Primäre Immunsuppression mit Cyclosporin A oder Tacrolimus nach allogener Lugentransplantation im porcinen Modell

Aus der Abteilung für Herz-, Thorax- und Gefäßchirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover

Leiter: Prof. Dr. med. Axel Haverich

Primäre Immunsuppression mit Cyclosporin A oder Tacrolimus nach allogener Lungentransplantation im porcinen Modell

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Renate Reinhardt

aus Cloppenburg Hannover, 2007

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 05.06.2008 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinschen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. Martin Strüber

Referent: Prof. Dr. Marius Höper Tag der mündlichen Prüfung: 05.06.2008 Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. Herrmann Haller Prof. Dr. Klaus Otto Prof. Dr. Christian Klein

1. Einleitung ...4

1.1 Geschichte der Lungentransplantation... 4

1.2 Indikationen... 4

1.3 Abstoßung... 5

1.3.1 Hyperakute Abstoßung ... 6

1.3.2 akute Abstoßung... 6

1.3.2.1 Pathogenese... 6

1.3.2.2 Diagnostik ... 7

1.3.2.3 Therapie ... 8

1.3.3 Chronische Abstoßungsreaktion bzw. Bronchiolitis obliterans Syndrom (BOS) ... 8

1.3.3.1 Risikofaktoren für ein Bronchiolitis obliterans Syndrom ... 8

1.3.3.2 Pathogenese... 10

1.3.3.3 Diagnostik ... 10

1.4 Toleranzinduktion... 11

1.4.1 Zentrale Toleranz ... 11

1.4.2 Lympho-hämatopoetischer Chimärismus... 12

1.4.3 Periphere Toleranz... 13

1.4.3.1 Phänotypische Charakterisierung von regulatorischen T-Zellen... 13

1.4.3.2 Bedeutung kostimulatorischer Signale für die periphere Toleranz ... 14

1.5 Immunsuppressive Therapie... 15

1.5.1 Cyclosporin A ... 17

1.5.2 Tacrolimus (FK506) ... 18

Wirkmechanismen von Cyclosporin A und Tacrolimus... 20

1.6 Versuchsmodelle... 20

1.6.1 Versuchskonzepte... 20

1.6.2 Versuchstiere... 23

1.6.3 Operation ... 24

1.7 Ziel der Arbeit... 26

2. Material und Methoden...27

2.1 Versuchstiere... 27

2.2 Operation des Spenders... 28

2.2.1 Anästhesie... 28

2.2.2 Lungenexplantation ... 28

2.3 Operation des Empfängers... 29

2.3.1 Anästhesie... 29

2.3.2 Katheterimplantation ... 30

2.3.3 Lungenexplantation ... 30

2.3.4 Lungenimplantation... 31

2.4 Einteilung der Gruppen und Versuchskonzept... 32

2.4.1 MHC-in-kompatible Paarung (major histocompatibility complex) ... 32

2.5 Studienmedikation... 32

2.5.1 Immunsuppressive Therapie der Cyclosporin-Gruppe... 33

2.5.2 Immunsuppressive Therapie der Tacrolimus-Gruppe... 33

2.6 Medikamentenspiegelbestimmung... 33

2.6.1 Bestimmung des Cyclosporinspiegels ... 33

2.6.2 Bestimmung des Tacrolimusspiegels... 34

2.7 Röntgenuntersuchung... 34

2.8 Bronchoskopie... 35

2.8.1 Bronchoalveoläre Lavage (BAL) ... 35

2.8.2 Transbronchiale Biopsienentnahme... 36

2.9 Autopsie... 36

2.10 Aufarbeitung der Biopsien... 36

2.10.1 Anfertigung von Paraffinschnitten... 36

2.10.2 HE Färbung... 37

2.11 Gewinnung und Aufarbeitung der Blutproben... 37

2.11.1 Blutentnahme ... 37

2.11.2 Blutgasanalyse... 38

2.11.3 Blutuntersuchung... 38

2.11.4 Isolierung von Blutlymphozyten ... 38

2.11.5 Einfrieren von Zellen ... 39

2.11.6 Zellaufbereitung aus lymphatischem Gewebe... 39

2.11.7 Färbung der Lymphozyten für die Durchflusszytometrie... 40

2.11.8 Durchflusszytometrie... 41

2.12 Gemischte Lymphozytenreaktion (Mixed lymphocyte reaction; MLR)... 43

2.13 statistische Auswertung... 44

3. Ergebnisse ...46

3.1 Transplantatüberleben... 46

3.2 Postoperativer Verlauf bei der Cyclosporin-Gruppe... 47

3.3 Postoperativer Verlauf bei der Tacrolimus-Gruppe... 54

3.4 SLA Typisierung... 61

3.5 Medikamentenblutspiegel... 62

3.6 Nierenwerte... 63

3.7 Gewicht... 64

3.8 Leukozyten und Lymphozyten im Differentialblutbild... 64

3.9 Durchflusszytometrische Analyse... 65

3.10 Peripherer Blutchimärismus... 66

3.11 Gemischte Lymphozytenreaktion... 68

4. Diskussion...69

4.1 Diskussion der Methoden... 69

4.1.1 Versuchsprotokoll ... 69

4.1.2 Diagnostik der Abstoßungsreaktion ... 70

4.1.3 Medikamentöse Therapie... 71

4.1.4 Labormethoden ... 73

4.2 Kritik der Ergebnisse... 75

4.2.1 Überleben der Versuchstiere... 75

4.2.2 Ergebnisse der Durchflusszytometrie... 79

4.3 Bedeutung und Aussicht der Arbeit... 80

5. Zusammenfassung ...82

6. Anhang ...84

6.1 Grading der Röntgenthoraxbilder... 84

6.2 Grading nach Yousem... 84

7. Literaturverzeichnis ...85

Thema

Primäre Immunsuppression mit Cyclosporin A oder Tacrolimus nach allogener Lun- gentransplantation im porcinen Modell

1. Einleitung

1.1 Geschichte der Lungentransplantation

Die Lungentransplantation ist heute eine akzeptierte Behandlungsmethode terminaler Lungen- Erkrankungen. Erstmalig wurde im Jahre 1963 von Hardy eine Lungentransplantation bei einem Patienten mit Bronchialkarzinom durchgeführt. Zwischen der ersten Transplantation im Jahr 1963 und dem Jahr 1970 wurden insgesamt weltweit von 20 Chirurgen Lungentransplan- tationen durchgeführt. Von den 23 in diesem Zeitraum transplantierten Patienten überlebte nur etwa die Hälfte die erste Woche nach Transplantation. Neben technisch chirurgischen Problemen und der Unkenntnis der Methoden zur Konservierung der Spenderlungen war ins- besondere die medikamentöse immunsuppressive Therapie noch nicht ausgereift¹.

Die Entdeckung des Calcineurininhibitors Cyclosporin A trug entscheidend zur Wende in der Geschichte der Lungentransplantation bei². Eine erste erfolgreiche Herz- Lungentransplantation gelang dem Chirurgen Reitz an der Universität Stanford in den USA im Jahre 1981³. Nach 1981 entwickelten sich die operativen Erfahrungen sowie die medika- mentösen Therapieoptionen rapide weiter. Die 3-Jahresüberlebensrate nach Lungentransplan- tation in den Jahren 1997-1999 ist jedoch mit 73% für Kinder und 61% für erwachsene Pati- enten immer noch deutlich niedriger als die nach Herztransplantation. Hierfür ist vor allem die chronische Abstoßungsreaktion nach der Lungentransplantation verantwortlich⁴.

1.2 Indikationen

Als häufigste Indikationen zur Lungentransplantation bzw. zur Herz-Lungentransplantation gelten chronisch obstruktive Lungenerkrankungen, zystische Fibrose, pulmonale Hypertonie und Lungenfibrose. In der medizinischen Hochschule Hannover stellen die Lungenfibrose, obstruktive Lungenerkrankungen und die zystische Fibrose die am häufigsten vorkommenden Indikationen dar⁵.

Als technische Varianten werden Einzellungen-, Doppellungen- und Herz-Lungen- Transplantation vorgenommen. Jede Variante hat eigene Indikationskriterien. Bei einer idio-

pathischen Lungenfibrose wird eine Einzellungentransplantation bevorzugt. Bei obstruktiven Erkrankungen wie dem Emphysem wird in Abhängigkeit von Lebensalter und Dringlichkeit eine sequentielle bilaterale oder eine Einzellungentransplantation und bei Herzbeteiligung wie bei dem Eisenmenger-Syndrom und anderen kongenitalen Herzerkrankungen, aber auch bei der pulmonalen Hypertonie mit schwerer Rechtsherzinsuffizienz, wird eine Herz- Lungentransplantation durchgeführt. Der Transplantationserfolg unterscheidet sich bei ver- schiedenen Indikationen. Für Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose oder zystischer Fibrose kann eine Transplantation das Überleben signifikant verbessern. Bei obstruktiven Lungenerkrankungen hingegen muss man die Transplantation eher als eine die Lebensqualität verbessernde Therapie bewerten⁶.

Zu den wenigen absoluten Kontraindikationen zählen HIV-Infektionen und weniger als 5 Jah- re zurückliegende maligne Erkrankungen. Zu den relativen Kontraindikationen gehört Niko- tinkonsum in den vorangegangenen 6 Monaten und ein reduzierter Allgemeinzustand, der durch das Körpergewicht, welches nicht unter 70% und nicht über 130% des Idealgewichtes liegen sollte, durch das Alter und durch den Grad der respiratorischen Insuffizienz bedingt sein kann. Weitere relative Kontraindikationen sind terminale Organerkrankungen zum Bei- spiel der Niere sowie Systemerkrankungen wie zum Beispiel Vaskulitiden. Außerdem sollten die Patienten psychisch gesund sein und die zur Therapie nötige Compliance aufbringen kön- nen. Nicht zu vernachlässigen sind chirurgische Probleme wie zum Beispiel schwere Thorax- deformitäten, welche die praktische Durchführung der Transplantation behindern könnten^{7 8}. Die relativen Kontraindikationen müssen individuell geprüft werden, denn bei Erfolg verspre- chenden Gesundungsaussichten kann von ihnen abgewichen werden. Auch der Spender der Lunge muss neben der Blutgruppen-Kompatibilität weitere Kriterien erfüllen. Alter, Größe und Vorerkrankungen müssen bei der Auswahl des Spenders geprüft werden⁹. Grob umrissen kann man sagen, dass Lebensqualität, Ausschöpfung anderer Therapieoptionen und das Vo- ranschreiten der Krankheit letztendlich bei der Entscheidung zur Transplantation ausschlag- gebend sind.

1.3 Abstoßung

Zu den gefährlichsten Komplikationen nach Lungentransplantation gehört die Abstoßungsre- aktion. Daher ist die Erforschung der Pathogenese von Abstoßungsreaktionen und der thera- peutischen Möglichkeiten eine entsprechende Voraussetzung zur Verbesserung der Überle- bensrate transplantierter Patienten. Zur Konkretisierung der Therapieoptionen soll im Folgen- den zunächst ein kurzer Überblick über den gegenwärtigen Forschungsstand hinsichtlich der

Pathogenese der Abstoßungsreaktion und der bekannten medikamentösen Therapiemöglich- keiten gegeben werden. Die Transplantatabstoßung wird in die hyperakute, die akute und die chronische Abstoßungsreaktion unterteilt.

1.3.1 Hyperakute Abstoßung

Die hyperakute Abstoßung ist ein selteneres humorales Phänomen, das auf der Wirkung von präformierten Antikörpern beruht. Die präformierten Alloantikörper können durch die Akti- vierung des Komplementsystems innerhalb von wenigen Stunden zum Verlust des Transplan- tats führen. Ursache für die Entstehung der präformierten Alloantikörper kann die Antigenex- position in Folge von Bluttransfusionen, Schwangerschaften und vorangegangenen Organ- transplantationen sein¹⁰. Um eine hyperakute Abstoßungsreaktion zu verhindern, wird vor einer soliden Organtransplantation eine so genannte Crossmatch Untersuchung durchgeführt, die HLA und AB0-Inkompatibilität überprüft. Hierbei wird die Reaktion von Spenderlym- phozyten gegen Empfängerserum untersucht. Im Falle einer positiven Crossmatch Untersu- chung ist die Gefahr einer hyperakuten Abstoßungsreaktion stark erhöht. Dies wurde in Ein- zelfällen¹¹ aber auch bei einer größeren Studie im Bereich der Nierentransplantation¹² heraus- gefunden. Zusätzlich wird der PRA-(panel reactive antibody)-Test bei potentiellen Organ- empfängern durchgeführt, ob Alloantikörper in Folge von Transfusionen oder Schwanger- schaften vorhanden sind¹³. Wenn der PRA-Test positiv ist, muss die HLA Spezifität der Allo- antikörper bestimmt werden. Daraufhin kann für den Organempfänger ein Organ gewählt werden, gegen dessen MHC-Allele keine Antikörper gerichtet sind.

1.3.2 akute Abstoßung 1.3.2.1 Pathogenese

Die akute Abstoßungsreaktion wird in der Regel durch eine zelluläre Immunreaktion hervor- gerufen. Insbesondere in den ersten drei bis sechs Monaten, mit einem Häufigkeitsgipfel 2-3 Wochen nach einer Transplantation, gelegentlich aber auch noch Jahre nach der Transplanta- tion, kann es zu dieser Abstoßungsform kommen. Man vermutet, dass die Mehrzahl aller Pa- tienten zumindest eine milde akute Abstoßungsreaktion durchläuft, die jedoch nicht immer klinisch apparent wird.

Der Verlauf der Abstoßung lässt sich in drei Phasen unterteilen. In der so genannten afferen- ten Phase treten direkt oder indirekt die T-Lymphozyten mit Spenderantigenen in Kontakt.

Bei dem direkten Kontakt werden Antigene, vor allem MHC Antigene des Spenderorgans von antigen-präsentierenden Zellen, die vom Spender stammen, den Lymphozyten des Empfän-

gers präsentiert. Hierbei werden TH1-Zellen und in geringerem Ausmaße auch TH2-Zellen aus der CD4⁺ und CD8⁺ Population aktiviert. Als indirekte Kontaktaufnahme bezeichnet man die Alloantigenexpression durch antigen-präsentierende Zellen, die vom Empfänger stammen, und phagozytiertes Spender-MHC im Empfänger-MHC-Kontext präsentieren¹⁴.

Nach der afferenten Phase folgt die zentrale Phase. Um die T-Lymphozyten erfolgreich zur Proliferation anzuregen, muss einerseits als erstes Signal der TCR (T cell receptor)-CD3 Komplex aktiviert werden (Signal 1), aber andererseits sind kostimulatorische Signalwege zum Beispiel über CD28 (Signal 2) von entscheidender Bedeutung. Die aktivierten Lympho- zyten exprimieren und produzieren nun verstärkt IL2 und andere Zytokine. Im Anschluss dar- an beginnt die efferente Phase, in der sich CD4⁺-Zellen und CD8⁺-Zellen im Spendergewebe ansammeln. Besonders die Zytokine vom TH1-Typ (IL2; IFNy; TNF) sind dominierend an diesen Prozessen beteiligt. Im entzündlichen Infiltrat selbst können Eicosanoide, Kinine, PAF und prokoagulatorische Mediatoren nachgewiesen werden. Die direkt aktivierten CD8⁺ zyto- toxischen T-Lymphozyten (CTL) greifen die MHC-I-exprimierenden Spenderzellen direkt an und zerstören diese durch lokale Freisetzung von Perforin und andere zytotoxischen Media- toren. Direkt und indirekt aktivierte CD4⁺ Helferzellen aktivieren ihrerseits Makrophagen und B-Lymphozyten. Die beschriebenen immunologischen Prozesse führen zunächst zu funktio- nellen Störungen des Transplantats wie beispielsweise zu Gefäßkonstriktionen und zu Ödem- bildungen. Danach wird das Gewebe nekrotisch und eine intravasale Gerinnung wird ausge- löst¹⁵. Klinisch kann die beschriebene vehemente Zytokinfreisetzung bei dem Patienten ein allgemeines Krankheitsgefühl mit Fieber und anderen unspezifischen Symptomen hervorru- fen.

1.3.2.2 Diagnostik

Die Diagnose der akuten Abstoßungsreaktion wird mit Hilfe von Laborparametern wie Blut- gaswerten, Blutbildern, Entzündungsparametern (CRP), Röntgenbildern und bronchoskopi- schen Untersuchungen klinisch gestellt. Neben der Diagnose Abstoßung müssen auch andere Differentialdiagnosen, zum Beispiel Infektionen-, als Ursache für die klinische Verschlechte- rung des Patientenzustandes in Betracht gezogen werden. In der Frühphase der Lungentrans- plantation wurde die Diagnose oft vom Pathologen aus transbronchialen Biopsien gestellt und nach den so genannten ISHLT Kriterien bewertet¹⁶. Mindestens 5 separate Gewebsproben müssen entnommen werden, um die Diagnose akute Abstoßung und ein korrektes Grading dieser zu ermöglichen¹⁷ .

1.3.2.3 Therapie

Die akute Abstoßung ist in vielen Fällen mit einer hochdosierten dreitägigen Kortisonstoßthe- rapie und mit einer Erhöhung der Dosierung anderer Immunsuppressiva gut therapierbar. Bei einem refraktären Verlauf können Antilymphozytenantikörper wie OKT3 oder Antithymo- zytenglobulin verabreicht werden. In vielen Fällen wird eine auf Cyclosporin A basierende Therapie auf Tacrolimus umgestellt und die immunsuppressive Therapie intensiviert, wo- durch oftmals das Wiederauftreten von akuten Abstoßungsreaktionen verhindert werden kann.

1.3.3 Chronische Abstoßungsreaktion bzw. Bronchiolitis obliterans Syndrom (BOS)

Im Gegensatz zur akuten Abstoßung ist die chronische Abstoßung sehr schlecht therapierbar und führt langfristig oftmals irreversibel zum Organversagen. Die einzige bleibende Thera- pieoption ist dann eine Retransplantation. Bei der chronischen Abstoßungsreaktion kommt es langsam aber progredient zu einer Verschlechterung der Lungenfunktionsparameter, wobei das Voranschreiten der Abstoßung häufig zusätzlich durch Infektionen getriggert wird. Im Gegensatz zur akuten Abstoßungsreaktion verläuft die chronische Abstoßungsreaktion oft wesentlich langsamer und wird erst spät in Form von zunehmender Obstruktion symptoma- tisch. Vor allem die indirekte T-Zell-Aktivierung, also die Aktivierung durch antigen- präsentierende Zellen des Empfängers, die Spenderantigen präsentieren¹⁸, ist zusammen mit humoralen Abwehrmechanismen an ihrer Entstehung beteiligt¹⁹. Die chronische Abstoßungs- reaktion nach einer Lungentransplantation ist mit dem so genannten Bronchiolitis obliterans Syndrom identisch. Das Bronchiolitis obliterans Syndrom zeichnet sich durch eine häufig erst spät auftretende Klinik aus. Die Patienten leiden unter unspezifischen Symptomen wie zum Beispiel unter Hustenreiz und Einschränkung der Lungenfunktion.

1.3.3.1 Risikofaktoren für ein Bronchiolitis obliterans Syndrom

Die Pathogenese des Bronchiolitis obliterans Syndroms ist vielfältig. Als erwiesene Risiko- faktoren für die Entwicklung eines Bronchiolitis obliterans Syndroms gelten die Häufigkeit und die Schwere akuter Abstoßungsepisoden, die lymphozytäre Bronchitis bzw. Bronchiolitis nicht viraler Genese, der Grad des HLA-Mismatches²⁰ sowie Cytomegalievirus (CMV)- Infektionen und die Incompliance des Patienten hinsichtlich der Medikamenteneinnahme.

Eine CMV-Infektion führt zur Schädigung des vaskulären Endothels und zur Erhöhung von inflammatorischen Faktoren. Diese Wirkungen sind maßgeblich an der Entwicklung eines Bronchiolitis obliterans Syndroms beteiligt. Insbesondere die Transplantation einer CMV- positiven Lunge in einen CMV-negativen Empfänger scheint risikoreich für die Entwicklung

eines Bronchiolitis obliterans Syndroms zu sein²¹. In neueren immunologischen Studien wird die so genannte heterologe Immununität für den Zusammenhang zwischen Abstoßungsreakti- onen und viralen Infekten verantwortlich gemacht. Heterologe Immunität bedeutet die Kreuz- reaktion von Spenderantigenen mit T-Zell-Rezeptoren, die spezifisch für virale Antigene sind, wie beispielsweise für CMV, auf Grund von Homologien mit Peptidsequenzen von Alloanti- genen²². Deshalb werden viele Strategien zur Prophylaxe bzw. zur besonders effektiven Be- handlung solcher CMV-Infektionen entwickelt²³. Viele Forscher halten das fehlende HLA- Match hinsichtlich der minor und major Histokompatibilitätskomplexe für einen der Hauptri- sikofaktoren für die Entwicklung eines Bronchiolitis obliterans Syndroms^{24 25}. Das Problem hinsichtlich dieser Beobachtung besteht in der Umsetzbarkeit von Verbesserungen. Bei der geringen Anzahl an geeigneten Spenderorganen und der oftmals bestehenden Dringlichkeit ist es praktisch unmöglich die nötige HLA-Kompatibilität zu gewährleisten²⁶.

Zu den potentiellen Risikofaktoren zählen ein höheres Patientenalter, eine verlängerte Ischä- miezeit des Transplantates²⁷ und vermutlich chronische Infektionen mit atypischen Erregern zum Beispiel mit Clamydia pneumoniae²⁸. Während die CMV-Infektion höchstwahrschein- lich zur Entwicklung eines Bronchiolitis obliterans Syndroms beiträgt, wird die Gefährdung durch andere Infektionen des Respirationstraktes kontrovers diskutiert. Respiratorische Viren werden beispielsweise in einigen Studien nicht für die Pathogenese eines Bronchiolitis oblite- rans Syndroms verantwortlich gemacht²⁹. Es gibt mehrere unterschiedliche Hypothesen, wie die verlängerte Ischämie des Transplantates im Kontext mit dem Bronchiolitis obliterans Syn- droms steht. Eine Studie beschreibt zum Beispiel, dass die bronchialen Epithelzellen eine we- sentlich tragendere Rolle bei der Entstehung des Bronchiolitis obliterans Syndroms haben als bisher vermutet. Wenn sie geschädigt werden, möglicherweise durch eine verlängerte I- schämie, können sie über erhöhte IL6 und IL8-Produktion Lymphozyten aktivieren und natür- liche Killerzellen anlocken³⁰.

Mögliche weitere Risikofaktoren sind: Genpolymorphismus von Zytokinen³¹ und gastro- ösophagealer Reflux. Der Zusammenhang zwischen gastroösophagealem Reflux und dem Bronchiolitis obliterans Syndrom erklärt sich aus der chronischen Aspiration von Mageninhalt und daraus resultierenden Magensäure-vermittelten Schädigungen des Lungengewebes. Der genaue Pathomechanismus ist allerdings noch nicht geklärt, aber die Korrelation zwischen Patienten mit gastroösophagealem Reflux und dem Bronchiolitis obliterans Syndrom weist auf eine kausale Beziehung hin. Hinzu kommt, dass gastroösophagealer Reflux gehäuft bei

transplantierten Patienten vorkommt, was wahrscheinlich eine Folge der Immunsuppression mit Cyclosporin A oder Tacrolimus ist³².

1.3.3.2 Pathogenese

Das Bronchiolitis obliterans Syndrom ist eine Erkrankung der kleineren Bronchien und Bron- chiolen, die durch eine lymphohistiozytär vermittelte Zytotoxizität hervorgerufen wird. Zu- nächst wird die Submukosa des Bronchialepithels von Lymphozyten infiltriert, welche die Basalmembran überwunden haben. Dann kommt es zur Zellnekrose und zur Enukleation des Epithels, an der spezifische inflammatorische Mechanismen beteiligt sind. Hierdurch ange- regt, wandern Fibroblasten und Myofibroblasten in das Entzündungsgebiet ein. Je stärker die Entzündung voranschreitet, desto mehr wächst das Granulationsgewebe in das Bronchus- lumen hinein. Das Bronchiolitis obliterans Syndrom ist ein sehr heterogenes Krankheitsbild, bei welchem unterschiedliche Grade von Entzündungen parallel zueinander existieren kön- nen. Dieses Phänomen erklärt auch, warum die Symptomatik bei Patienten mit Bronchiolitis obliterans Syndrom noch verbessert werden kann, obgleich dieses prinzipiell irreversibel ist.

Wenn es gelingt durch eine Erhöhung der Immunsuppression oder aber durch andere Thera- pieformen das Bronchiolitis obliterans Syndrom einzudämmen, können Lungenabschnitte, in denen die Entzündung nicht so stark vorangeschritten ist, das Defizit anderer Gewebsbezirke ausgleichen³³. Viel versprechend im Hinblick auf therapeutische Optionen ist der Wechsel von einer auf Cyclosporin A basierenden Therapie zu Tacrolimus³⁴.

1.3.3.3 Diagnostik

Histologisch kann die Diagnose eines Bronchiolitis obliterans Syndroms aus kleinen Biop- sien, bedingt durch den heterogenen Befall des Gewebes, nur schwer gestellt werden. Daher werden klinische Lungenfunktionsparameter für die Diagnosestellung herangezogen. Im Jahre 1993 wurden erstmals klinische Kriterien für das Bronchiolitis obliterans Syndrom festgelegt.

Eine Verschlechterung des FEV1 („forced expiratory volume“) um mehr als 20% kann auf ein Bronchiolitis obliterans Syndrom hinweisen. Zusätzlich sollte aber auch die MEF25-75 („middle expiratory flow rate“) zur Diagnosestellung hinzugezogen werden, da viele Studien diesen Parameter als sehr sensitiv für ein Bronchiolitis obliterans Syndrom bewerten³⁵. Neben den zuvor genannten klinischen Parametern, die auf ein Bronchiolitis obliterans Syndrom hinweisen, kann auch die bronchoalveoläre Lavage zur Diagnostik herangezogen werden. Vor allem die Differentialanalyse der Leukozyten kann bei der Unterscheidung von infektiösen und immunologischen Abwehrmechanismen hilfreich sein. Außerdem gibt es viele experi-

mentelle Ansätze andere immunmodulatorische Mediatoren in der bronchoalveolären Lavage nachzuweisen, die möglicherweise im Zusammenhang mit einer chronischen Abstoßungsre- aktion stehen. In der bronchoalveolären Lavage erkrankter Patienten konnten in vielen Stu- dien vermehrt neutrophile Granulozyten, aber auch die Erhöhung von IL8 und IL12³⁶ auf Grund des oxidativen Stresses, neutrophiler Elastase, TGF-β, plated derived growth factor (PDGF-1), Collagen 1 und 3 und insulin like growth factor 1³⁷ nachgewiesen werden.

1.4 Toleranzinduktion

Neben der Behandlung der Abstoßung nach Lungentransplantation, ist die Entstehung von Toleranz ein entscheidender Forschungsaspekt. Der Begriff Toleranz bezeichnet die langfris- tige Akzeptanz von Spendergewebe im Empfängerorganismus ohne jeglichen Bedarf an Im- munsuppressiva. Ein Patient, der unter medikamentöser Immunsuppression ein Spenderorgan nicht abstößt, kann demnach nicht als tolerant angesehen werden. Die immunologische Ab- wehrreaktion seines Organismus wird nur unterdrückt. Das Spendergewebe wird jedoch im- mer noch als MHC-inkompatibles Transplantat von den Lymphozyten erkannt. Ziel der Tole- ranzinduktion ist es, dass der Empfängerorganismus die spenderspezifischen Antigene wie körpereigene Antigene interpretiert und auch ohne Immunsuppression keine Abstoßungsreak- tion auslöst. Man gliedert die immunologische Toleranz in die zentrale Toleranz und die peri- phere Toleranz.

1.4.1 Zentrale Toleranz

Zentrale Toleranz kann durch die Etablierung eines so genannten lymphohämatopoetischen Makrochimärismus durch Empfängerkondition und Spenderknochenmark Kotransplantation induziert werden. Der Mechanismus ist hierbei vergleichbar der Entwicklung von Toleranz gegenüber Autoantigenen. Die Beobachtung, dass Fremdantigene vom Immunsystem als sol- che erkannt und gezielt angegriffen werden, während die Eigenantigene des Organismus tole- riert werden, führte schon in den 50 er Jahren zu einem Erklärungsmodell, das auf dem Phä- nomen der klonalen Deletion beruht. Klonale Deletion bedeutet, dass selbstreaktive Lympho- zyten schon während ihres Reifungsprozesses erkannt und über die Einleitung einer Apopto- sereaktion zerstört werden^{38 39}. Wenn frühzeitig durch geeignete Induktionsprotokolle Spen- derantigene im Thymus präsentiert werden, können diese schon bei der Lymphozyten- Reifung Klone, die gegen Spenderantigen gerichtet sind, mit Hilfe von klonaler Deletion ab- fangen. Die Injektion von unreifen, naiven dendritischen Zellen des Spenders konnte bei Ver-

suchstiermodellen mit Nagern eine Toleranz induzieren. Dieses Versuchskonzept konnte je- doch bisher nicht auf entsprechende Großtier- oder gar Patientenstudien übertragen werden⁴⁰.

1.4.2 Lympho-hämatopoetischer Chimärismus

Es werden mehrere Formen von Chimärismus unterteilt, zum einen der Mikrochimärismus und zum anderen der Makrochimärismus, der seinerseits in den vollständigen Chimärismus und den gemischten Chimärismus eingeordnet werden kann. Mikrochimärismus und gemisch- ter Chimärismus bedeuten, dass Spender und Empfängerzellen koexistieren. Den Mikrochi- märismus kann man wahrscheinlich nach jeglicher Form von Transplantation beobachten. Die Anzahl der Spenderzellen ist allerdings sehr gering und kann nur mit sehr sensitiven Untersu- chungsmethoden gemessen werden und seine immunologische Bedeutung ist vermutlich ge- ring⁴¹. Als vollständigen Chimärismus bezeichnet man die Ersetzung der Empfängerleukozy- ten durch Spenderleukozyten nach myeloablativer Konditionierung und nachfolgender allo- gener Knochenmarkübertragung⁴². Ein Phänomen, welches einen echten Chimärismus be- schreibt, ist 1945 erstmals von Owen an dizygoten Kälberzwillingen beobachtet worden. Über eine gemeinsame Plazenta wurden Blutzellen ausgetauscht und im Kreislauf des jeweiligen Zwillings nachgewiesen⁴³. Als gemischter Chimärismus wird die Koexistenz von Spender und Empfängerlymphozyten mit einem Anteil von Spenderlymphozyten von 5-95% bezeich- net. Gemischter Chimärismus entsteht nach Knochenmarktransplantation und vorangegange- ner non myeloablativer Konditionierung⁴⁴. Nach der Entdeckung des lymphohämatopoeti- schen Chimärismus in den 40er Jahren wurde die Theorie von Toleranzinduktion durch Chi- märismus bei der Knochenmarktransplantation entwickelt⁴⁵. Der Zusammenhang zwischen Toleranz und Chimärismus wird ganz ähnlich erklärt wie die natürliche Toleranz gegenüber Eigenantigenen. Über den Mechanismus der intrathymalen klonalen Deletion, bei der autore- aktive T-Zell-Klone schon im Reifungsprozess herausgefiltert und zerstört werden⁴⁶, werden Lymphozyten, die gegen Eigenantigene gerichtet sind, physisch zerstört. Eine hohe HLA- Kompatibilität zwischen Spender und Empfänger ist jedoch Voraussetzung, da ansonsten eine

„graft versus host“ Reaktion unweigerlich folgt^{47 48 49}. Die Bestrahlung mit nachfolgender Knochenmarkstransplantation ist eine der gebräuchlichsten Methoden einen gemischten Chi- märismus zu generieren und somit die immunologische Abwehr des Empfängers zu überwin- den⁵⁰. Ein interessantes Konzept zur Toleranzinduktion wurde 1989 von Sharabi und Sachs entwickelt⁵¹. Bei einem Tierversuch mit Mäusen wurden die peripheren T-Zellen zunächst mit Antikörpern gegen CD4⁺ und CD8⁺ depletiert. Darauf erfolgte eine Thymusbestrahlung mit 7 Gy und eine Ganzkörperbestrahlung mit 3 Gy. Anschließend verabreichte Knochenmarkszel-

len wurden von den Versuchstieren toleriert und ein Chimärismus von Spender und Empfän- gerzellen konnte nachgewiesen werden. Hauttransplantate vom gleichen Spender wurden dar- aufhin toleriert.

Solche Versuchsmodelle zur Transplantationstoleranz sind jedoch auf Grund der starken To- xizität der Induktionstherapie nicht auf den Menschen übertragbar⁵². Induktion von Trans- plantationstoleranz: Patienten mit einem Chimärismus können dennoch eine Abstoßung er- leiden, während bei Langzeitüberlebenden nach Transplantation nicht immer Chimärismus nachweisbar war⁵³. Allerdings darf der Nachweis von sog. „passenger leucozytes“ Zellen aus dem soliden Spenderorgan, die im Empfängerorganismus über eine längere Zeit persistieren, nicht mit dem Phänomen des Chimärismus gleichgesetzt werden⁵⁴.

1.4.3 Periphere Toleranz

Die Theorie, dass autoreaktive Lymphozyten durch klonale Deletion kontrolliert werden, kann nicht erklären, weshalb die Lymphozyten, die der klonalen Deletion entgangen sind, in der Peripherie keine autoreaktiven immunologischen Mechanismen auslösen. Daraus folgt, dass es auch in der Peripherie regulierende Vorgänge geben muss, die autoaggressive Immun- reaktionen unterdrücken können⁵⁵. Für die periphere Toleranz sind einerseits regulatorische T-Zellen und andererseits kostimulatorische Mechanismen verantwortlich.

1.4.3.1 Phänotypische Charakterisierung von regulatorischen T-Zellen

Zur genaueren Untersuchung von regulatorischen T-Zellen müssen Merkmalsunterschiede zwischen Zellen mit regulatorischer Funktion und anderen T-Zell-Populationen definiert wer- den. Es wurden verschiedene T-Zellpopulationen wie zum Beispiel CD8⁺, CD4^-8^-, CD8⁺28^- mit Suppressorfunktion identifiziert, aber ein spezifischer Marker für regulatorische T-Zellen wurde noch nicht entdeckt^{56 57}. In Studien erwies sich das Oberflächemolekül CD25, die α- Untereinheit des IL2 Rezeptors, als ein genauer Marker für regulatorische T-Zellen, welche die Aktivität von Effektorzellen supprimieren können⁵⁸. In Versuchen in Mäusen wurde ge- zeigt, dass CD4⁺CD25⁺ Zellen als regulatorische Zellen fungieren und eine spenderspezifi- sche Toleranz nach einer Transplantation unterhalten können⁵⁹. Auch im menschlichen Blut konnten solche Zellen mit regulatorischer Funktion nachgewiesen werden^{60 61 62}. Die Er- kenntnis, dass das Oberflächenmolekül CD25 regulatorische T-Zellen charakterisiert, wider- spricht scheinbar Erkenntnissen, laut derer CD25⁺ Zellen als aktivierte Effektorzellen an Ab- stoßungsvorgängen beteiligt sind. Diese Kontroverse erklärt sich dadurch, dass IL2 als Boten- stoff für verschiedene Lymphozytensubpopulationen dient und ruhende Lymphozyten in ei-

nen aktivierten Zustand versetzt. Folglich tragen ruhende regulatorische T-Zellen aber auch aktivierte Effektorzellen den IL2 Rezeptor. Im Gegensatz zu den aktivierten Effektorzellen exprimieren die regulatorischen T-Zellen CD25 konstitutiv und in größerem Ausmaß. Effek- torzellen weisen nur als aktivierte Zellen, also kurzfristig und in geringerem Ausmaß CD25 als Oberflächenantigen auf^{63 64 65}. Da CD25 auch ein Marker für aktivierte Lymphozyten ist, wurden gegen CD25 gerichtete Antikörper entwickelt, wie zum Beispiel Basiliximab und Daclizumab, die als Induktionstherapie bei solider Organtransplantation eingesetzt werden.

Basiliximab ist ein gemischter Antikörper mit 75% humanem Anteil und 25% murinem An- teil, während bei Daclizumab der humane Anteil 90% und der murine Anteil 10% beträgt.

Diese Antikörper werden auch klinisch zur Induktionstherapie eingesetzt. Bei gleichbleiben- den Nebenwirkungen konnte in immunsuppressiven Protokollen mit CD25-Antikörpern die Zahl akuter Abstoßungen signifikant verringert werden⁶⁶. Dies konnte auch an einer verglei- chenden Patientenstudie zur Induktionstherapie nach Lungentransplantation gezeigt werden⁶⁷. Allerdings konnte auch mit CD25 Antikörpern keine bleibende Toleranz ausgelöst werden.

Unklar und derzeit noch Gegenstand vieler Forschungsprojekte ist die genaue Wirkungsweise der CD25⁺ Zellen. In einer Studie an Mäusen, bei der die Toleranzinduktion nach Hauttrans- plantation untersucht wurde, konnte gezeigt werden, dass IL10 und CTLA-4 vermutlich für die regulatorische Funktion von CD25⁺ Zellen erforderlich sind⁶⁸. In einer Studie an humanen CD25⁺ Zellen wurde ebenfalls ein Zusammenhang zwischen regulatorischen T-Zellen und CTLA-4 und IL10 postuliert⁶⁹. CTLA-4 ist Teil der kostimulatorischen Mechanismen der T- Zell-Aktivierung, die neben der Aktivität von regulatorischen T-Zellen für die Entwicklung einer peripheren Toleranz verantwortlich sind.

1.4.3.2 Bedeutung kostimulatorischer Signale für die periphere Toleranz

Wie in dem Absatz akute Abstoßung schon erwähnt wurde, sind zwei Schritte zur erfolgrei- chen T-Zell-Aktivierung nötig. Neben der Interaktion zwischen dem CD3 Antigen der T-Zelle und dem T-Zell Rezeptor der antigen-präsentierenden Zelle, muss auch die Kostimulierung über andere Signaltransduktionswege erfolgen. Falls die Kostimulierung unterbleibt, wird nur eine IL2 und IL4-Rezeptorexpression, aber keine Zellproliferation und keine IL2 Produktion ausgelöst. Durch die unvollständige Aktivierung von T-Zellen kann eine Anergie oder die Apoptose dieser Lymphozyten hervorgerufen werden⁷⁰. Nicht alle kostimulatorischen Signale wurden bisher ermittelt. Bekannt ist die Interaktion zwischen CD154 und CD40, über die CD4^-, CD8^- Zellen, natürliche Killerzellen und eosinophile Granulozyten aktiviert werden können⁷¹. Ein weiterer kostimulatorischer Mechanismus ist die Anbindung des CD28 der T-

Zelle an das B7 Antigen der antigenpräsentierenden Zelle⁷². Es gibt verschiedene Methoden, die Kostimulierung der Lymphozyten zu unterbinden. Beispielsweise kann mit Hilfe von CTLA4 Ig⁷³, welches die kostimulatorische Aktivierung über die CD28-B7 Interaktion hemmt, eine Toleranzinduktion ermöglicht werden⁷⁴. Auch die Kombination einer Bestrah- lung und einer CTLA4 Ig Therapie mit einer auf Tacrolimus und Anti-Lymphozyten-Serum beruhenden Immunsuppression erwies sich in einer Studie als erfolgreich zur Ausbildung ei- nes stabilen Chimärismus, der zur Toleranzinduktion führen kann⁷⁵. In verschiedenen Studien konnte auch gezeigt werden, dass IL10, TGF, Prostaglandin E-2 und Kortikosteroide MHC-II herunterregulieren und IL-10 die Expression des kostimulatorischen Rezeptors CD86 reduzie- ren können. Man muss jedoch beachten, dass die unvollständige T-Zell-Aktivierung mit Hilfe von sehr starker IL2 Zufuhr durchbrochen werden kann. Durch die Hemmung kostimulatori- scher Signaltransduktionswege kann nur eine instabile Toleranz entstehen. Derzeit ist kein Antikörper gegen bestimmte kostimulatorische Antigene bekannt, der eine stabile Toleranzin- duktion auslösen kann.

1.5 Immunsuppressive Therapie

Die medikamentöse immunsuppressive Therapie in der Transplantationsmedizin gilt derzeit als unverzichtbar. Eine effektive Immunsuppression ist zur Vermeidung akuter und chroni- scher Abstoßungsreaktionen notwendig⁷⁶. Die Medikamente sollten einerseits besonders wirksam und andererseits möglichst verträglich und wenig toxisch sein. Deshalb ist die Etab- lierung neuer medikamentöser Behandlungsmethoden nach wie vor ein wichtiges For- schungsgebiet. Hinzu kommt, dass auch bei den noch erfolglosen Versuchen bleibende spen- derspezifische Toleranz bei den Organempfängern auszulösen die Bedeutung einer möglichst wirksamen Immunsuppression ersichtlich wird⁷⁷. Eine Reihe von publizierten Arbeiten haben in der Vergangenheit die Effizienz der immunsuppressiven Therapie mit Cyclosporin A mit der von Tacrolimus im Bereich der Leber- und Nierentransplantation untersucht, aber Lang- zeit- Vergleichsstudien dieser Medikamente im Bereich der Lungentransplantation sind selte- ner. Insbesondere untersuchte man in jenen klinischen Studien in der Regel solche mit Tacro- limus behandelten Patienten, die sekundär von Cyclosporin A auf Tacrolimus umgestellt wur- den⁷⁸. Die primäre oder Induktions- Therapie mit Tacrolimus ist hingegen in der Lungen- transplantation unüblich und die Erfahrungen damit sind entsprechend äußerst begrenzt⁷⁹. Dies steht in einem offensichtlichen Widerspruch zur großen Bedeutung, die der initialen immunsuppressiven Therapie aus immunologischer Sicht zukommt. Die erstmalige Konfron- tation naiver T-Zellen mit Spenderantigen, das Priming und die folgende Ausbildung einer

balancierten Immunantwort, die entweder eher vom regulierenden Typ ist (unter wünschens- wert idealen Voraussetzungen) oder die vom Effektortyp ist (und damit zur Abstoßung führt), finden alle unter dem Schutz der primären Immunsuppression statt. In Studien konnte gezeigt werden, dass insbesondere die erste Zeit nach einer Antigenexposition wichtig für die immun- regulatorischen Vorgänge ist^{80 81}. Die sekundäre Umstellung von Cyclosporin auf Tacrolimus wegen wiederholter akuter Abstoßungsreaktion kommt hingegen wohl zu spät, um noch Ein- fluss auf jene primären Vorgänge nehmen zu können.

Todesursache nach einer Herz-Lungen oder Lungen-Transplantation ist an der medizinischen Hochschule Hannover in nahezu 44% der Fälle eine Infektion; am zweithäufigsten ist mit 18% eine chronische Abstoßungsreaktion.

Abbildung 1: Todesursachen nach Lungen/Herz-Lungentransplantation in %

Todesursachen nach Lungen/Doppel-Lungen/Herz-Lungen - Transplantation an der Medizinischen Hochschule Hannover

Blutung 18 (6%) Pankreatitis 4 (1%)

Maligne Erkrankung/Tumor 19 (6%) Andere

Unbekannt Ursachen 37 (12%) akute Abstoßung 5 (2%)

chron. Abstoßung/ BOS 55 (18%) Infektion/Sepsis 133 (44%) Lungenembolie 8 (3%) Hirnschädigung 12 (4%)

Diese beiden Haupttodesursachen nach einer Lungentransplantation zeigen die Problematik in Bezug auf die postoperative Therapie von transplantierten Patienten. Einerseits ist eine aus- reichend starke Immunsuppression zur Verhinderung einer Abstoßung unbedingt erforderlich, aber andererseits darf das Abwehrsystem des Patienten nicht zu sehr geschwächt sein, da an- sonsten gefährliche Infektionen drohen. Aufgrund dessen gab es im Bereich der immun- suppressiven Therapie im Laufe der letzten Jahre zahlreiche und unterschiedlich erfolgreiche neue Therapieoptionen⁸². In den ersten drei Monaten nach der Transplantation werden die Immunsuppressiva zunächst sehr hoch dosiert, bis sie dann in der Erhaltungsphase in geringe- rer und verträglicherer Menge verabreicht werden können. An der medizinischen Hochschule

Hannover, aber auch an zahlreichen anderen Transplantationszentren werden die lungentrans- plantierten Patienten mit einer Dreifach-Therapie immunsuppressiv behandelt. Bei dieser wurden bis in die 90-er Jahre ein Kortikosteroid, ein Purinantagonist wie Azathioprin und ein Calcineurininhibitor kombiniert. Als Alternativmedikation zu Azathioprin kann auch der Pro- liferationshemmer Mycophenolat mofetil verabreicht werden. Zur Zeit werden in vielen Transplantationszentren auch OKT-3-Antikörper, Antithymozytenglobulin, Thymoglobulin und IL2-Rezeptor-Antagonisten als Induktionstherapie gegeben⁸³. In der Erhaltungstherapie und experimentell auch in der Induktionstherapie scheint der Einsatz des Proliferationshem- mers Rapamycin (Sirolimus) sehr Erfolg versprechend zu sein^{84 85}. Obgleich Rapamycin strukturell den Calcineurininhibitoren gleicht, unterscheidet es sich im Wirkungsmechanis- mus von diesen. Rapamycin hemmt eine Kinase („mammilian target of rapamycin“), die eine entscheidende Rolle in der Signaltransduktion hat, und interferiert auf diese Weise mit der Lymphozytenaktivierung⁸⁶. Die Kortikosteroide und Azathioprin gehören zu den unspezifi- schen Immunsuppressiva, während die genannten anderen Medikamente selektiver für die Transplantatabstoßung relevante Teile des Immunsystems hemmen.

Abbildung 2: Cyclosporin A

1.5.1 Cyclosporin A

Cyclosporin A (Abbildung 2) wird aus dem Pilz Tolypocladium inflatum isoliert und gehört zu der Medikamentengruppe der Calcineurininhibitoren. Cyclosporin A bildet mit dem En- zym Ciclophilin einen Komplex, der seinerseits die durch Calcium aktivierte Serin-Threonin- Phosphatase Calcineurin hemmt. Diese aktiviert durch Phosphorylierung Transkriptionsfakto- ren wie zum Beispiel NFAT oder NFkb. Die Hemmung der Calcineurin Phosphatphosphatase

unterbindet also die Aktivierung und Migration dieser Transkriptionsfaktoren in den Zellkern.

Auf diese Weise wird die Synthese von Zytokinen und ihren Rezeptoren verhindert. Insbe- sondere die Inhibition des IL2, welches entscheidend an der Stimulierung der Lymphozy- tenproliferation beteiligt ist, erklärt die immunsuppressive Potenz von Cyclosporin A⁸⁷. IL2 gehört zu den inflammatorischen Zytokinen, welches von TH1 Zellen gebildet wird und vor allem auf NK Zellen, T-und B-Zellen wirkt und zur Infiltration von Neutrophilen und Makrophagen im entzündeten Gewebe führt. Neben der T-Lymphozytenproliferation ist es teilweise auch für das B-Lymphozytenwachstum verantwortlich.

Cyclosporin besitzt eine gute Bioverfügbarkeit und wird über das Cytochrom P450 System der Leber zu mehreren Metaboliten umgesetzt. Da Cyclosporin ein so genanntes „critical do- se“ Medikament ist, also eine geringe therapeutische Breite hat, sollten seine Blutspiegelwerte genau überwacht werden. Es gibt zahlreiche Studien zu den schwerwiegenden Nebenwirkun- gen von Cyclosporin A. Bei entsprechender Prädisposition, zum Beispiel durch Vorerkran- kungen, können hepatotoxische, neurotoxische⁸⁸ und die schon frühzeitig erkannten nephrotoxischen⁸⁹⁹⁰ Probleme einer Cyclosporin-Therapie auftreten.

Allerdings ist Cyclosporin neben Tacrolimus generell ein sicheres und gut erforschtes Basismedikament bei der immunsuppressiven Therapie nach einer Lungentransplantation⁹¹.

Abbildung 3: Tacrolimus (FK506)

1.5.2 Tacrolimus (FK506)

Erfolgreiche Studien wurden zu dem neuen aus Streptomyces Tsukubaensis isolierten Calci- neurininhibitor Tacrolimus (Abbildung 3) veröffentlicht^{92 93}. Dieser gehört aufgrund seines

chemischen Aufbaues zur Gruppe der Makrolide. Während Cyclosporin A innerhalb der T- Zelle an Ciclophilin bindet, bildet Tacrolimus mit dem immunophilen „FK binding“-Protein einen Komplex. Die nachfolgenden Reaktionsmechanismen beider Medikamente ähneln ein- ander. Der entstandene Komplex hemmt die Aktivität des Calcineurin-Calmodulin- Komplexes, der, wie schon erwähnt, eine wichtige Rolle bei der Transkriptionskaskade für die Synthese von IL2 spielt⁹⁴. Neben der Hemmung der IL2 Produktion hat Tacrolimus im Gegensatz zu Cyclosporin A durch direkte Hemmung der TNFα Gentranskription auch noch einen direkt negativen Einfluss auf die B-Zell-Proliferation. Tacrolimus wird wie auch Cyc- losporin A in der Leber metabolisiert und dann biliär ausgeschieden⁹⁵. Die Nebenwirkungen von Tacrolimus scheinen trotz einiger Studien, die eine geringere Nephrotoxizität⁹⁶ von Tac- rolimus angeben, vergleichbar mit denen von Cyclosporin A zu sein⁹⁷. Die Nephrotoxizität von Calcineurininhibitoren ist dosisabhängig und bei einer niedrig dosierten Therapie mit Tacrolimus ist das Nebenwirkungsspektrum und insbesondere die Nephrotoxizität vergleich- bar mit der von Cyclosporin¹²⁹. Der entscheidende Vorteil von Tacrolimus gegenüber Cyc- losporin scheint in seiner wesentlich höheren immunsuppressiven Potenz zu liegen⁹⁸. Durch die Therapie sollen das Transplantatüberleben und auch die Infektionsgefährdung günstig beeinflusst werden^{99 100}. Eine schon beginnende Abstoßung lässt sich durch Tacrolimus bes- ser behandeln als mit Cyclosporin A¹⁰¹. Aufgrund dieser positiven Erfahrungen mit Tacroli- mus hat es den Anschein, dass auch eine primär auf Tacrolimus beruhende Therapie sehr Er- folg versprechend sein kann¹⁰².

Wirkmechanismen von Cyclosporin A und Tacrolimus

Abbildung 4: Anhand der folgenden Abbildung kann man den Wirkmechanismus von FK und Cyclosporin A erkennen. FK (violett) bindet an das FK-bindende Protein (rosa) und Cyc- losporin (rot) bildet mit Cyclophilin (orange) einen Komplex. Beide Pharmakon-Enzym- Bindungen inhibieren ihrerseits die Calcineurinphosphatphosphatase (hellgrün), die Transkriptionsfaktoren (dunkelgrün), welche an der IL2 Synthese beteiligt sind, durch Phosphorylierung aktiviert.

1.6 Versuchsmodelle 1.6.1 Versuchskonzepte

Im Folgenden soll versucht werden, auf der Grundlage von bisher erworbenen wissenschaftli- chen Erkenntnissen, den Aufbau eines geeigneten Versuchmodells zur Toleranzinduktion bzw. zum Vergleich immunsuppressiver Therapiekonzepte zu entwickeln. Eine Reihe von publizierten Arbeiten haben in der Vergangenheit die Effizienz der immunsuppressiven The- rapie mit Cyclosporin A mit der von Tacrolimus im Bereich der Leber- und Nierentransplan- tation untersucht, aber Langzeit-Vergleichsstudien dieser Medikamente im Bereich der Lun- gentransplantation sind seltener. Zahlreiche Versuchsmodelle zur Toleranzinduktion sind zeit- lich befristet angelegt^{103 104}. Auf diese Weise ist die Übertragbarkeit von Studienergebnissen

aus solchen Versuchen auf die klinische Situation nur begrenzt möglich. Wenn die Ver- suchstiere auf Grund einer zeitlichen Befristung der Versuche frühzeitig getötet werden, kön- nen spät auftretende Abstoßungsreaktionen nicht mehr erfasst werden. Es gibt finanzielle Gründe für die zeitliche Befristung solcher Versuchsvorhaben, aber auch die Wahl der Ver- suchstiere führt zu einer Verkürzung des Beobachtungszeitraums. Nagetiere haben beispiels- weise eine ohnehin kürzere Lebenserwartung und sind auch nicht so belastungsfähig in Bezug auf die notwendigen Verlaufsuntersuchungen.

In vielen klinischen Studien untersuchte man mit Tacrolimus behandelte Patienten, die sekun- där von Cyclosporin A auf Tacrolimus umgestellt wurden¹⁰⁵. Die primäre oder Induktions- Therapie mit Tacrolimus ist hingegen in der Lungentransplantation unüblich und die Erfah- rungen damit sind entsprechend äußerst begrenzt¹⁰⁶. Dies steht in einem offensichtlichen Wi- derspruch zur großen Bedeutung, die der initialen immunsuppressiven Therapie aus immuno- logischer Sicht zukommt. Die erstmalige Konfrontation naiver T-Zellen mit Spenderantigen, das Priming und die folgende Ausbildung einer balancierten Immunantwort, die entweder eher vom regulierenden Typ ist (unter wünschenswert idealen Voraussetzungen) oder die vom Effektortyp ist (und damit zur Abstoßung führt), finden alle unter dem Schutz der primären Immunsuppression statt. In Studien konnte gezeigt werden, dass insbesondere die erste Zeit nach einer Antigenexposition wichtig für die immunregulatorischen Vorgänge ist^{107 108}. Da also wie beschrieben die ersten Wochen nach der Transplantation entscheidend für das Trans- plantatüberleben sind, ist in dieser Zeit eine besonders effektive Immunsuppression notwen- dig. Unter der Annahme, dass Tacrolimus möglicherweise eine höhere immunsuppressive Potenz besitzt, ist die Umstellung auf Tacrolimus nach begonnener Abstoßung, also Wochen nach der Transplantation eventuell zu spät, um das vollständige Potential des Medikamentes auszuschöpfen.

In den meisten Transplantationszentren wird zurzeit nach der Lungentransplantation primär mit Cyclosporin A therapiert und nur bei Insuffizienz dieser Therapie ein Medikamenten- wechsel vorgenommen. In einigen Studien, die sich jedoch nicht speziell auf eine isolierte Tacrolimus-therapie beziehen, sondern andere Medikamente wie ATG oder CTLA4- Antikörper mit untersuchen¹⁰⁹, wird der Vorteil einer primär auf Tacrolimus beruhenden Im- munsuppression nach einer Lungentransplantation beschrieben. Im Zusammenhang mit der stärkeren immunsuppressiven Potenz von Tacrolimus stellt sich die Frage, ob auch das Trans- plantatüberleben signifikant verbessert und eine bleibende Toleranz erzeugt werden kann. In

einer Vergleichsstudie von Tacrolimus und Cyclosporin A von J.S. Allan konnte mit Hilfe einer hochdosierten Tacrolimustherapie eine wesentliche Verlängerung des Transplantatüber- lebens im Vergleich zu einer auf Cyclosporin A basierenden Therapie erreicht werden¹²⁹. In der genannten Studie wurden die Versuchstiere nur für 12 Tage medikamentös therapiert und mit einer sehr hohen Medikamentendosis behandelt.

Ursache kann möglicherweise die in vielen Versuchen wie beispielsweise bei einer Studie an Ratten beschriebene stärkere und langfristigere Supprimierung der Calcineurinphosphatase- aktivität durch Tacrolimus als durch Cyclosporin A sein¹¹⁰. In dem genannten Versuch wurde die Calcineurinaktivität im Blut der Ratten gemessen, aber eine Verbesserung des Transplan- tatüberlebens nach der Transplantation auf Grund einer primären Tacrolimustherapie wurde nicht untersucht.

Bei einem validen Toleranzinduktionsmodell erscheint die hoch dosierte immunsuppressive Dreifachtherapie in den ersten vier Wochen nach der Transplantation, wie in der Klinik üb- lich, besonders entscheidend, um dem Immunsystem Zeit für Adaptationsvorgänge zu geben.

In einigen experimentellen Toleranzinduktionsprotokollen wurde eine auf kurze Zeit begrenz- te Induktionstherapie vorgenommen¹¹¹ und, wenngleich die Cyclosporintherapie in jenen Stu- dien mit einer ganzen Reihe von weiteren Maßnahmen kombiniert worden war, konnte den- noch in einem Nierentransplantationsmodell in Makaken gezeigt werden, dass die vierwöchi- ge Cyclosporintherapie sowohl nötig als auch (in Verbindung mit den weiteren Protokollbe- standteilen) zur Induktion von Transplantationstoleranz ausreichend ist¹¹². Eine praktische Überlegung zugunsten einer vierwöchigen Immunsuppression in solchen Versuchsmodellen besteht in der Verhinderung der frühpostoperativen Transplantatabstoßung. Es konnte in un- terschiedlichen Tierversuchsprotokollen zur Lungentransplantation gezeigt werden, dass Ver- suchstiere, die nach der Transplantation keine Immunsuppression erhielten, gehäuft in den ersten 6-8 Tagen starben^{113 114}. Eine zeitlich begrenzte Immunsuppression ist bei der Entwick- lung eines Versuchskonzepts vorteilhaft, da sich hierdurch die Versuchszeit verringert. Unter fortgesetzter medikamentöser Immunsuppression tritt eine messbare chronische Abstoßungs- reaktion klinisch oft erst nach Jahren auf, und dann mit hoher interindividueller Unterschied- lichkeit¹¹⁵, sodass sich ein solches Modell experimentell nicht sinnvoll verwenden ließe. Zur Klärung der Fragestellung einer bleibenden (stabilen) Toleranz ist auch eine Versuchsphase ohne Immunsuppression erforderlich.

1.6.2 Versuchstiere

Forschungsvorhaben, die sich mit der Entwicklung von Toleranzinduktionsprotokollen oder mit der Ausarbeitung neuer immunsuppressiver Kombinationsmedikationen befassen, sind sehr experimentell und aus ethischen und medizinischen Gründen noch weit von der Umset- zung in der Klinik entfernt. Daher muss für eine Toleranzinduktionsstudie im Rahmen der Lungentransplantation ein valides und sicheres Tiermodell gewählt werden, welches ver- gleichbar mit der Lungentransplantation beim Menschen ist. Die in manchen Studien präfe- rierten Großtiermodelle an Hunden und Primaten sind einerseits aus Gründen des Tierschut- zes und andererseits auch wegen der Kosten nicht praktikabel. Kleintierversuchsmodelle zur Lungentransplantation sind gut etabliert, aber limitiert in ihrer immunologischen Aussagekraft und wegen der eingeschränkten diagnostischen Möglichkeiten für ein langfristig angelegtes Versuchskonzept nachteilig. Auch die bronchoalveoläre Lavage bzw. Bronchoskopie ist aus anatomischen Gründen nicht an Nagetieren möglich. Weniger kostenintensiv und unkompli- ziert in der tierschutzgerechten Haltung sind Schweine, deren Nutzung als Versuchstiere we- niger aufwendig ist als die von Primaten und Hunden. Außerdem gibt es große Zuchtlinien, die eine kostengünstige Auswahl von gleichaltrigen, gleichgewichtigen und genetisch ver- wandten Tieren ermöglicht. Des Weiteren sind Schweine auch auf Grund ihrer anatomischen und molekularbiologischen Verwandtschaft mit dem Menschen gut für Transplantationsver- suche geeignet. Besonders vorteilhaft im Rahmen eines solchen Forschungsziels scheint die Arbeit mit den kostenintensiveren Göttinger Minipigs anstatt mit dem gemeinen Haus- schwein: Sie stammen aus einer sehr gut definierten Zuchtlinie mit bekanntem genetischem Hintergrund, sind spezifisch pathogenfrei gehalten und haben, verglichen mit den größeren und schwereren Hausschweinen, einen geringeren Medikamentenbedarf und sind wesentlich einfacher zu handhaben.

Von entscheidender Bedeutung beim Einsatz von Immunsuppressiva ist die Metabolisierung der Medikamente. Diese kann bei verschiedenen Spezies erheblich variieren und die Über- tragbarkeit der Ergebnisse einer Tierversuchsstudie auf den Menschen beeinträchtigen. Das für die Metabolisierung von Calcineurininhibitoren verantwortliche Leberenzym Cytochrom P450 3A erwies sich in einer Studie an Minipigs als molekular dem menschlichen Cytochrom P450 3A sehr verwandt. Somit kann man zwar die Ergebnisse einer Studie an Minipigs auf den Menschen übertragen¹¹⁶, allerdings nur unter der Berücksichtigung der unterschiedlichen Pharmakodynamik und Kinetik im Minipig, wie noch später im Abschnitt „Medikamentöse Therapie“ diskutiert wird.

Obgleich die Bedeutung einer HLA-Inkompatibilität für die Entwicklung von Abstoßungs- reaktionen in vielen Studien belegt wurde, ist in der Klinik die entsprechende HLA- Abstimmung nicht üblich und faktisch ist die HLA-Übereinstimmung oder -Inkompatibilität zwischen Organspender und -empfänger völlig zufällig, da vor allem die Fallzahlen in der Lungentransplantation zu klein und die individuelle Dringlichkeit oft zu hoch sind um eine sinnvolle HLA-Abstimmung zu ermöglichen. Um also mit der klinischen Realität vergleich- bare Versuchsbedingungen zu schaffen, sollte in einer Toleranzinduktionsstudie bewusst eine HLA-Inkompatibilität generiert werden. Eine HLA inkompatible Versuchstierpaarung ist bei Minipigs gut möglich, da eine Reihe von HLA-Haplotypen der Minipigs identifiziert worden sind¹¹⁷. Unterstützend kann zusätzlich durch die gezielte Paarung von weiblichen Empfänger- tieren und männlichen Spendertieren ein „minor antigen mismatch“ erzeugt werden.

Ein weiterer Vorteil der Minipigs als Versuchstiere liegt in ihrer SPF-Haltung. Die SPF- Haltung der Minipigs trägt zur Standardisierung der Versuchsbedingungen bei, sodass nicht steuerbare Variabeln, wie zum Beispiel Infektionen mit unbekannten Erregern, verringert werden können. Ein Kritikpunkt an der SPF-Haltung könnte sein, dass menschliche Trans- plantatempfänger ein immunologisches Gedächtnis besitzen, da sie in ihrer Lebenszeit vor der Transplantation einer Vielzahl von Krankheitserregern ausgesetzt waren¹¹⁸.

1.6.3 Operation

Die Lungenentnahme bei den Versuchstieren sollte von der operativen Technik her im We- sentlichen wie die Lungenentnahme bei einem menschlichen Organspender erfolgen. Wäh- rend allerdings bei einem menschlichen Organspender der Hirntod bereits eingetreten ist, be- vor die Lunge entnommen wird, kann man in einem zeitlich planbaren Versuchsmodell den Versuchstieren die Lunge zum Zeitpunkt des klinischen Todes entnehmen. Auf diese Weise wird das Transplantatüberleben nicht durch ein mögliches Lungenödem infolge hormoneller Dysregulation negativ beeinflusst, wie es nach dem Hirntod des Spenders auftreten kann. Ein weiterer Vorteil zur Transplantation am Menschen ist, dass als Spenderorgane gesunde Lun- gen von jungen Spendern gewählt werden können. Die Spenderorgane in der Klinik können hingegen durch Kontusionsschäden, einen pulmonalen Hypertonus, durch Embolien bzw.

andere Organveränderungen oder durch ein höheres Spenderalter vorgeschädigt sein. Diese ideal gewählten Faktoren erlauben standardisierte Bedingungen, durch die der Einfluss der medikamentösen Immunsuppression erst überprüfbar wird. Um die Beeinträchtigung der Ver-

suchsergebnisse durch Störvariablen zu vermeiden sollte es Ziel sein alle nicht direkt den For- schungsgegenstand betreffende Faktoren zu standardisieren und somit zu relativieren.

Die antegrade Perfusion der Spenderlunge mit kalter Euro Collins-Lösung ist die in der Klinik übliche Konservierungstechnik und es gibt weltweit die größte Erfahrung mit dieser Konser- vierungstechnik. Die Perfusion mit Euro Collins-Lösung, die ursprünglich für den Bereich der Nierentransplantation entwickelt worden war, ist weltweit eine Standardtechnik. Darüber hin- aus gibt es zahlreiche jüngere Studien zur Verwendung neuartiger Perfusionslösungen¹¹⁹, wie zum Beispiel der Low Potassium Dextrane-Lösung, der University of Wisconsin-Lösung oder der Celsior-Lösung, die nicht zuletzt auf Grund einer anderen Elektrolytzusammensetzung speziell für die Lungentransplantation besser geeignet sind¹²⁰. In einer Studie an Minipigs wurde vergleichend der Reperfusionsschaden bei einer Perfusion mit Low Potassium Dextra- ne-Lösung und bei einer Perfusion mit Euro Collins-Lösung nach einer Lungentransplantation untersucht. In dieser Studie wurde nachgewiesen, dass Low Potassium Dextrane-Lösung die Surfactantfunktion geringer beeinträchtigt als Euro Collins-Lösung¹²¹. Auch zur retrograden Perfusion wurden einige Erfolg versprechende Versuche gemacht. Bei Transplantationsversu- chen anSchweinen wurde ein positiver Effekt auf die Transplantatfunktion nach der retrogra- den Perfusion festgestellt^{122 123}.

Eine große Komplikationsgefahr bei der Lungentransplantation ergibt sich aus dem direkten anatomischen Kontakt des Transplantates mit der Umwelt über die Atemluft und der dadurch bedingten Möglichkeit einer Kontaminierung mit möglichen Krankheitserregern. Kleintier- modelle, vor allem in Mäusen, basieren deshalb häufig auf einer nicht vaskularisierten hetero- tropen Tracheatransplantation, wobei der Kontakt zur Atemluft nicht erhalten ist ^{124 125}. Das Einzellungentransplantationsmodell in Schweinen hingegen repräsentiert ein vollwertiges Modell der klinischen Situation in allen anatomischen und immunologischen Belangen. Die bilaterale Lungentransplantation oder Einzellungentransplantation mit kontralateraler Pneu- mektomie, die in mehreren Großtiermodellen als günstig beschrieben werden, erscheinen auf Grund der hohen perioperativen Mortalität als ungeeignet¹²⁶.Daher erscheinen bei einem Ver- suchsmodell, in dem insbesondere die langfristigen immunologischen Veränderungen im Empfängerorganismus untersucht werden sollen, mit hoher perioperativer Mortalität behaftete Operationstechniken nachteilig. Vorteilhafter ist die unilaterale Lungentransplantation ohne kontralaterale Pneumektomie. Diese Operationstechnik ist mit weniger Komplikationen ver- bunden und ermöglicht eine verhältnismäßig schnelle Genesung der Versuchstiere, da die

kontralaterale Lunge eine ausreichende Oxygenierung des Blutes sichert. Des Weiteren er- möglicht die erhaltene rechte Lunge einen direkten Vergleich zwischen transplantiertem und nicht transplantiertem Organ und somit eine interne Kontrolle für röntgenologische, zytologi- sche und histologische Untersuchungen.

1.7 Ziel der Arbeit

In dieser Dissertationsschrift soll überprüft werden, ob eine vierwöchige Induktionstherapie mit Tacrolimus die gleiche immunsuppressive Potenz hat bzw. sogar eine höhere Wirksam- keit besitzt als die Induktionstherapie mit Cyclosporin. Zu diesem Thema gibt es Untersu- chungen aus dem Bereich der Nieren-¹²⁷ und der Lebertransplantation¹²⁸, aber anhand der hier beschriebenen Experimente soll der Nutzen einer Therapie mit Tacrolimus speziell für die Lungentransplantation untersucht werden. Im porcinen Einzellungentransplantationsmodell sollen die Ergebnisse zweier Therapiekonzepte einander gegenübergestellt werden. Die bisher bewährte Kombinationstherapie aus Steroid, Azathioprin und dem Calcineurininhibitor Cyc- losporin A wird mit einer Kombinationstherapie verglichen, in der Tacrolimus als Calcineuri- ninhibitor gewählt wird. Die genannten Medikamente sollen alle intravenös als Bolusgaben verabreicht werden. Des Weiteren soll überprüft werden, ob mit Hilfe einer Tacrolimus- Therapie in einem Lungentransplantationsmodell an Minipigs Toleranz induzierbar ist. Dieses Versuchskonzept ist ähnlich aufgebaut wie ein Toleranzinduktionsprotokoll von Allan¹²⁹, in dem mit einer hochdosierten Tacrolimus-Therapie in einem Lungentransplantationsmodell an Miniaturschweinen Toleranz induziert werden konnte.

2. Material und Methoden

2.1 Versuchstiere

Die im Folgenden beschriebenen Tierversuche wurden nach § 8a, Abs.1 des Tierschutzgeset- zes vom 25.05.1998 (BGBI.IS.1105) von der Bezirksregierung vom 14.07.1999 bis zum 13.07.2002 mit einer Verlängerung vom 11.03.2002 bis zum 10.03.2005 genehmigt. Bei den Versuchen wurden die Empfehlungen des National Institute of Health (USA) zum Umgang mit Versuchstieren berücksichtigt. (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH publication No.85-23, revised 1996)

Die Studie wurde an Göttinger Minipigs vorgenommen. Die Versuchstiere wurden von der Firma Ellegaard Minipigs Aps, Dalmose, aus Dänemark erworben. Diese spezielle Schweine- rasse entstammt einer Zucht der Universität Göttingen (Prof. Dr. P. Glodeck, Institut für Ge- netik und Tierzucht, Universität Göttingen), die bei den Tieren von Ellegaard den Genotyp der Tiere und die Auswahlkriterien für die Zucht im Abstand von zwei Monaten festgelegt und kontrolliert haben. Die Schweine wurden im Alter von 10-15 Monaten mit einem Ge- wicht von 20 bis 30kg geliefert. Mit Hilfe mikrobiologischer Untersuchungen wurden die Versuchstiere zuvor definiert und das Risiko von Infektionen wurde minimiert. Zur Erhaltung dieser spezifischen mikrobiologischen Inertheit werden die Minipigs unter sog. SPF (spezi- fisch pathogen frei) Barriere Bedingungen gehalten und nach den Empfehlungen der FELESA (Federation of European Laboratory Animal Science Assosiations) regelmäßig mikrobiolo- gisch untersucht. Die SPF-Haltung bedeutet, dass die Tiere in geeigneten Isolatorstallungen gehalten werden und die Keimeinschleusung von außerhalb durch Schutzmaßnahmen verhin- dert wird. Vor Versuchsbeginn wurde eine 14-tägige Quarantäne im zentralen Tierlaboratori- um der Medizinische Hochschule Hannover unter Leitung von Prof. Dr. med. vet. H. J.

Hedrich eingehalten. Routinemäßig wurde bei Ankunft der Tiere eine Kotprobe zur mikrobio- logischen Untersuchung entnommen. Die Tiere wurden abgesondert in Boxen (Raumabmes- sungen 160*90*150 cm) auf Spaltenböden aus V2A Stahl (N. V. Uno, Niederlande) gehalten.

Die Tageszeitregulierung wurde mit Hilfe einer 12-stündigen Beleuchtung von 6°°-18°° Uhr festgelegt. Außerdem wurde das Stallklima über eine Klimaanlage (15-20 Luftumwälzungen pro Stunde, Überdruck 50 Pa) bei 22°C und einer Luftfeuchtigkeit von 60-70% kontrolliert.

Das Betreten des Stalles war nur nach entsprechendem Kleiderwechsel und Anlegen von Mundschutz und Handschuhen gestattet. Es wurde an die Versuchstiere pelettiertes Schweine- futter (Raiffeisen HG Nord AG, Hannover) und einfaches Leitungswasser morgens und a-