auch das Hormon Inhibin Einfluss auf das Re-produktionssystem. Inhibin, welches in Sertolizellen bzw. Granulosazellen gebildet wird, geh¨ort zur Gruppe der Proteohormone und setzt sich aus einer α- und einer β -Unterein-heit zusammen, welche ¨uber Disulfidbr¨ucken miteinander verbunden sind. Innerhalb einer

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Spezies gibt es nur eine α-Untereinheit, w¨ahrend es zwei verschiedene β-Untereinheiten, genannt βA und βB, gibt. Die Kombination einer α-Untereinheit mit einer der β-Unter-einheiten ergibt das biologisch aktive Inhibin (Inhibin A oder Inhibin B). Unter Einfluss von Inhibin kommt es zu einem rapiden Absinken der mRNA-Menge f¨ur die FSH-β-Un-tereinheit. Im Gegensatz dazu ist der Effekt des Inhibins auf die FSH-Sekretion relativ langsam, was zu der Hypothese f¨uhrte, dass der Wirkungsmechanismus der durch Inhibin verminderten FSH-Sekretion in der Hemmung der FSH-Synthese begr¨undet ist. Die LH-Synthese wird durch Inhibin nicht beeinflusst (NETT, 1993).

2.2.3 Endokrine Regulation der Corpus luteum-Funktion

2.2.3.1 Allgemeines

Nach der Ovulation entwickelt sich der Gelbk¨orper (Corpus luteum). Das Hauptprodukt des Corpus luteum ist Progesteron, welches vielf¨altige Funktionen, einschließlich der des Erhaltes der Tr¨achtigkeit hat. Aufgrund der besonderen Struktur des equinen Ovars ist das Corpus luteum in das Ovarstroma eingebettet. Etwa am 3. Tag post ovulationem erreicht der Gelbk¨orper der Stute bereits einen maximalen Durchmesser, w¨ahrend eine maximale Progesteronsekretion nicht vor dem 9. Tag nach der Ovulation messbar ist (NETT et al., 1976b).