Gewinnung und Aufarbeitung der Blutproben

Nach einem zuvor festgelegten Protokoll wurde in dem postoperativen Beobachtungszeitraum von 27 Tagen über den Vorhofkatheter Blut entnommen, um Differentialblutbilder, Blutgas-werte und Medikamentenspiegel zu bestimmen, sowie durchflusszytometrische Untersuchun-gen und Lymphozytenproliferationsassays vorzunehmen. Um VeränderunUntersuchun-gen der Blutpara-meter durch die Medikamente zu verhindern, wurde zuerst die Blutentnahme und erst dann die Medikamentengabe vorgenommen, des Weiteren wurde ein Schenkel des Katheters aus-schließlich für Injektionen, der andere Schenkel ausaus-schließlich für Blutentnahmen genutzt.

Mit einer 5ml Spritze (Einmalspritze Injekt Luer B.Braun Melsungen) wurde die im Schlauchsystem des Vorhofkatheters enthaltene Spüllösung (isotone Kochsalzlösung) aspi-riert und verworfen. Dann konnte das für die Durchflusszytometrie benötigte Vollblut mit Hilfe einer mit 1ml Heparin (Liquemin®) befüllten 20ml Spritze entnommen werden. Nach-folgend wurde in einer Blutgasmonovette (Pico 50™ Radiometer Copenhagen 1*2ml steril) Blut für die Blutgasanalyse entnommen. Unter Verwendung eines Adapters (Multi-Adapter Sarstedt Nürnbrecht) wurde zur Differentialblutbildbestimmung und für die Medikamenten-blutspiegelbestimmung Blut in eine EDTA Monovette (2,7ml Sarstedt Monovette®), zur Thrombozytenkontrolle Blut in eine Koagulations-Monovette (3ml Sarstedt Monovette®) und zur Bestimmung der Serumelektrolyte in zwei Serummonovetten (7,5ml Sarstedt Monovet-te®) Blut abgenommen. Nach Gabe der Medikamente wurde in beide Katheterlumen 10ml isotoner Kochsalzlösung injiziert. Zur Vermeidung von Thrombenbildung wurde abschlie-ßend 1ml mit Heparin versetzte Kochsalzlösung in die Katheterschenkel gespült. Nach 27

Tagen wurden alle Medikamente abgesetzt und der zentralen Venenkatheter explantiert. Dar-aufhin wurde nur noch bei den regelmäßigen in Kurznarkose vorgenommenen Röntgenunter-suchungen Blut entnommen. Zu diesem Zweck wurde linksseitig mittels einer Hohlnadel (100 Sterican® 1,10*50mm 196*2 B Braun Melsungen AG) und einem angeschlossenen Schlauchsystem mit Dreiwegehahn (1 Disofix®-3 B Braun) die Vena Jugularis externa punk-tiert.

2.11.2 Blutgasanalyse

Zur Kontrolle der Blutgasparameter wurden während der Spender- bzw. Empfänger-Operation und auch bei den Röntgenuntersuchungen mehrfach die Blutgasparameter be-stimmt. Des Weiteren wurde an den ersten 27 postoperativen Tagen jeden Morgen eine Blut-gasanalyse vorgenommen. Zu diesem Zweck wurde Blut in einer speziellen Blutgasmonovet-te aus dem zentralvenösen KatheBlutgasmonovet-ter des Versuchstieres entnommen und dann mit Hilfe eines Blutgasmessgerätes (AVL) analysiert. Nach Aufsetzen eines entsprechenden Adapters konnte die Monovette an den Einfüllstutzen angesetzt werden und das Blut musste nun langsam in den Automaten injiziert werden. Ein Blutgasanalysegerät ermittelte dann die venösen pO2 und pCO2 Werte, pH, BE, Na⁺, K⁺ und O2-Sättigung.

2.11.3 Blutuntersuchung

Eine Stunde vor und nach der Operation, sowie ein Tag postoperativ und dann in zweimal wöchentlichem Abstand wurde aus dem zentralvenösen Zugang der Versuchstiere Blut in Serum, EDTA und Gerinnungsmonovetten abgenommen. Aus diesen wurden dann Serum-harnstoff, -kreatinin und -protein, ein Differentialblutbild und die Gerinnungswerte bestimmt.

2.11.4 Isolierung von Blutlymphozyten

Lymphozyten und Monozyten/Makrophagen, die als Teil der spezifischen Immunabwehr maßgeblich an der Abstoßungsreaktion beteiligt sind, wurden für die weiteren Laboruntersu-chungen benötigt. Diese wurden zunächst aus dem restlichen Blut isoliert. Aus dem Vollblut, welches 3-mal wöchentlich in einer mit Heparin versetzten 20ml Spritze entnommen wurde, konnten diese gewonnen werden. Die folgenden Arbeiten wurden unter sterilen Bedingungen an eine laminar flow bench vorgenommen. Die 20ml Vollblut wurden mit PBS (PAA Labora-tories GMBH) auf 40ml verdünnt und auf 10ml Leukozytenseparationsmedium (Ficoll-Paque

Plus Amersham Biosciences) pippettiert, ohne dass sich Ficoll und Blut vermischten. Dar-aufhin wurde bei 2000 Umdrehungen pro Minute und 20°C für 20min ohne Bremsung

zentri-fugiert. Nach dem Zentrifugieren haben sich die Lymphozyten in der Mitte angesammelt, unmittelbar über dem Ficoll, unter welchem sich die Erythrozyten im Pellet befinden und un-terhalb vom Serum, welches die oberste Schicht bildet. Der Effekt beruht auf der Ausbildung eines Dichtegradienten, denn die spezifische Dichte von Ficoll ist größer als die von Serum oder Lymphozyten/Monozyten, aber kleiner als die spezifische Dichte von Erythrozyten. Die Lymphozyten wurden mit einer Glaspipette ohne Mitnahme von Erythrozyten oder Ficoll abpipettiert und erneut mit PBS auf 25ml verdünnt. Die Lymphozytensuspension wurde dann bei 1600 Umdrehungen und 4° C für 4 min zentrifugiert. Hierdurch hat sich am Boden des Falconröhrchens ein Zellpellet mit den Lymphozyten gebildet. Der Überstand wurde dekan-tiert und die Zellen wurden mit 2ml PBS verdünnt. Zehn µl dieser Zellsuspension wurden mit 990µl auf 10% verdünnter isotoner Trypanlösung (Trypan Blue 0,5% Biochrom AG) ange-färbt und anschließend wurden in einer Neubauer Zählkammer die vitalen Leukozyten ausge-zählt.

2.11.5 Einfrieren von Zellen

Aus einer Vollblutprobe von 20ml konnten in der Regel ungefähr 10-20 Mio. Zellen gewon-nen werden. Diese Zellanzahl war sehr variabel und insbesondere kurz nach den operativen Eingriffen und unter Immunsuppression konnten weitaus weniger Zellen isoliert wer-den.1*10- wurden in RPMI 1640 mit 10% FCS resuspendiert und nach Zugabe von 10%

DMSO bei –80° C eingefroren. Die Zellen wurden als Stimulatorzellen für die MLR und zur Wiederholung von Durchflusszytometrie-Untersuchungen gelagert.

2.11.6 Zellaufbereitung aus lymphatischem Gewebe

Für die MLR bzw. die durchflusszytometrische Untersuchung mussten die Lymphozyten auch aus Gewebe (Milz, Thymus) isoliert werden. Hierzu wurde Gewebe mechanisch zerkleinert und zusammen mit einem Enzymgemisch für 45min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Diese Enzyme mussten zuvor aktiviert werden, indem 8µg DNAse (Desoxyribunuklease Sigma) mit 20µg Kollagenase (Collagenase Sigma) in 10ml PBS gelöst und für 10min im Wasserbad bei 37°C erwärmt wurden. Nach den 45min wurde das Gewebe durch einen 100µm Filter von der Flüssigkeit, in der sich nun die Lymphozyten befanden, getrennt. Um auch die restlichen Lymphozyten aus dem Gewebe zu isolieren, wurde es nochmals mit 20ml PBS versetzt, ge-vortext und dann erneut gefiltert.

Die auf diese Weise entstandene Zellsuspension wurde bei 2000 Umdrehungen und 20°C für 5min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Zellpellet mit 35ml PBS

re-suspendiert und nun wie bei der Lymphozytenisolierung aus Vollblut (s.o.) auf Ficoll-Paque geschichtet und zentrifugiert (2000U/min/20°C). Nun konnte die Zellschicht abpipettiert und mit RPMI 1640 (GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA) versetzt bei 4°C gelagert bzw. bei -80°C eingefroren werden.

2.11.7 Färbung der Lymphozyten für die Durchflusszytometrie

Die isolierten Lymphozyten mussten nun für die durchflusszytometrische Messung angefärbt werden. Die Färbung erfolgte als Doppelfärbung mit jeweils zwei Primärantikörpern und zwei isotypspezifischen, fluorochromgekoppelten Sekundärantikörpern. Insgesamt wurden 12 ver-schiedene Antikörperkombinationen gefärbt.

Abbildung 6: Durchflusszytometrieprotokoll

RohrPrimär Ak Trivial Isotyp SekundärAk Primär Ak Trivial Isotyp SekundAk

1 neg IgG 2a GoatF(ab)PE neg IgG2b FITC-IgG2b

2 23-8E6-8C8 pCD3e GoatF(ab)PE 74-22-15a pMpG mIgG2b FITC-IgG2b

3 neg IgG2b GoatF(ab)PE neg IgG2a FITC IgG2a

4 7-34-1 SLA1 mIgG2a GoatF(ab)PE neg IgG2b FITC-IgG2b

5 neg IgG2b GoatF(ab)PE neg IgM FITCIgM

6 76-2-11 CD8 mIgG2a GoatF(ab)PE 74-12-4 CD4 mIgG2b FITC-IgG2b

7 CD25 GoatF(ab)PE 74-12-4 CD4 mIgG2b FITC-IgG2b

8 76-7-4 pCD1 mIgG2a GoatF(ab)PE 74-12-4 CD4 mIgG2b FITC-IgG2b 9 74-11-10 SLA1d.an mIgG2b GoatF(ab)PE 76-2-11 CD8 migG2a FITC IgG2a 10 74-11-10 SLA1d.an mIgG2b GoatF(ab)PE 23-8E6-8C8 pCD3e FITC IgG2a 11 74-11-10 SLA1d.an mIgG2b GoatF(ab)PE 76-6-7 pTpM mIgM FITCIgM 12 74-11-10 SLA1d.an mIgG2b GoatF(ab)PE 7-34-1 SLA1 mIgG2a FITC IgG2a

Als Negativkontrolle wurden isotypspezifische Antikörper gegen irrelevante Antigene ver-wendet, Maus IgG-2a, Maus IgG-2b und Maus IgM (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).

Als Primärantikörper wurden die folgenden Klone verwendet: CD3a BB23-8 E6IgG-1 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) CD25 PGBL25A IgG-1 (VMRD, Pullman, WA, USA) sowie die aus Hybridomaüberständen stammenden Antikörper CD4 74-12-4 Balb/c IgG-2bK, CD8 76-2-11 Balb/c IgG-2aK und SLA class 1 7-34-1 mIgG-2a, pMpG 74-22-15a mIgG-2b, SLA class 1 74-11-10 mIgG-2b (ATCC, Manassas, VA, USA). Der erste Sekundärantikörper war Phycoerithin (PE), konjugiert mit Ziege-anti-mouse IgG-1, und der zweite Sekundäranti-körper war Fluorescent isothiocyanat (FITC), gekoppelt mit rat-anti-mouse IgG-2a, 2b oder IgM. Das Absorptionsmaximum des jeweils ersten PE gekoppelten Sekundärantikörpers be-findet sich bei 580nm, während das Absorptionsmaximum des zweiten mit dem Farbstoff FITC gekoppelten Sekundärantikörpers bei 488nm liegt. Bei der durchflusszytometrischen

Messung können mit Hilfe der unterschiedlichen Absorptionsmaxima die für bestimmte Anti-körper positiven Lymphozyten voneinander differenziert werden. Im Verlaufe des im Folgen-den beschriebenen Färbeprozesses wurFolgen-den die Zellen auf Eis gekühlt. Auch die Antikörper, mit denen gearbeitet wurde, wurden gekühlt und nach Möglichkeit im Dunkeln verarbeitet, da sie ansonsten schnell unbrauchbar geworden wären. Für die Färbung wurden in der Regel 5 Mio. Zellen verwendet. Diese wurden mit PBS und 150µl porcinem Serum (Biochrom AG) auf 1200µl verdünnt und in 100µl Portionen auf 12 Facsröhrchen (Polisterene Round Bottom Tube/Becton Dickinson) verteilt, sodass sich in jedem Röhrchen ca. 0,42 Mio. Zellen in 100µl PBS befanden. Das porcine Serum wurde hinzugegeben, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Dann wurden die Primärantikörper im Überschuss nach Protokoll zu den Zellen gegeben und 30min im Dunkeln inkubiert. Nach dieser Färbezeit erfolgte der Waschvorgang, bei welchem Antikörper, die nicht an Zellen gebunden worden waren, entfernt wurden. Zu diesem Zweck wurde in jedes Facsröhrchen 1ml PBS gegeben und die Zellen wurden an-schließend bei 4°C und 1600 Umdrehungen pro Minute für 4min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Zellen konnten nun resuspendiert und mit dem ersten PE-gekoppelten Sekundärantikörper inkubiert werden. Wie bei dem ersten Färbeschritt beschrie-ben wurde, wurden auch die anderen Antikörper jeweils unter den gleichen Bedingungen hin-zugegeben, für 30min inkubiert und dann gewaschen, zentrifugiert und dekantiert. Nach dem letzten Waschschritt wurden noch einmal 250µl PBS auf die Zellen gegeben und die durch-flusszytometrische Messung konnte vorgenommen werden.

2.11.8 Durchflusszytometrie

Es wurde mit einem Durchflusszytometer mit 2 Lasern (Facs-Calibur-Gerät; BD, San Jose, CA, USA) gearbeitet. Unmittelbar bevor die Zellsuspension in das Gerät zur Messung einge-bracht wurde, wurden noch 10µl Propidiumjodid hinzugefügt, um hiermit avitale Zellen zu markieren. Propidiumjodid ist ein DNA-Farbstoff, der über Defekte in der Zellmembran in avitale Zellen eindringen kann. Mit Überdruck wird die Zellsuspension über ein Schlauchsys-tem in das Gerät eingesogen. Eine isotone Kochsalzlösung höheren Druckes umspült den Pro-bestrahl. Wenn die Zellsuspension in die Messküvette gelangt, wird sie beschleunigt und die Zellen reihen sich hintereinander (hydrodynamische Fokussierung). Ein monochromatischer Lichtstrahl wird auf die Zellen gelenkt und über einen Spiegel und ein Filtersystem wird die Lichtstreuung zu Photoverstärkerröhren geleitet. Die nach vorne gerichtete Lichtstreuung (FCS forward scatter) spiegelt die Zellgröße wieder und die seitliche Streuung (SSC sight-ward scatter) gibt Hinweise auf die Zellgranulierung. Die entsprechende Graphik wird auf

einem angeschlossenen Computer in einem Cell Quest (BD) Programm dargestellt, die im WinMDI 2.8 Programm ausgewertet werden kann.

Die soeben erklärte Streulichtmessung gibt einen Überblick, welche Zelltypen vorliegen. Von links nach rechts im FCS/SSC Diagramm stellen sich Erythrozyten, Lymphozyten und Mono-zyten dar. In dieser Darstellung werden zunächst die LymphoMono-zyten markiert, sodass in den anderen Diagrammen nur die Lymphozyten gezeigt werden. In einem anderen Diagramm, in dem Propidiumjodid auf der y-Achse gegen FSC dargestellt wird, können die avitalen Zellen durch die Anfärbung ihrer DNA mit Propidiumjodid von den lebenden Zellen unterschieden und aus der Auswertung herausgenommen werden. Außerdem wird in einem dritten Dia-gramm die Fluoreszenz der mit PE (bei 488nm) und FITC (530nm) angefärbten Zellen ge-zeigt. Dies gibt dann Aufschluss, in welchem Maße Zellen mit den Antikörpern, die im Fär-beprotokoll erwähnt wurden, markiert worden sind. Nach Anlegen eines Quadranten können nun die Lymphozytenunterpopulationen quantifiziert werden¹³⁰.

Abbildung 7: Die folgende Abbildung zeigt beispielhaft die Auswertung von durchflusszyto-metrischen Protokollen. Innerhalb des Diagramms FCS/SSC links oben, wurden zunächst die Lymphozyten als R1 markiert. Im Diagramm FCS/PI rechts hiervon wurden die vitalen Zellen markiert. Beide markierten Zellgruppen wurden nun in dem unteren Diagramm hier beispiel-haft in einer CD4/CD8 Färbung dargestellt. In diesem Diagramm konnte nun ein Quadrant angelegt und die Zellpopulation mit Hilfe des Programms ausgerechnet werden.