Medizinische Hochschule Hannover
Klinik für Zahnärztliche Prothetik und Biomedizinische Werkstoffkunde
Eine systematische Analyse der Zytokompatibilität innovativer
Implantatmaterialien
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
- Doctor rerum naturalium - (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Jörn Schaeske
geboren in Hamburg
Hannover 2019
Angenommen durch den Senat: 02.09.2020
Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns
Wissenschaftliche Betreuung: Prof.‘in Dr. med. dent. Meike Stiesch Wissenschaftliche Zweitbetreuung: Prof.‘in Dr. rer. nat. Andrea Hoffmann 1. Referent/in: Prof.‘in Dr. med. dent. Meike Stiesch
2. Referent/in: Prof.‘in Dr. rer. nat. Andrea Hoffmann 3. Referent/in: Prof.‘in Dr. med. Cornelia Blume
Tag der mündlichen Prüfung: 02.09.2020 Prüfungsausschuss
Vorsitz: Prof.‘in Dr. rer. nat. Andrea Hoffmann 1. Prüfer/in: Prof.‘in Dr. med. dent. Meike Stiesch 2. Prüfer/in: Prof.‘in Dr. rer. nat. Andrea Hoffmann 3. Prüfer/in: Prof.‘in Dr. med. Cornelia Blume
Ich widme diese Arbeit meiner Familie.
Abbildungsverzeichnis ... I Tabellenverzeichnis ... III Abkürzungsverzeichnis ... IV Zusammenfassung ... VII Abstract ... X
1. Einleitung ... 1
1.1. Dentale Implantate und periimplantäre Gewebe ... 1
1.1.1. Orale Mukosa ... 3
1.1.2. Alveolarknochen ... 5
1.1.3. Orale Biofilme ... 6
1.2. Antibakterielle Implantat-Oberflächen... 7
1.2.1. Bakterizide Oberflächen ... 7
1.2.2. Antiadhäsive Oberflächen ... 9
1.2.3. Antibakterielle Aktivität vs. Gewebeintegration ... 10
1.3. Biokompatibilität von Implantat-Oberflächen ... 11
1.3.1. Oberflächen-Modifikationen ... 12
1.3.2. Analyse der Biokompatibilität ... 17
1.4. Zielsetzung ... 22
2. Material und Methoden ... 23
2.1. Material ... 23
2.1.1. Chemikalien und Reagenzien ... 23
2.1.2. Medien für die Zellkultur und Bakterienkultur ... 24
2.1.3. Antikörper ... 25
2.1.4. Kits ... 25
2.1.5. Verbrauchsmaterialien ... 26
2.1.6. Geräte ... 27
2.1.7. Software ... 29
2.1.8. Bakterienstämme ... 29
2.1.9. Zellkulturen ... 30
2.2. Methoden ... 31
2.2.2. Materialherstellung und -Analysen ... 31
2.2.2.3. Slippery, Liquid-Infused Porous Surfaces (SLIPS) ... 35
2.2.2.4. Laser-generierte Spike-Strukturen ... 35
2.2.3. Bakterien-Analysen ... 39
2.2.4. Zellkultur ... 41
2.2.5. Inkubation von HGFib mit Nanopartikeln ... 43
2.2.6. Besiedlung von MOF-beschichteten Titanplättchen mit HGFib ... 43
2.2.7. Inkubation von HGFib mit SLIPS-Lubrikanten ... 45
2.2.8. Besiedlung von SLIPS ... 45
2.2.9. Besiedlung von Spike-Strukturen ... 46
2.2.10. Osteogene Stimulation ... 50
2.2.11. Zell-Analysen ... 51
2.2.12. Fluoreszenz-Färbungen und -Mikroskopie ... 55
2.2.13. Raster-Elektronen-Mikroskopie ... 57
2.2.14. ImageJ-Analysen ... 57
2.2.15. Statistik ... 59
3. Ergebnisse ... 60
3.1. Nanopartikel für die Implantat-Beschichtung ... 61
3.1.1. Metal-organic Frameworks ... 61
3.1.2. Nanoporöse Silica-Nanopartikel ... 65
3.2. Slippery, Liquid Infused Porous Surfaces ... 71
3.3. Spike-Strukturierungen ... 74
3.3.1. Gradienten - Adhäsion und Proliferation ... 74
3.3.2. Homogene Strukturen - Adhäsion und Proliferation ... 80
3.3.3. Homogene Strukturen - Migration ... 95
4. Diskussion ... 106
4.1. Zytokompatibilität von Nanopartikeln für die Implantat-Beschichtung ... 106
4.2. Beladung von Nanopartikeln und Definition eines therapeutischen Konzentration-Bereiches ... 110
4.3. Ein Stimulus-Response-System für eine „intelligente“ Wirkstoff-Freisetzung ... 114
4.4. Antiadhäsive Implantat-Oberflächen ... 116
4.5. Kontrolle des Zell-Verhaltens durch Spike-Topographien ... 119
4.5.1. Adhäsion und Proliferation auf Spike-Gradienten ... 120
4.5.4. Zusammenfassung der Spike-Topographien ... 137
4.6. Ableitung eines In-vitro-Analysepfades ... 138
5. Schlussfolgerung und Ausblick ... 143
Literaturverzeichnis ... 145
Danksagung ... 160
Curriculum Vitae ... 162
Hinweis auf bereits publizierte Daten ... 163
Publikationen ... 164
Erklärung zur Selbstständigkeit ... 165
Einverständniserklärung zur Plagiatsprüfung ... 166
I
Abb. 1.1: Schematischer Querschnitt durch das parodontale Gewebe mit dem Zahn
und durch das periimplantäre Gewebe mit dem Implantat 4 Abb. 1.2: Laserstrukturierte Topographien in Titan 14 Abb. 1.3: Interaktion von Knochengewebe und Osteoblasten mit einer
Implantatoberfläche 15
Abb. 1.4: Die Gruppierung von Integrinen bestimmt das Zellverhalten 16
Abb. 2.1: Versuchsaufbau für die Laser-Strukturierung 36
Abb. 2.2: Siliziumoberflächen nach der Bearbeitung mit verschiedener Laserpulsenergie 38 Abb. 2.3: Abmessungen und Aufbau der angefertigten Rahmen 48 Abb. 2.4: Schematische Durchführung der Migrationsexperimente 49 Abb. 2.5: Probendesign und Quantifizierung für die Migrationsexperimente 49 Abb. 2.6: Intrazelluläre Reduktion von MTT zu Formazan 51 Abb. 2.7: Intrazelluläre Reduktion von Resazurin zu Resorufin 52
Abb. 3.1: Zytokompatibilität von MOF-NP 63
Abb. 3.2: Zytokompatibilität von MOF-Beschichtungen (qualitativ) 64 Abb. 3.3: Zytokompatibilität von MOF-Beschichtungen (quantitativ) 65 Abb. 3.4: Zytokompatibilität von funktionalisierten Silica-NP 68 Abb. 3.5: Antibakterielle Aktivität von funktionalisierten Silica-NP 69 Abb. 3.6: CHX-Freisetzung und Zytokompatibilität von PVP-funktionalisierten
Silica-NP 71
Abb. 3.7: Zytokompatibilität von SLIPS-Lubrikanten und SLIPS-Oberflächen,
Biofilmvolumen auf SLIPS-Oberflächen 73
Abb. 3.8: Aufbau und Topographie der verwendeten Spike-Proben 75 Abb. 3.9: Zelluläre Adhäsion und Proliferation sowie bakterielle Adhäsion auf
Spike-Gradienten 79
Abb. 3.10: Morphologie von HGFib nach 24 h Kultur auf homogenen
Spike-Strukturen 82
II Abb. 3.12: Morphologie von NHOst nach 24 h Kultur auf homogenen
Spike-Strukturen 84
Abb. 3.13: Morphologie von MC3T3-E1 nach 24 h Kultur auf homogenen
Spike-Strukturen 85
Abb. 3.14: Morphologie von HGFib nach 72 h Kultur auf homogenen
Spike-Strukturen 86
Abb. 3.15: Morphologie von NIH/3T3 nach 72 h Kultur auf homogenen
Spike-Strukturen 87
Abb. 3.16: Morphologie von NHOst nach 72 h Kultur auf homogenen
Spike-Strukturen 88
Abb. 3.17: Morphologie von MC3T3-E1 nach 72 h Kultur auf homogenen
Spike-Strukturen 89
Abb. 3.18: Parameter der Adhäsion und Proliferation auf homogenen
Spike-Strukturen (Einfluss der Spike-Größe) 91
Abb. 3.19: Parameter der Adhäsion und Proliferation auf homogenen
Spike-Strukturen (Vergleich der Zelltypen) 94
Abb. 3.20: Proliferation auf homogenen Spike-Strukturen 95 Abb. 3.21: Zellmigration auf homogenen Spike-Strukturen nach 3 Tagen 97 Abb. 3.22: Zellmigration auf homogenen Spike-Strukturen nach 7 Tagen 98 Abb. 3.23: Zellmigration auf homogenen Spike-Strukturen nach 10 Tagen 99 Abb. 3.24: Zellmigration auf homogenen Spike-Strukturen nach 14 Tagen 100
Abb. 3.25: Migration auf homogenen Spike-Strukturen 102
Abb. 3.26: Morphologie von Fibroblasten nach 14 Tagen Migration auf homogenen
Spike-Strukturen 104
Abb. 3.27: Morphologie von Osteoblasten nach 14 Tagen Migration auf homogenen
Spike-Strukturen 105
Abb. 4.1: Effekt von Nanotopographien auf die Bildung von Fokalen Adhäsionen 127
Abb. 4.2: Nanotopographie von Spike-Strukturen 128
Abb. 4.3: Gegenseitige Regulation von Stressfasern und Fokalen Adhäsionen 129
III Abb. 4.5: In-vitro-Analysepfad für die Testung von Festkörpern für die
Implantatentwicklung 142
Tabellenverzeichnis
Tab. 2.1: Parameter des verwendeten Lasersystems „Femtopower Compact Pro“ 36 Tab. 3.1: Anzahl der Publikationen mit der Kombination unterschiedlicher Zelllinien und
Begriffen der Implantat- bzw.Materialforschung 76 Tab. 4.1: Therapeutische Bereiche funktionalisierter Silica-NP 114
IV AFM Rasterkraftmikroskop
Ag Silber
AK Anitkörper
ATP Adenosintriphosphat
BfArM Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte BMP bone morphogenetic protein
BSA Bovines Serumalbumin Ca2+ Calcium-Kation
Calein-AM Calcein-Acetoxymethylester CaP Calciumphosphat
CHX Chlorhexidin
CHX-Gl Chlorhexidin-Digluconat
CLSM Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie CTB CellTiter-Blue®
DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol DLS Dynamische Lichtstreuung
DMEM Dulbecco’s modified Eagle Medium DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EtOH Ethanol
EZM Extrazelluläre Matrix FAK focal adhesion kinase FAs Fokale Adhäsionen FCS Fötales Kälberserum
FDA Food and Drug Administration FGF fibroblast growth factor
fum Fumarat
V HGFib humane Gingivafibroblasten
IgG Immunglobulin
ISO International Organisation for Standardisation LDH Laktatdehydrogenase
MOF Metal-organic framework MPG Medizinproduktgesetz MSCs mesenchymale Stammzellen
MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromid) NADH Nicotinamidadenindinukleotid
NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat NHOst Normale humane Osteoblasten
NIFE Niedersächsisches Zentrum für Biomedizintechnik, Implantatforschung und Entwicklung
NP Nanopartikel
NPSNP Nanoporöse Silica-Nanopartikel PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PEG Polyethylenglycol
PFA Paraformaldehyd
pFAK phosphorylated focal adhesion kinase PI Propidiumiodid
PO43- Phosphat-Anion
RANKL Receptor Activator of of nuclear factor kappa-B ligand REM Rasterelektronenmikroskop
RGD Tripeptid aus Arginin, Glycin und Asparaginsäure RNA Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur
S. aureus Staphylococcus aureus S. mutans Streptococcus mutans SF Stressfasern
VI ROS Reaktive Sauerstoffspezies
Ti Titan
TiO2 Titandioxid
TRITC Tetramethylrhodamin
Zr Zirkonium
ZrO2 Zirkoniumdioxid
VII Eine systematische Analyse der Zytokompatibilität innovativer Implantatmaterialien (Jörn Schaeske)
In der Implantatforschung werden viele antibakterielle Materialien mit unterschiedlichen Strategien entwickelt, um das Risiko Implantat-assoziierter Infektionen zu verringern. Ohne eine gute Biokompatibilität werden diese Materialien jedoch nicht zur klinischen Anwendung kommen. Daher müssen sie neben ihrer antibakteriellen Aktivität auch auf ihre Biokompatibilität geprüft werden. Auf Grund ethischer Standards sowie der hohen Kosten von In-vivo-Untersuchungen müssen die meisten Implantatmaterialien als erstes in vitro getestet werden. Obwohl die Analyse der Zytokombatibilität wichtig für die Identifikation geeigneter Materialien ist, bestehen vor allem für nicht transparente, solide Festkörper, wie sie in der Implantatentwicklung verwendet werden, bisher kaum etablierte Methoden. In dieser Arbeit wurden innovative Nanopartikel für die Implantatbeschichtung, antiadhäsive Oberflächen und Laser-strukturierte Topographien aus dem Forschungsverbund BIOFABRICATION for NIFE zusammen mit Kooperationspartnern entwickelt und auf ihre Zytokompatibilität untersucht.
Die unterschiedlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften des Probenmaterials setzten die Anpassung bestehender und die Entwicklung neuer Methoden voraus. Ein Fokus lag hierbei auf der Untersuchung Laser-strukturierter Mikrotopographien. Anhand der Untersuchungen sollte ein Screening-System für die In-vitro-Testung erarbeitet werden, um die zukünftige Entwicklung biokompatibler Implantatmaterialien zu beschleunigen.
Die Analyse von Nanopartikeln für die Implantatbeschichtung konnte durch die Herstellung homogener Dispersionen weitgehend wie die Untersuchung von Lösungen bzw. Extrakten in unterschiedlichen Konzentrationen durchgeführt werden. Im Rahmen dieser Analysen konnte die Zytokompatibilität neuartiger Metal-organic-framework-Nanopartikel und modifizierter Silica-Nanopartikel nachgewiesen werden. Durch die parallele Testung der Zytokompatibilität und der antibakteriellen Aktivität von Chlorhexidin-beladenen Silica-Nanopartikeln konnte ein therapeutischer Konzentrationsbereich definiert werden. Im Gegensatz zu den Nanopartikeln handelte es sich bei antiadhäsiven slippery liquid-infused porous surfaces (SLIPS) um nicht transparente Oberflächen, auf denen die Interaktion mit gewebespezifischen Zellen (Fibroblasten und Osteoblasten) von Interesse war. Im Rahmen der SLIPS-Analysen mussten eine neue Test-Methode für Öle entwickelt und die Definition der Biokompatibilität erweitert werden. Implantate, welche nicht in das umliegende Gewebe integrieren sollen, sind demnach
VIII orthopädischer Implantat hingegen ist die Adhäsion der Gewebezellen essentiell. Im Rahmen der Untersuchung der Laser-strukturierten Spike-Topographien konnten entsprechende Methoden für die Analyse der Interaktion von adhärenten Zellen mit Implantat-Oberflächen entwickelt werden. Auf diesen Strukturen wurde die Zellreaktion von primären und immortalisierten Fibroblasten und Osteoblasten auf unterschiedlichen Spike-Größen analysiert.
Eine Abhängigkeit von der Spike-Größe war bei allen Zelltypen zu beobachten. Die Zellen zeigten eine bessere Adhäsion, Proliferation und Migration auf den kleinen Spikes als auf den mittleren und großen Spikes. Fibroblasten verhielten sich auf den Spike-Strukturen besser als Osteoblasten, weshalb die Topographien eher für die Weichgewebseinheilung als für die Osseointegration geeignet sind. Immortalisierte Fibroblasten und Osteoblasten zeigten deutlich abweichende Reaktionen im Vergleich zu den entsprechenden primären Zellen und sind daher schlecht für die Analyse von Oberflächentopographien geeignet. Während der Spike-Analysen erwiesen sich die Fluoreszenzmikroskopie und konfokale Mikroskopie als vorteilhaft gegenüber der Rasterelektronenmikroskopie, da keine Trocknungsartefakte auftraten, unterschiedliche Zellbestandteile analysiert und quantifiziert und zusätzlich die Interaktion der Zellen mit der Oberfläche visualisiert werden konnte. Da auch die Migration von Zellen auf Implantat-Oberflächen wichtig für die Gewebeintegration ist, wurde ein entsprechender Test entwickelt. Dieser Test nutzt zum ersten Mal das „Zell-Exklusions-Design“ auf nicht transparenten Oberflächen. Im Gegensatz zu bisherigen Tests kann hier die Migration über einen langen Zeitraum (mindestens 14 Tage) ohne Inkubationskammer oder spezielle Software beobachtet werden. Aus den verwendeten Methoden und den erhaltenen Ergebnissen wurde ein In-vitro-Analysepfad erarbeitet, welcher durch seinen hierarchischen Aufbau zytokompatible Materialien unterschiedlicher Beschaffenheit früh selektiert und nur diese tiefergehend untersucht. Im Prä-Screening werden die Materialien zunächst auf ihre grundsätzliche Verträglichkeit getestet, im Fein-Screening werden selektierte Oberfläche tiefergehend auf ihre Zytokompatibilität getestet und im Komplexen Screening werden 3D-Modelle, Kokulturen und dynamische Systeme für eine in vivo nahe Testung verwendet.
In der vorliegenden Arbeit wurden neue innovative und zytokompatible Implantatmaterialien identifiziert, mit welchen zukünftig Implantatsysteme optimiert werden können. Die Entwicklung neuer und die Anpassung etablierter Methoden, vor allem in Bezug auf die Analyse von nicht transparenten Oberflächen, und die Erstellung eines neuen Screening-
IX Biokompatibilität effektiver gestaltet werden und letztendlich die Zahl der Materialien erhöht werden, die in die klinische Translation gelangen.
X A systematic analysis of the cytocompatibility of innovative implant materials
(Jörn Schaeske)
Different strategies are employed in order to develop antibacterial materials for medical implants with the ultimate objective to decrease the risk of implant-associated infections.
However, these implant materials will not reach the clinical application without a proper biocompatibility. Thus, the investigation of their biological safety is essential. Due to ethical reasons and high costs, most of the novel implant materials have to be tested in vitro prior to animal or clinical studies. Despite the importance of the cytocompatibility analysis for the identification of suited materials, there are almost no established methods for non-transparent and solid test specimens, as they are used in implant development. In this thesis, innovative materials produced during the joined research within BIOFABRICATION for NIFE were analyzed in terms of their cytocompatibility. It was necessary to adjust existing and to develop new methods in order to fulfill the requirements of the test specimens that possessed different chemical and physical properties. Thereby, the investigation of laser structured microtopographies was of special interest. On the basis of these investigations, the aim was to develop an in vitro screening system to accelerate the development of biocompatible implant materials.
The analysis of homogenously dispersed nanoparticles as implant coatings was performed according to guidelines for solutions or extracts in different concentrations. In the context of these investigations, it was shown that the innovative metal-organic framework nanoparticles and the modified silica nanoparticles were cytocompatible. For the chlorhexidine loaded silica nanoparticles, a therapeutic concentration range was identified by the simultaneous investigation of the cytocompatibility and antibacterial activity. In contrast to the nanoparticles, for the non-transparent antiadhesive slippery liquid-infused porous surfaces (SLIPS), the interaction of tissue cells (fibroblasts and osteoblasts) with the surface was of interest. During the analysis of the SLIPS, a new test method for oils had to be developed. Also, a new definition of biocompatibility was established. Implants, which are not intended to be integrated in the surrounding tissue, can be stated as biocompatible, if no or very little cells adhere on the surface and no toxic substances leach into the medium. In contrast, for the integration of dental or orthopedic implants, the adhesion of the tissue cells is essential. During the investigation of the laser structured spike topographies, methods for the analysis of the interaction of adherent cells
XI dependency on the spike size was apparent for all cell types. The adherence, proliferation and migration of the cells were better on the small spikes than on the middle and large sized spikes.
Fibroblasts performed better than osteoblasts. This was suggestive for better soft tissue integration than osseointegration. Immortalized cells behaved quite different to these variable topographies than their respective primary cells, highlighting that immortalized cells are unsuitable for the analysis of surface topographies. From imaging methodologies, fluorescence and confocal microscopy were superior over scanning electron microscopy for the analysis of the cells and the underlying surfaces, because any damage by the drying procedure was avoided.
In addition, fluorescence and confocal microscopy allowed the possibility to analyze and quantify different cell components and to visualize cell-surface-interactions. Due to the importance of cell migration on implant surfaces, a corresponding assay was developed. Here, the “cell exclusion design” was used for the first time on non-transparent surfaces. In contrast to existing assays, the cellular migration on implant surfaces was observed over a long time period (at least 14 days) without the use of an incubation chamber or special software. Based upon established methods and critical findings, a hierarchical in vitro screening system with the aim to select cytocompatible materials for deeper analysis at early stages was developed. During a pre-screening the basic cytocompatibility of materials is investigated, during the fine screening the cytocompatibility of selected surfaces is investigated in depth and during the complex screening 3D models, cocultures and dynamic systems are used to create test conditions close to the in vivo situation.
Within this thesis, new innovative and cytocompatible implant materials were identified, which can optimize implant systems in future. Due to the development and adaption of methods, especially for the analysis of non-transparent surfaces, as well as the development of a new screening system, the in vitro testing of implant materials will be accelerated and optimized.
The higher quality of in vitro data will improve the efficiency of subsequent biocompatibility studies as well as promote the number of materials reaching clinical translation.
1
1. Einleitung
Medizinische Implantate können geschädigte oder verlorengegangene Gewebe und Organe ersetzen. Das Ziel ist dabei die Wiederherstellung der Organ- und Gewebefunktion und die Verbesserung der Lebensqualität des Patienten [1], [1*]. Durch den demographischen Wandel besteht ein immer größerer Bedarf an Implantaten. Vor allem bei älteren Patienten kann es jedoch zu Infektionen und mangelhafter Einheilung kommen. Dies liegt unter anderem an einem eingeschränkten Immunstatus, einer geringeren Regenerationsfähigkeit und einer schlechteren Knochenqualität [2, 3]. Der Erfolg und die Lebensdauer von dentalen und orthopädischen Implantaten hängen von einer guten Integration in das umliegende Gewebe ab [4, 5]. Ist diese nicht gegeben, können erhebliche Komplikationen bis hin zum Verlust des Implantats die Folge sein. Bereits bei der Implantation können Infektionen und Gewebeschäden auftreten, welche die Einheilung erschweren. Ebenso kann eine zu frühe Belastung oder die Bildung einer Bindegewebskapsel zum Implantatverlust führen. Späte Komplikationen bilden bei Dentalimplantaten vor allem die bakterienbedingte Periimplantitis und bei orthopädischen Implantaten die aseptische entzündliche Implantatlockerung. Hierbei kommt es zu Entzündungsreaktionen, welche zum Abbau des anliegenden Knochengewebes führen [3, 5-7].
Bei einem Implantatverlust werden eine Revisionsoperation und die Insertion eines neuen Implantats notwendig. Dies stellt eine große Belastung für den Patienten dar und ist mit Risiken sowie hohen Kosten für das Gesundheitssystem verbunden [5]. Um diese Situation zu verbessern, gilt es Implantate so zu modifizieren, dass sie neben antibakteriellen Eigenschaften auch eine adäquate Biokompatibilität aufweisen und damit eine gute Einheilung ermöglichen.
1.1. Dentale Implantate und periimplantäre Gewebe
Innerhalb der unterschiedlichen Implantatarten hat vor allem die Zahl der inserierten Zahnimplantate in den letzten Jahrzenten stark zugenommen [8]. Trotz einer guten Erfolgsquote treten auch hier regelmäßig unvollständige Einheilungen und Infektionen auf, welche zu einer starken Beeinträchtigung oder sogar zum Verlust des Implantats führen können [9]. Für die Herstellung von Dentalimplantaten haben sich vor allem Zirkoniumdioxid (ZrO2) und Titan auf Grund ihrer hervorragenden Eigenschaften durchgesetzt. ZrO2 hat insbesondere in den letzten
2 Jahren in der zahnärztlichen Prothetik an Bedeutung gewonnen. Neben seinen sehr guten mechanischen und ästhetischen Eigenschaften ist es gegenüber Titan jedoch anfälliger für Frakturen und Oberflächendefekte [10, 11]. Nach wie vor bestehen die meisten Zahnimplantate aus Reintitan Grad 4 oder der Titanlegierung Ti-6Al-4V. Diese Materialien weisen eine mechanische Stabilität und Elastizität auf, welche der des Kieferknochens (Alveolarknochens) am nächsten kommen. Zusätzlich bildet sich auf ihnen eine wenige Nanometer dicke Titandioxid(TiO2)-Schicht, welche für eine hohe Korrosionsresistenz und eine gute Biokompatibilität sorgt [10, 12]. Damit ein Zahnimplantat voll funktionsfähig ist, muss es in das anliegende Gewebe integriert werden. Die unterschiedlichen Implantatbestandteile stehen dabei mit verschiedenen Geweben und den entsprechenden Zellen in Kontakt. Die Implantatschraube entspricht in ihrer Funktion der Zahnwurzel und verankert die Zahnprothese im Kieferknochen. Sobald Osteoblasten die Zwischenräume mit Knochenmatrix gefüllt haben und eine feste Verbindung mit dem Knochen besteht, spricht man von der Osseointegration des Implantats. Den Weichgewebedurchtritt bildet entweder das Implantat selbst (einteiliges Implantat) oder ein aufsitzendes Abutment (mehrteiliges Implantat) [13]. Dieser Teil soll das Anwachsen von Bindegewebe und Epithelium gewährleisten, so dass die ursprüngliche und Barrierefunktion wiederhergestellt wird. Den sichtbaren Teil des Implantats bildet die Krone, welche vor allem ästhetische Ansprüche erfüllen sowie der Belastung durch Kauen und Mundflora standhalten muss [7, 9]. Die Bakterien der Mundflora bergen zudem die ständige Gefahr einer periimplantären Entzündung. Um dieses Risiko zu minimieren, sind antibakterielle Eigenschaften der Materialien erstrebenswert [14]. Implantat-Oberflächen sollen daher die Adhäsion, Proliferation und Migration von Gewebezellen gewährleisten bzw.
fördern und die Anlagerung von Bakterien verringern. Um entsprechende Oberflächen herstellen zu können, ist die Kenntnis der Anatomie, Physiologie und Zellen des periimplantären Gewebes sowie der Zusammensetzung und des Verhaltens oraler Biofilme notwendig. Bei einem Dentalimplantat bestehen darüber hinaus wichtige Unterschiede im Vergleich zum Zahn. Ein Vergleich der periimplantären mit der parodontalen Situation zeigt auf, welche besonderen Anforderungen bei der Entwicklung innovativer Implantatmaterialien berücksichtigt werden müssen.
3
1.1.1. Orale Mukosa
Die orale Mukosa bzw. Mundschleimhaut besteht aus einem mehrschichtigen Plattenepithel, welches die Barrierefunktion übernimmt, und dem Bindegewebe, welches die Versorgungsfunktion übernimmt. Nach der Implantation bzw. dem Einbringen des Abutments muss das Implantat in das Weichgewebe einheilen. Durch die Blutung bildet sich zunächst ein Fibrin-Agglomerat, auf welchem sich dann Proteine der extrazellulären Matrix (EZM) wie Fibronectin und Kollagen ablagern können. Diese Proteine dienen als Liganden für die transmembranen Integrin-Rezeptoren der Zellen und sind Voraussetzung für deren Adhäsion, Proliferation und Migration [12, 15, 16]. Das Anwachsen des Epithels ist nötig, um die Barrierefunktion wiederherzustellen. Bei der oralen Mukosa ist diese Funktion besonders wichtig, da eine hohe Bakterienbelastung in der Mundhöhle vorherrscht [7]. Ein häufiges Problem ist die Migration der Epithelzellen entlang der Implantatoberfläche, wodurch ein tieferer periimplantärer Sulcus entsteht und Bakterien leichter in das Gewebe eindringen können (Abb. 1.1) [15, 17]. Eine gute Adhäsion und Proliferation von Gingivafibroblasten (von
„Gingiva“ = die dem Zahn anliegende Mukosa) kann dieser Epithelmigration vorbeugen, weshalb Implantat-Oberflächen eine gute Kompatibilität gegenüber diesen Zellen haben sollten [7, 17]. Die Fibroblasten synthetisieren die extrazelluläre Matrix (EZM) des Bindegewebes, welche für die Geweberegeneration und die Integration des Implantats entscheidend ist. Hierfür sekretieren die Zellen Glycoproteine, Proteoglycane und vor allem Kollagen. Im Rahmen des Gewebeumbaus sind die Fibroblasten auch in der Lage EZM-Proteine mit Hilfe von Matrix- Metalloproteinasen (MMPs), anderen degradierenden Enzymen und durch die Aufnahme in Phagolysosomen abzubauen [18]. Durch die mangelnde EZM zu Beginn der Einheilung sowie die Sekretion proinflammatorischer Zytokine durch die Gewebeschädigung infolge der Implantatinsertion differenzieren Fibroblasten zu Myofibroblasten, welche besonders viel EZM-Proteine – vor allem Kollagen 1 – und wenig MMPs sekretieren [19-21]. Wie in Abbildung 1.1 zu sehen ist, besitzt das resultierende Narbengewebe parallel zum Implantat verlaufende Kollagenfasern und hat daher eine schwächere Verbindung sowie eine geringere Belastbarkeit im Vergleich zur horizontalen Verankerung der Fasern beim Zahn. Zusätzlich hat Narbengewebe durch eine geringe Zahl an Fibroblasten und eine geringere Vaskularisierung eine schlechtere Regenerations- und Versorgungskapazität [9, 17, 22]. Obwohl das Narbengewebe in der Regel nur ca. 50 µm bis 100 µm des an das Implantat angrenzenden Gewebes ausmacht, führt die schlechtere Verbindung zum Implantat zu einer verminderten
4 Barrierefunktion und einer tieferen Einbuchtung der Mukosa [23]. Hier sind Oberflächen gewünscht, welche bei den Zellen keine bzw. nur geringe proinflammatorische Reaktionen auslösen und so die Bildung von Narbengewebe einschränken. Ein weiterer entscheidender Unterschied zwischen der parodontalen und der periimplantären Situation ist das fehlende parodontale Ligament (Abb. 1.1). Dies hat ebenfalls eine geringere Vaskularisierung sowie eine geringere Zahl von Stammzellen zur Folge, wodurch die Regenerationsfähigkeit und die Leukozytenverfügbarkeit im Gewebe verringert sind. Infektionen in diesem Bereich können im Vergleich zur parodontalen Situation daher schwerer vom Immunsystem erreicht werden [7].
Durch den Gewebeverlust ist das Implantat im Gegensatz zum Zahn direkt im Knochen verankert (Abb. 1.1).
Abb. 1.1.: Schematischer Querschnitt durch das parodontale Gewebe mit dem Zahn und durch das periimplantäre Gewebe mit dem Implantat. Die gemeinsamen Bestandteile und Gewebe-spezifischen Zellen sind in der Mitte dargestellt, die Unterschiede jeweils am Rand.
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1.1.2. Alveolarknochen
Wie in anderen Knochengeweben besteht auch im Alveolarknochen im physiologischen Zustand ein Gleichgewicht aus Knochenaufbau durch Osteoblasten und Knochenabbau durch Osteoklasten [24]. Osteoblasten bilden das Knochenmaterial, in dem sie zunächst die Matrixproteine sekretieren und im zweiten Schritt die Mineralisierung, also die Einlagerung von Ca2+ und PO43-, katalysieren. Das resultierende Knochengewebe besteht durchschnittlich aus ca. 70 % anorganischer und ca. 30 % organischer EZM. Der organische Teil wiederum besteht zu 90 % aus Kollagen sowie aus einer Vielzahl anderer Proteoglykane und Glycoproteine wie Osteocalcin, alkalischer Phosphatase und Fibronectin. Eine Stimulation der Osteogenese bzw. Osteoblastendifferenzierung kann biochemisch durch Wachstumsfaktoren und physikalisch durch eine geeignete Topographie bzw. durch mechanische Faktoren wie Zugkraft oder Scherkräfte erfolgen [25-27]. Unmittelbar nach der Implantation sind Schäden in der Knochensubstanz sowie Lücken zwischen Implantat und Knochen zu verzeichnen.
Beschädigte Knochenmatrix wird von Osteoklasten resorbiert und die Lücken werden durch die Migration von Osteoblasten und Vorläuferzellen zum und auf dem Implantat sowie durch die Proliferation und Osteogenese der Zellen aufgefüllt [3]. Je besser eine Oberfläche dieses Zellverhalten stimuliert, desto schneller wird die Osseointegration des Implantats vollzogen werden. Ein gut gesetztes Implantat in einem vitalen Alveolarknochen ist nach erfolgreicher Osseointegration äußerst stabil. Die Kraftübertragung vom Implantat auf den Knochen sorgt für die Aufrechterhaltung der Knochenintegrität. Jedoch hat das fehlende parodontale Ligament eine geringere Flexibilität und eine ungünstigere Kraftübertragung im Vergleich zum Zahn zur Folge, so dass es vermehrt zu Druckbelastungen kommt [13, 28]. Weiterhin kann es durch eine stark geneigte Insertionsachse oder eine Beeinträchtigung der Knochensubstanz zu Fehl- oder Überbelastungen kommen, wodurch Frakturen und Nekrose des Gewebes auftreten können.
Diese Belastungen können auch zur Ausschüttung von Osteoklasten-stimulierenden Zytokinen wie RANKL durch Osteozyten (von Knochenmatrix eingeschlossene Zellen mit regulativen Eigenschaften) führen. Die Folge kann ein periimplantärer Knochenabbau und die Lockerung des Implantats sein [29-31]. Auch um diesen Nachteilen gegenüber der natürlichen Situation entgegenzuwirken, sind Implantat-Oberflächen gefragt, welche stimulierend auf Osteoblasten wirken und so die Einheilung in den Knochen fördern. Überbelastung und Knochenabbau können darüber hinaus zur Bildung von Bindegewebe zwischen Implantat und Knochen führen.
Wird das Implantat zu einem großen Teil von Bindegewebe umgeben ist der Kontakt zum
6 Knochengewebe zu gering und es kann zu Mikrobewegungen, Entzündungsherden, weiterem Knochenabbau und zum Verlust des Implantats kommen [12]. Hier sind Oberflächen gewünscht, welche selektiv die Adhäsion, Proliferation, Migration und Differenzierung von Osteoblasten und Vorläuferzellen fördern, nicht aber von Fibroblasten.
Eine gute und schnelle Gewebeintegration des Implantats kann auch durch die Bildung bakterieller Biofilme erschwert bzw. verhindert werden. Besonders im oralen Milieu herrscht eine ständige und hohe Bakterienbelastung.
1.1.3. Orale Biofilme
Die menschliche Mundflora ist ein dynamisches Ökosystem, welches aus bis zu 700 unterschiedlichen Bakterienspezies bestehen kann [32]. In Wechselwirkung mit dem Wirt und in Abhängigkeit des Nährstoffangebots ist sie einem ständigen Wandel unterzogen. In der gesunden Mundhöhle leben die Bakterien in einer symbiotischen Gemeinschaft mit dem Wirt.
In diesem Zustand sind kommensale Bakterien wie Streptococcus mitis und Granulitella adiacens häufiger als pathogene Bakterien wie Streptococcus mutans und Porphyromonas gingivalis. Auf den Oberflächen der Mundhöhle, wie Zunge, Zahnfleisch, Zahn sowie auf den Oberflächen von Implantaten können sich die planktonischen Bakterien anlagern und einen Biofilm bilden. Ein Biofilm stellt eine besondere Form der bakteriellen Lebensgemeinschaft dar, in welcher die Zellen an einem Substrat und aneinander adhärieren, in eine selbstproduzierte Polymermatrix eingebettet sind und einen anderen Phänotyp hinsichtlich Stoffwechselrate und Genexpression aufweisen als in ihrer planktonischen Form. Dadurch besitzen sie eine deutlich erhöhte Widerstandskraft gegenüber schädlichen Umwelteinflüssen, Komponenten des Immunsystems und Antibiotika [7, 33]. Kommt es nun zu einer Störung der bakteriellen Gemeinschaft innerhalb des Biofilms, kann sich die Symbiose zu einer Dysbiose umwandeln, bei der pathogene Spezies dominieren [34]. Solch ein pathogener Biofilm auf Implantaten kann Mukositis und Periimplantitis verursachen. Die Mukositis beschreibt dabei eine oberflächliche und reversible Entzündung des periimplantären Gewebes, die Periimplantits ist eine chronische Entzündung, welche tiefer in das Gewebe reicht und mit einem Abbau des Alveolarknochens verbunden ist [7, 35]. Mit einer Prävalenz von 43 % für Mukositis und 26 % für Periimplantitis nach ≥ 5 Jahre nach der Implantation sind diese Erkrankungen in der zahnärztlichen Prothetik von großer Bedeutung [36, 37]. Durch die verminderte Barriere- und
7 Versorgungsfunktion sowie den tieferen periimplantären Sulcus können Bakterien einfacher und tiefer in das Gewebe eindringen als dies in der parodontalen Situation der Fall ist. Die resultierenden Entzündungen fallen daher stärker aus [7, 38]. Im Vergleich zum Zahn gibt es im Implantat auch Innenbereiche, welche als Bakterienreservoir dienen können. So können sich an den Verbindungsstellen von Implantatschraube und Abutment ebenfalls Biofilme bilden und zu Entzündungen des periimplantären Gewebes führen [39]. Um die Gefahr dieser Implantat- assoziierten Infektionen zu verringern, werden antibakterielle Oberflächen entwickelt, welche die Biofilmbildung inhibieren sollen.
1.2. Antibakterielle Implantat-Oberflächen
Zahlreiche Oberflächenmodifikationen wurden bereits untersucht, um die bakterielle Adhäsion, Proliferation und damit verbundene Biofilmbildung zu verhindern bzw. zu hemmen. Dabei stehen unterschiedliche Mechanismen wie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die mechanische Abtötung, die Störung der bakteriellen Membran durch Biomoleküle, die Einlagerung von antimikrobiellen Substanzen und die Inhibierung der Adhäsion durch Beschichtungen oder spezielle Topographien zur Verfügung [14, 40]. Auch im Rahmen des Forschungsverbundes BIOFABRICATION for NIFE, in welchem diese Dissertation entstand, wurden in den Modulen „Materialentwicklung“, „Laser-basierte Oberflächenfunktionalisierungen“ und „Implantatassoziierte Infektionen“ antibakterielle Oberflächen entwickelt und auf ihre Wirkung untersucht. Generell kann zwischen bakteriziden und antiadhäsiven Oberflächen unterschieden werden.
1.2.1. Bakterizide Oberflächen
Bakterizide Oberflächen töten adhärente Bakterien ab und können so die Biofilmbildung inhibieren. Hierfür können unterschiedliche Substanzen oder Materialien mit unterschiedlichen Wirkmechanismen genutzt werden. Die Denaturierung von bakteriellen Proteinen durch Ag+- Ionen ist der Hauptmechanismus der antibakteriellen Wirkung von Silber [41]. Kupfer und Zink katalysieren die Bildung von ROS wie H2O2 oder O2- und schädigen so die Bakterienmembran durch Lipidoxidation [39]. Auch die UVA-Bestrahlung von photokatalytischen TiO2- Beschichtungen führt zur Produktion von ROS [42]. Metalle und ihre Oxide können z.B. durch
8 anodische Oxidation oder in Nanopartikelform (NP) auf Titan aufgebracht werden [14].
Organische Funktionalisierungen haben ebenfalls oft eine Störung der bakteriellen Membranintegrität zum Ziel. Dies gelingt beispielsweise mit antibakteriellen Peptiden oder kationische Makromolekülen [43, 44]. Eine mechanische Abtötung von Bakterien gelingt durch die Imitation der Nanotopographie von Libellenflügel in Silicium (black silicon) [45].
Eine weitere Strategie, um Implantatinfektionen und die damit verbundene Biofilmbildung zu verhindern, ist das Beladen der Implantatoberfläche mit antimikrobiellen Substanzen. Um die verfügbare Oberfläche und das Volumen für diesen Zweck zu erhöhen, kann die Oberfläche aufgeraut, Poren eingebracht oder mit porösen Materialien beschichtet werden. Für letzteres können beispielsweise poröse NP verwendet werden, welche sich durch ihre große Oberfläche und ihr großes Porenvolumen besonders für diese Anwendung eignen [46-48]. Eine in der Biomedizin neue Materialart für die Produktion solcher NP sind Metal-organic Frameworks (MOFs). Hierbei handelt es sich um kristalline, poröse Materialien, welche aus anorganischen Metallionen oder Metall-Oxo-Clustern und organischen Linkern bestehen [49, 50]. Durch die Kombination unterschiedlicher anorganischer und organischer Anteile kann eine Vielzahl unterschiedlicher Materialien mit gewünschter Partikelgröße, Morphologie, Porengröße und Oberflächenbeschaffenheit hergestellt werden. Zusätzlich können die Oberflächen funktionalisiert werden [51, 52]. Nanoporöses Silica kann ebenfalls für die Produktion von NP verwendet werden. Auf Grund seiner hervorragenden physikalischen Eigenschaften und der guten Biokompatibilität fand es in der Biomedizin bereits vielfach Anwendung [46, 53, 54].
Nanoporöse Silica-NP können in ihrer Größe und Form variiert sowie mit chemischen Gruppen funktionalisiert werden [55].
Implantat-Oberflächen wurden bereits mit Antibiotika wie Amoxicillin, Vancomycin, Gentamicin, Tetracylin, Minocyclin und Cephalotin beladen. Bei beladenen Oberflächen tritt allerdings oft ein „Burst-Release-Effekt“ auf, bei dem ein Großteil des Wirkstoffs kurz nach der Implantation freigesetzt wird. Anschließend folgt eine längere Freisetzung der antimikrobiellen Substanz unterhalb der minimal inhibitorischen Konzentration. Dies kann zur Generierung resistenter Bakterienstämme führen [14]. Um dieses Problem zu umgehen, können antimikrobielle Substanzen mit geringer Resistenzbildung wie Chlorhexidin (CHX) oder
„Stimulus-Response-Systeme“ verwendet werden, welche nur bei Bedarf Wirkstoff abgeben [56, 57].
9
1.2.2. Antiadhäsive Oberflächen
Im Gegensatz zu bakteriziden Oberflächen töten antiadhäsive Oberfläche Bakterien nicht ab, sondern sie verhindern bzw. verringern deren Adhäsion. Eine Resistenzentwicklung auf Grund der Abgabe antibakterieller Substanzen ist daher ausgeschlossen. Auf antiadhäsiven Oberflächen lagern sich kaum Proteine oder Polysaccharide ab, welche für die Bakterienadhäsion nötig wären [58]. Planktonische oder wenige adhärierte Bakterien können einfacher von Immunzellen beseitigt werden, bevor sich ein ausgereifter Biofilm bildet [59].
Für die Generierung antiadhäsiver Oberflächen können chemische Modifikationen des Materials, eine Veränderung der Oberflächentopographie oder eine Kombination aus beidem vorgenommen werden. Das Ziel solcher Modifikationen ist meistens die Herstellung einer superhydrophoben Oberfläche, auf der hydrophile Biomoleküle kaum adhärieren können.
Solche Oberflächen zeichnen sich durch eine geringe Benetzbarkeit mit Wasser und damit auch mit biologischen Medien aus [59, 60].
Chemische Modifikationen für superhydrophobe Beschichtungen können polyanionische Polymere, Dextran, Polyethylenglycol (PEG), methylierte und fluorierte Kohlenstoffgruppen oder Fluoralkylsilane beinhalten. Oft haben diese Verbindungen eine geringe Oberflächenenergie, also eine geringe Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung chemischer Bindungen [14, 59]. Antiadhäsive Oberflächen können auch durch das Erstellen von Mikro- und Nanotopographien erreicht werden. Durch Anwendung physikalischer Methoden wie reaktivem Ionentiefenätzen, Nanoprägelithografie, Plasmabearbeitung oder Laser-Ablation können dabei chemische Rückstände weitgehend verhindert werden, was vorteilhaft in Bezug auf die Biokompatibilität und die spätere klinische Anwendung ist [58]. Mit Hilfe der Laser- Ablation wurden bereits unterschiedlichste Strukturen in Titan generiert. So hergestellte SharkletTM-, Wellen-, Spike- und Lotus-Strukturen zeigten eine inhibierende Wirkung auf die bakterielle Adhäsion und Biofilmbildung (Abb. 1.2) [58, 61-64]. Häufig wird durch die Strukturierung eine Minimierung der bakteriellen Adhäsionsfläche angestrebt. Bakterien können beispielsweise nicht in die Täler von Nanostrukturen gelangen, so dass sie nur mit den Spitzen interagieren können. Allerdings muss beachtet werden, dass Topographien ihre Superhyrdophobizität oft durch den Einschluss von Luftblasen erhalten und dieser Effekt in vivo nach kurzer Zeit verloren gehen kann [60, 63]. Einige Studien sprechen sogar gegen die antibakterielle Wirkung von Nanotopographien [65]. Ein neuer und vielversprechender Ansatz für Implantat-Oberflächen sind die „slippery, liquid-infused porous surfaces“ (SLIPS). Hierbei
10 wird die Oberfläche der Kanneninnenseiten der Pflanzengattung Nepenthes imitiert, auf welcher sich ein antiadhäsiver Flüssigkeitsfilm befindet [40, 66, 67]. Da eukaryotische Zellen ebenso wie Bakterien Proteine als Liganden für die Adhäsion benötigen, eignen sich antiadhäsive Oberflächen jedoch nicht für die Integration in das umliegende Gewebe [40].
Generell besteht ein Konflikt zwischen antibakterieller Aktivität bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Biokompatibilität.
1.2.3. Antibakterielle Aktivität vs. Gewebeintegration
Antibakterielle Oberflächen besitzen oft auch eine verminderte Biokompatibilität. Bei antiadhäsiven Oberflächen liegt dies an den ähnlichen Adhäsionsmechanismen zwischen Prokaryoten und Eukaryoten [68]. Andere Modifikationen wie kationische Gruppen oder UV- aktivierbare Oberflächen schädigen auch die Membranen eukaryotischer Zellen [44, 69].
Genauso wirken antimikrobielle Substanzen ab einer gewissen Konzentration zytotoxisch [70].
Hier gilt es einen therapeutischen Bereich zu finden, bei dem eine antibakterielle Aktivität und zugleich Biokompatibilität vorliegt. Auf der anderen Seite erleichtern besonders biokompatible Oberflächen, auf denen Gewebezellen gut adhärieren können – z.B. durch den hydrophilen Charakter oder die Erhöhung der verfügbaren Oberfläche durch Aufrauhung – oft auch die Adhäsion von Bakterien [71]. Proteine, welche sich auf der Implantatoberfläche ablagern, können sowohl die Adhäsion von Gewebezellen als auch die Adhäsion von Bakterien fördern.
Zum Beispiel binden nicht nur Adhäsionsproteine eukaryotischer Zellen gezielt an die Aminosäuresequenzen des Fibronectins, sondern auch die Oberflächenproteine von Staphylokokken [68]. Gewebezellen und Mikroorganismen konkurrieren also um die Besiedlung von Implantat-Oberflächen. Diese Konkurrenz wurde bereits 1988 von Anthony Gristina als „race for the surface“ beschrieben [72]. In der zahnärztlichen Prothetik gilt dieses Prinzip in besonderer Weise, da eine ständige Bakterienbelastung durch die oralen Keime vorherrscht. Umso wichtiger ist eine schnelle Einheilung in das umliegende Gewebe, um die bakterielle Adhäsion zu unterbinden.
Um der besonderen Herausforderung biokompatibler und gleichzeitig antibakterieller Oberflächen gerecht zu werden, wurden multifunktionelle Oberflächen entwickelt. Dabei werden z.B. antibakterielle Substanzen wie Silber, Chitosan und antibakterielle Peptide mit biokompatiblen Peptiden oder Beschichtungen wie TiCaN kombiniert [73-76]. Attraktiver sind
11 Oberflächen, welche durch eine einzelne Modifikation multifunktionelle Eigenschaften erlangen. Dies gelingt beispielsweise durch antiadhäsive Mikrostrukturen, welche in einem Abstand von 1,5 µm auf adhäsiven Oberflächen fixiert sind. Die relativ starren Bakterien können hier kaum zwischen die Mikrostrukturen auf die adhäsiven Bereiche gelangen, wobei die flexiblen eukaryotischen Zellen ausreichend Integrin-Bindungen aufbauen können [65]. Ein anderer Ansatz nutzt mikrostrukturiertes Titan, welches durch die Bedampfung mit Tantal eine hierarchische Mikro-Nano-Struktur erhält. MSCs adhärieren gut auf den Oberflächen, wohingegen die Adhäsion oraler Keime deutlich eingeschränkt ist [77]. Die Übertragbarkeit dieser Studien auf die In-vivo-Situation ist jedoch fraglich. Die Verwendung immortalisierter und/oder muriner Zellen, mangelnde Biofilm-Analysen und kurze Inkubationszeiten stellen hier eine Limitation dar. Die Biokompatibilität von Implantat-Oberflächen sollte mit möglichst belastbaren Modellen nachgewiesen werden, bevor die entsprechenden Implantate in die klinische Translation gelangen. Heilt das Implantat nicht in das umliegende Gewebe ein, so kann es seine Aufgabe nicht erfüllen. Die Entwicklung und Verbesserung biokompatibler Oberflächen ist daher von besonderem Interesse.
1.3. Biokompatibilität von Implantat-Oberflächen
Biokompatibilität ist die Fähigkeit eines Materials, in einem Patienten eine spezifische Funktion auszuüben ohne wesentliche schädliche Effekte zu verursachen [1]. Im Falle von dentalen und orthopädischen Implantaten muss hierfür eine starke Verbindung zur EZM und zu den Gewebezellen gegeben sein [11]. Damit die Zellen adhärieren können, müssen zunächst Proteine wie Fibrin, Fibronectin und Kollagen auf der Implantatoberfläche absorbieren. Diese Proteine dienen als Liganden für die Adhäsionsrezeptoren der Zellen, deren wichtigste Vertreter die Integrine sind [78]. Eine übermäßige Adhäsion von Leukozyten und Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine ist hingegen unerwünscht, um starke Entzündungsreaktionen im Gewebe zu verhindern [1]. Bei Dentalimplantaten sind vor allem die Adhäsion, Proliferation, Migration und Differenzierung von Gingivafibroblasten und Osteoblasten sowie deren Vorläuferzellen erwünscht. Um diese Ziele zu erreichen, wurden bereits viele unterschiedliche Oberflächenmodifikationen vorgenommen [4, 8, 16, 79, 80]. Viele dieser Modifikationen haben die Simulation der natürlichen Umgebung der Zellen zum Ziel, also der gewebespezifischen EZM. Eine Simulation der EZM kann biochemisch, chemisch und physikalisch vorgenommen werden [71, 81].
12
1.3.1. Oberflächen-Modifikationen
Eine biochemische Simulation des umgebenden Gewebes durch eine Beschichtung der Implantat-Oberflächen mit Proteinen der EZM kann die zelluläre Adhäsion maßgeblich verbessern. Da unterschiedliche Zelltypen eine unterschiedliche Affinität zu bestimmten EZM- Proteinen aufweisen, können hier Gewebe-spezifische Beschichtungen vorgenommen werden [25, 27]. Auch die Anbindung einzelner Peptidsequenzen von EZM-Proteinen kann noch eine deutliche Steigerung der Biokompatibilität mit sich bringen. Die RGD-Sequenz (ein Tripeptid aus Arginin, Glycin und Asparaginsäure), welche vor allem im Fibronectin vorkommt, findet eine breite Anwendung in der Oberflächenfunktionalisierung [25, 71, 82]. Die Herstellung, Isolation und Aufreinigung von Biomolekülen ist jedoch meist mit hohen Kosten und erheblichem Aufwand verbunden. Anorganische Modifikationen sind in der Regel günstiger und leichter herzustellen. Sie werden vor allem genutzt, um osteoinduktive Oberflächen zu erhalten. Beispiele hierfür sind die Integration von Zink in Titan oder eine Beschichtung mit bioaktiven CaP-Keramiken wie Hydroxylapatit [Ca10(PO4)6(OH)2] und Fluorapatit [Ca10(PO4)6F2] [11, 83]. Durch chemische oder biochemische Funktionalisierungen von Oberflächen können allerdings Chemikalienrückstände im Material verbleiben. Darüber hinaus macht das Einbringen neuer Substanzen oder Biomoleküle weitere Biokompatibilitätstestungen und Zulassungsprozesse notwendig [1], [2*]. Mit einer rein physikalischen Bearbeitung der Implantatoberfläche können diese Probleme vermieden werden.
Auch bei den physikalischen Modifikationen wird versucht, Eigenschaften der EZM zu kopieren und so die Biokompatibilität der Implantatoberfläche zu erhöhen. Die meisten Modifikationen haben dabei zum Ziel, die Hydrophilie der Oberfläche zu erhöhen oder eine Topographie im Mikro- oder Nanometer-Bereich zu generieren. Im Gegensatz zu der hydrophilen Protein-Matrix der EZM sind die meisten Implantat-Oberflächen im klinischen Einsatz eher hydrophob [71]. Hydrophobe Oberflächen sind anfällig für Kohlenwasserstoff- und Carbonat-Kontaminationen aus der Luft, wodurch es zu einer Herabsetzung der Oberflächenenergie und zu Lufteinschlüssen kommt. Die Folge ist eine schlechtere Benetzbarkeit mit wässrigen bzw. biologischen Medien und somit auch eine schlechtere Adhäsion von Proteinen und Gewebezellen. Durch Denaturierung oder Konformationsänderungen von Proteinen können hydrophobe Oberflächen zusätzlich die Zelladhäsion stören [12, 60]. Hydrophile Oberflächen hingegen weisen durch ihre starke Interaktion mit Proteinen und Zellen eine gute Biokompatibilität auf. Weiterhin wird
13 angenommen, dass hydrophile Oberflächen weniger Immunreaktionen und Gerinnungsreaktionen auslösen [12]. Die Generierung einer hydrophilen Oberfläche kann z. B.
durch Ätzen, UV-Bestrahlung, Plasmabehandlung oder Laserbearbeitung von Titan geschehen.
Dies führt zu einer Präsentation von polaren OH-Gruppen. Oft hält diese Hydrophilie auf Grund der genannten Interaktionen mit Kohlenstoffverbindungen aus der Luft jedoch nur kurz an. Eine deutlich stabilere Hydrophilie kann durch die Lagerung in einem Schutzgas oder in Wasser erreicht werden [60, 84].
Im Gegensatz dazu wird mit dem Aufbringen einer Topographie eine langfristige und zellspezifische Erhöhung der Biokompatibilität angestrebt. Generell gelten glatte Oberflächen als förderlicher für die Einheilung von Weichgewebe und raue Oberflächen förderlicher für die Einheilung in den Knochen. Fibroblasten und Epithelzellen zeigen auf glatten Oberflächen i.d.R. eine bessere Adhäsion und Proliferation als auf rauen Oberflächen [85, 86]. Für Osteoblasten und MSCs sind raue Oberflächen mit hoher Komplexität das geeignetere Substrat [3]. Für die Erstellung von Mikro- und Nanotopographien steht eine Vielzahl unterschiedlicher Methoden zur Verfügung. Eine regelmäßige Anwendung finden zum Beispiel die maschinelle Bearbeitung, Sandstrahlung, Ätzen, Plasmabehandlung, Anodisierung, Lithographie, chemische und physikalische Deposition und die Laserbearbeitung [10, 71]. Die „Ultrakurz- Puls-Laser-Ablation“ stellt eine spezielle Bearbeitungsmethode dar, bei welcher durch einen Laserstrahl mit einer definierten Energie und Frequenz Material abgetragen wird. Die Methode ist auf viele Materialien anwendbar, flexibel und sie ermöglicht die präzise Herstellung einer Vielzahl komplexer Geometrien im Mikro- und Nanometerbereich (Abb. 1.2). Im Gegensatz zu anderen Methoden ist hier nur ein einziger Verarbeitungsschritt nötig [87].
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Abb. 1.2: Laserstrukturierte Topographien in Titan. Gräben (A), kreuzende Gräben (B), Wellen (C), Spikes (D), geneigte Spikes (E) und Muster aus Spikes (F). (Aufnahmen von Dr. Elena Fadeeva)
Generell wird zwischen Mikrotopographie und Nanotopographie unterschieden. Durch das Einbringen einer Mikrotopographie können EZM-Strukturen im Mikrometerbereich wie Kollagenfasern oder Resorptions-Lakunen simuliert werden [3, 88, 89]. Zusätzlich kommt es zu einer besseren mechanischen Verankerung im Knochen sowie zu einer größeren Kontaktfläche zwischen den Zellen und der Implantatoberfläche (Abb. 1.3) [3]. Die Zellmorphologie passt sich so der Oberfläche an, dass sie der in der EZM ähnelt. Im Falle von Osteoblasten und Vorläuferzellen stimuliert dies bereits die osteogene Differenzierung und so die Osseointegration. Den Einfluss, den die Topographie auf die Morphologie, Adhäsion, Proliferation, Migration und Differenzierung der Zellen hat, wird als Kontaktführung (engl.:
contact guidance) bezeichnet [90]. Um den Einfluss der Mikrotopographie besser zu verstehen, wurden in der Vergangenheit definierte Strukturen wie Gräben, Säulen, Pfosten, Gruben, Spikes/ Stacheln erstellt und deren Effekte auf das Zellverhalten untersucht. Zellen orientieren sich beispielsweise entlang der Richtung von Mikrorillen und migrieren bevorzugt entlang deren Verlauf [90-92]. Eine Erhöhung der Migrationsrate von Fibroblasten ist auf Säulen von wenigen Mikrometern Durchmesser zu beobachten [93, 94]. In Bezug auf Adhäsion und Proliferation scheint ein Abstandsabhängiger Effekt vorzuliegen. Auf Strukturen bis zu 2 µm Abstand zeigen Fibroblasten kaum Veränderungen gegenüber der Kontrolle, wohingegen eine starke Beeinträchtigung ab einem Abstand von 4 µm zu beobachten ist [85]. Ein vergleichbarer
15 Effekt ist auf Laser-strukturierten Spikes zu sehen, dieser wurde jedoch nicht tiefergehend untersucht [95].
Die Generierung einer Nanotopographie hat ebenfalls eine Vergrößerung der Oberfläche zur Folge. Dies führt zu einer erhöhten Absorption von EZM-Proteinen wie Fibronectin und Kollagen und fördert so die Integrin-vermittelte Zelladhäsion (Abb. 1.3) [3, 78]. Allerdings sind auch die Abstände bzw. die Dimensionen von Nanostrukturen wichtig für die Zellreaktion. Aus Untersuchungen konnte ein maximaler Abstand von ca. 70 nm zwischen Integrindimeren ermittelt werden, über welchem die Integringruppierung eingeschränkt ist [96]. Die Integringruppierung und damit verbundene Ausbildung von Fokalen Adhäsionen (FAs) ist für die Adhäsion und Folgeprozesse wie Proliferation und Migration essentiell (Abb. 1.4) [78, 97, 98]. Mit Hilfe der Nanotopographie können darüber hinaus EZM-Strukturen im Nanometerbereich wie Kollagenfirbrillen oder Hydroxylapatit-Kristalle simuliert werden, was zur Stimulation der osteogenen Differenzierung führt [88]. Nanostrukturen können jedoch auch positive Effekte auf die Weichgewebseinheilung haben. Eine Struktur aus nanoskaligen Spikes und Poren stimuliert beispielsweise in vivo die Kollagensynthese von Fibroblasten und die Anbindung von Kollagenfasern ähnlich der parodontalen Situation [99]. Durch Gefahr einer NP-Ablösung, der speziellen NP-Eigenschaften und einer möglichen zellulären Aufnahme, muss hier jedoch besonders auf die Biokompatibilität geachtet werden [39].
Abb. 1.3: Interaktion von Knochengewebe und Osteoblasten mit einer Implantatoberfläche. Auf Makroebene bietet eine große Oberfläche eine starke mechanische Verankerung im Knochen. Auf Mikroebene passen sich die Zellen der Oberfläche an und auf Nanoebene binden die Rezeptoren der Zellen an Peptidsequenzen der absorbierten Proteine (Abb. mit Erlaubnis aus [89]).
16 Durch die Kombination der Mikro- und der Nanotopographie wird die EZM des Knochens noch besser simuliert als durch die einzelnen Topographien. Solch eine hierarchische Topographie (Nano- auf Mikrotopographie) hat entsprechend einen stärkeren stimulierende Effekt auf die osteogene Differenzierung von Osteoblasten(-Vorläuferzellen) und MSCs [60, 89, 100].
Entsprechende Oberflächen, welche mit Hilfe von Laserablation hergestellt werden, stimulieren beispielsweise die osteogene Differenzierung von MSCs [81, 101, 102].
Abb. 1.4: Die Gruppierung von Integrinen bestimmt das Zellverhalten. Bei der Gruppierung von Integrindimeren werden Adapterproteine rekrutiert, welche eine Verbindung mit dem Actinzytoskelett eingehen und so FAs ausbilden. Extrazelluläre oder intrazelluläre Zugkräfte des Actinzytoskeletts stimulieren das FA- Wachstum. Die Integringruppierung und FA-Bildung sind essentiell für zelluläre Prozesse wie Proliferation, Kontraktion und den FA-Umbau (Abb. mit Erlaubnis aus [97]).
Neben der Kontrolle des Zellverhaltens durch Topographien ist auch das Erreichen zellspezifischer Effekte gewünscht, also die Besiedlung bestimmter Implantatbereiche mit einem Zelltyp und die Vermeidung anderer Zelltypen. Dies gilt beispielsweise im Bereich des Knochens, wo das Wachstum von Osteoblasten stimuliert und das Wachstum von Fibroblasten inhibiert werden soll. Eine übermäßige Fibroblastenproliferation kann hier zu einer Bindegewebskapsel führen, wodurch das Implantat isoliert wird und seine Funktionalität verliert [3, 103]. Im Bereich des Abutments möchte man das Anwachsen von Fibroblasten gewährleisten aber die Migration von Epithelzellen Richtung Implantatschraube inhibieren [15]. Entsprechende Effekte werden zum Beispiel durch hierarchische Mikro-Nano- Topgraphien und Mikrogräben erreicht [3, 17]. Zellspezifische Effekte sind ebenfalls auf Laser- generierten Spike-Strukturen zu beobachten. Osteoblasten und Neuroblastoma-Zellen wachsen
17 hier besser als Fibroblasten [104, 105]. Auf Grund der Verwendung immortalisierter Zellinien ist die Aussagekraft der meisten dieser Studien jedoch begrenzt. Neben der klinischen Relevanz bieten Oberflächentopographien auch ein effektives Mittel zur Analyse und zum Verständnis zellbiologischer Phänomene. Dies gilt vor allem für Mechanismen der Adhäsion und Zytoskelett-Regulation und wie diese Einfluss auf Proliferation, Migration und Differenzierung nehmen [85, 106-110].
1.3.2. Analyse der Biokompatibilität
Damit neue Implantatmaterialien zur klinischen Anwendung kommen können, muss in Deutschland eine Zulassung im Sinne des Medizinproduktgesetzes (MPG) und bei Einlagerung von biologisch aktiven Substanzen evtl. des Arzneimittelgesetzes (AMG) erfolgen. Mit Hilfe des MPG sollen Sicherheit, Eignung und Leistung bzw. Funktionalität des Implantats sowie die Gesundheit und Schutz des Patienten, Anwender und Dritter sichergestellt werden [2*, 3*]. Die biologische Sicherheitsprüfung bzw. Analyse der Biokompatibilität neuer Materialien verläuft dabei in der Regel in drei Stufen. Als erstes wird eine Testung ,,in vitro“, also außerhalb eines Organismus durchgeführt. Hier wird die Biokompatibilität vor allem mit Zellkulturen untersucht. In diesem Fall spricht man auch von Zytokompatibilität. Da die Komplexität eines kompletten Organismus bisher in vitro nicht nachgebildet werden kann, muss im zweiten Schritt die Testung „in vivo“ erfolgen. Auch wenn die Unbedenklichkeit und Funktionalität im Säugetiermodell nachgewiesen wurde, können dennoch unerwartete Reaktionen im Menschen auftreten. Im Rahmen der entsprechenden klinischen Studien ist nun die Unbedenklichkeit und Leistungsfähigkeit des Materials im menschlichen Körper nachzuweisen [2*, 3*]. Teile oder sogar die gesamte Biokompatibilitätsprüfung können umgangen werden, wenn bereits identische Materialien mit gleichen Eigenschaften auf dem Markt sind bzw. ausreichend Daten für das Produkt vorhanden sind [1]. Obwohl In-vitro-Untersuchungen weniger relevante Daten für die klinische Anwendung liefern, besitzen sie auch einige Vorteile gegenüber In-vivo- Untersuchungen. Sie sind ethisch weniger problematisch, schneller durchzuführen, kostengünstiger, leichter zu standardisieren, besser reproduzierbar und können für eine ausgedehntes Screening angewendet werden [111]. Für die Bewertung der Zytokompatibilität können viele unterschiedliche Parameter mit Hilfe unterschiedlicher Methoden analysiert werden. Dabei kann zwischen der grundsätzlichen Zytotoxizität von Materialien und der spezifischeren Zytokompatibilität von Implantat-Oberflächen unterschieden werden.
18 Zytotoxizität von Implantat-Materialien
Für die Analyse der grundsätzlichen biologischen Verträglichkeit bzw. zytotoxischen Wirkung eines Materials zu Beginn der Testungen können mehrere zelluläre Parameter untersucht werden. Die ISO-Norm 10993-5 (Biologische Beurteilung von Medizinprodukten – Teil 5:
Prüfung auf In-vitro-Zytotoxizität) und die ISO-Norm 7405 (Beurteilung der Biokompatibilität von Medizinprodukten in der Zahnmedizin) geben entsprechend Empfehlungen für die Prüfung auf In-vitro-Toxizität [5*, 6*]. Dabei beziehen sie sich jedoch vor allem auf flüssige Proben bzw. Extrakte der Biomaterialien und der Diffusion von Substanzen. Dies ist vor allem bei neuen Stoffen oder Materialien relevant, welche toxische Substanzen an die Umgebung abgeben können. Hier ist unter Umständen eine Testung einzelner Materialien sinnvoll, um frühzeitig kritische Bestandteile zu identifizieren.
Die metabolische Aktivität der Zellen wird häufig für die Analyse der Zytotoxizität verwendet.
Dieser Parameter kann Auskunft über den physiologischen Zustand der Zellen geben. Eine hohe Aktivität ist in der Regel mit vitalen und proliferierenden Zellen, seltener mit Stressreaktionen assoziiert [112]. Neben der Viabilität (= Lebensfähigkeit) wird die metabolische Aktivität auch häufig für die Quantifizierung von Zellen verwendet. Metabolisch aktive Zellen können mit membrangängigen Lebend-Farbstoffen, welche enzymatisch zu fluoreszierenden Produkten umgewandelt werden, mikroskopisch oder mit Hilfe der Durchflusszytometrie detektiert werden. Eine Quantifizierung kann auch über die Messung des zellulären ATP-Gehalts oder der Aktivität zytosolischer Enzyme geschehen [113-117]. Am häufigsten wird hierbei die zelluläre Reduktionskapazität genutzt. Durch die Reduktion von MTT oder Resazurin werden beispielsweise farbige bzw. fluoreszierende Produkte gebildet, die einfach quantifiziert werden können [118]. Da die alleinige Bestimmung der metabolischen Aktivität die Gefahr falsch positiver oder falsch negativer Ergebnisse mit sich bringt, sollte zumindest bei initialen Versuchen auch ein weiterer zellulärer Parameter bestimmt werden.
Toxische Effekte können aber auch zur Perforation der Plasmamembran bzw. Zellnekrose führen. Durch den Einsatz von Tot-Farbstoffen, welche nur Zellen mit perforierter Zellmembran anfärben, können tote Zellen mikroskopisch oder mit Hilfe der Durchflusszytometrie detektiert werden [102, 115]. Ist die Plasmamembran perforiert, so gelangen Enzyme aus der Zelle in das Zellkulturmedium. Für die Quantifizierung der Membranintegrität existieren verschiedene Testsysteme, mit denen sich die Aktivität
19 zytosolischer Enzyme im Zellkulturmedium bestimmen lassen. Ein beliebtes Enzym für die Bestimmung hierfür ist die Laktatdehydrogenase (LDH), da sie in vielen Zellen konstitutiv exprimiert wird [119]. Die Aktivität zytosolischer Enzyme kann kolorimetrisch, fluorometrisch oder luminometrisch bestimmt werden [115]. Weitere Methoden für die Analyse der Zytotoxizität sind die Zellzahlbestimmung lebender und toter Zellen sowie die Quantifizierung von Zellkolonien [5*].
Für erste Toxizitätstests können immortalisierte und nicht-humane Zellen verwendet werden.
In Standards wie der ISO 10993-5 werden entsprechende Zelllinien empfohlen. Diese Zellen sind leicht verfügbar, einfach zu kultivieren und innerhalb einer Zelllinien recht homogen, so dass Ergebnisse in der Regel besser zu reproduzieren sind [120, 121]. Im Gegensatz zu löslichen Substanzen ist die Prüfung durch direkten Kontakt eines soliden Probekörpers mit den Zellen kaum standardisiert. In den ISO-Normen wird solch eine Testung nur rudimentär beschrieben.
Für die In-vitro-Prüfung von Implantaten, welche in das umliegende Gewebe integriert werden sollen, ist die Interaktion der Oberflächen mit den Zellen jedoch essentiell.
Zytokompatibilität von Implantat-Oberflächen
Für die tiefergehende und aussagekräftigere Untersuchung der Zytokompatibilität von Implantat-Oberflächen sollten primäre humane Zellen verwendet werden. Als Isolate aus humanem Gewebe entsprechen diese Zellen in ihrem Phänotyp am besten der Situation in vivo.
Darüber hinaus spiegelt ihre Heterogenität innerhalb und zwischen Isolaten die klinische Situation wieder [122, 123]. Für die Analyse von Oberflächentopographien werden aber auch regelmäßig immortalisierte Zelllinien verwendet oder mit primären Zellen kombiniert [79, 80, 93, 94, 124-127]. Auf Grund der Unterschiede zu primären Zellen ist die Aussagekraft dieser Studien in Bezug auf die Biokompatibilität jedoch zu hinterfragen.
Neben der Bewertung der Zytotoxizität, Viabilität, Differenzierung, Genotoxizität, Apoptose, Inflammation oder des oxidativen Stress sind vor allem die Adhäsion, Proliferation, Migration und Morphologie der Zellen auf Implantat-Oberflächen von Interesse [1, 79, 80, 116]. Damit ein Implantat in das umliegende Gewebe integriert werden kann, müssen die entsprechenden Zellen zunächst auf der Implantatoberfläche adhärieren. Nur adhärierte Gewebezellen können ihre Funktion ausüben, proliferieren, migrieren und differenzieren und so zur
