Homogene Strukturen - Migration

Im dritten Teil der Spike-Untersuchungen wurde die Zellmigration der vier Zelltypen auf den homogenen Spike-Strukturen analysiert. Hierfür musste zunächst ein neuer Versuchsaufbau entwickelt werden. Da der Zellrasen wegen der instabilen Strukturen nicht mechanisch entfernt werden konnte, wurden Barrieren und Abdeckungen mit Parafilm und Silikon getestete. Diese wurden wegen der schlechten Haftung und schlechter Reproduzierbarkeit jedoch verworfen (Daten nicht gezeigt). Schließlich hat sich eine Abdeckung mit einem polierten Keramikstift durchgesetzt. Zusätzlich wurden Proben und ein Probenhalter mit definierten Abmessungen entworfen. Es wurden Proben hergestellt, bei denen die 3 Spike-Strukturen übereinander angeordnet waren. Jede Spike-Struktur hatte eine Abmessung von 3 mm x 3 mm (Abb. 3.8C).

Für die Visualisierung der Zellen wurden unterschiedliche Lebend-Fluoreszenzfarbstoffe wie Cyto-ID® Red, CellTracker^TM Red und Calcein-AM getestet. Für die Langzeit-Farbstoffe Cyto-ID® Red und CellTracker^TM Red wurden die Zellen einmal in Suspension gefärbt, ausgesät und anschließend über mehrere Tage beobachtet. Da die Fluoreszenzsignale im angestrebten Zeitraum zu stark abnahmen, wurde der Kurzzeit-Farbstoff Calcein-AM getestet, mit welchem auch adhärente Zellen angefärbt werden können (Daten nicht gezeigt). In der vom Anbieter vorgeschlagenen Konzentration von 1 µg/ml wirkte die Prozedur toxisch auf die Zellen, so dass alle Zellen im mikroskopierten Bereich abstarben. Nach der Testung einer

96 Verdünnungsreihe von Calcein-AM zeigte sich eine Konzentration von 25 ng/ml als nicht toxisch für die Zellen und ausreichend für eine Visualisierung (Daten nicht gezeigt). Die Strukturen wurden mit den Keramikstiften abgedeckt, die Zellen auf den Aufbau ausgesät und für 14 d kultiviert. Nach 1, 3, 7, 10 und 14 Tagen wurden die Zellen mit Calcein gefärbt und mikroskopiert. Dabei galt der erste Tag als Kontrolle für eine gerade, geschlossene Zellfront.

Dies wurde bei allen Bedingungen erreicht (Daten nicht gezeigt). Die Daten stützen sich auf drei unabhängige Wiederholungen.

Im Folgenden werden Aufnahmen von je einem repräsentativen Versuch dargestellt, anhand derer die Migration beschrieben wird. Die Aufnahmen zeigten bei den HGFib nach 3 d noch keine Migration in die Strukturen. Bei den NIH/3T3 war eine deutliche Migration eines geschlossenen Zellrasens in die kleinen Spikes und eine minimale Migration in die großen Spikes zu beobachten. Eine Migration weniger einzelner Zellen in die kleinen und großen Spikes war bei den NHOst sichtbar. Bei den MC3T3-E1 war lediglich eine Migration einzelner Zellen in die kleinen Spikes zu beobachten (Abb. 3.21). Nach 7 d war für alle Zelltypen eine deutliche Migration zu erkennen. Am stärksten war diese bei den NIH/3T3. Hier hatten die Zellen vollständig die kleinen Spikes bewachsen. Auch auf den mittleren und großen Spikes war bereits eine geschlossene Zellfront in die Strukturen migriert. Die HGFib und die MC3T3-E1 waren bereits deutlich in die kleinen Spike-Strukturen gewandert, aber nur in geringem Maße in die mittleren und großen Spikes. Die HGFib auf den kleinen Spikes hatten dabei eine vergleichbare Morphologie wie auf der Kontrolle, die Zellen auf den mittleren und großen Spikes waren deutlich länglicher. Bei den NHOst waren vereinzelt Zellen in alle Strukturen migriert (Abb. 3.22). Nach 10 d hatten die NIH/3T3 nun auch fast vollständig die mittleren und großen Spikes bewachsen. Die HGFib waren in einen großen Teil der kleinen Spikes migriert.

Die länglicheren Zellen auf den großen Spikes waren hier etwas stärker fortgeschritten als die auf den mittleren. Bei den MC3T3-E1 war nur eine geringe Zellmigration zu beobachten. Auch hier waren mehr Zellen in die kleinen als in die mittleren und großen Spikes gewandert. Die Migration einzelner NHOst wies einen ähnlichen Trend auf (Abb. 3.23). Nach 14 d waren bei den NIH/3T3 alle Strukturen zugewachsen. Bei den HGFib waren nun die kleinen Spikes vollständig bewachsen und die mittleren und großen Spikes zu einem kleineren Teil. Die Migration der MC3T3-E1 war auf den kleinen Spikes deutlich fortgeschritten, auf den mittleren und großen Spikes nur in einem sehr geringen Maße. Einzelne NHOst schienen etwas verstärkt in die kleinen Spikes zu migrieren als in die anderen Strukturen (Abb. 3.24).

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101 Für die Quantifizierung der Migration wurde jeweils der Zellbewuchs von 50 % der Spike-Strukturen vermessen und auf die Kontrolle normiert (siehe Abb. 2.4). Die NIH/3T3 wiesen auf allen Strukturen die stärkste Migration auf. Die Konfluenz der NIH/3T3 war nach 3 Tagen nur geringfügig höher als die der anderen Zelltypen. Ab einer Kultur von 7 Tagen zeichnete sich dieser Unterschied jedoch bereits deutlich ab. Nach 10 Tagen war bei diesem Zelltyp auf den mittleren und großen Spikes allerdings eine hohe Standardabweichung zu beobachten. Die anderen Zelltypen unterschieden sich nur geringfügig voneinander. Nach 14 Tagen gab es auch bei den HGFib auf den kleinen Spikes eine hohe Standardabweichung (Abb. 3.25). Nach 7 Tagen hatten die NIH/3T3 mit 86,4 % auf den kleinen Spikes, 30,2 % auf den mittleren und 33

% auf den großen Spikes auf allen Strukturen eine signifikant höhere Konfluenz als die anderen Zelltypen, welche nur eine Konfluenz um die 25 % auf den kleinen Spikes und um die 10 % bei den mittleren und großen Spikes aufwiesen. Die HGFib, die NHOst und die MC3T3-E1 unterschieden sich nur geringfügig voneinander (Abb. 3.25B). Nach 14 Tagen hatten die NIH/3T3 auf allen Spike-Größen fast eine Konfluenz von 100 % der Kontrolle erreicht. Da die anderen Zellen im Vergleich nur geringfügig migriert waren, hatten sich die Unterschiede zwischen den NIH/3T3 und den anderen Zellen auf den mittleren und großen Spikes noch verstärkt. Es war jedoch eine deutliche Migration der HGFib auf den kleinen Spikes zu beobachten. Mit 52,4 % der Kontrolle war die Migration hier signifikant höher als die der NHOst und der MC3T3-E1 (Abb. 3.25C). Bei einem direkten Vergleich der Spike-Größen wurde die Abhängigkeit des Zellverhaltens von der Spike-Größe deutlich. Nach 7 d wiesen alle Zellen eine signifikant höhere Migration auf den kleinen Spikes auf als auf den mittleren und großen Spikes (Abb. 3.25D). Nach 14 d war dieser Unterscheid nur noch bei den HGFib signifikant (Abb. 3.25E).

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Abb. 3.25: Migration auf homogenen Spike-Strukturen. HGFib, NIH/3T3, NHOst und MC3T3-E1 wurden für 3, 7, 10 und 14 d auf homogenen Spike-Strukturen kultiviert und die Migration wurde per Calceinfärbung und Konfluenzmessung bestimmt. Es sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus 3 Versuchen dargestellt.

Signifikanzen wurden mit einer Two-Way-ANOVA ermittelt (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

103 Um die Zellmorphologie nach 14 Tagen darzustellen, wurden die Zellen mit Phalloidin-TRITC und DAPI gefärbt und die Spikes durch indirektes Licht visualisiert (Abb. 3.26/Abb. 3.27). Die Zellen zeigten abgesehen von den NIH/3T3 eine vergleichbare Morphologie wie auch nach 24 h und 72 h (Abb. 3.10 bis 3.17). Auf den kleinen Spikes waren die Zellen etwas kleiner als auf der Kontrolle. Das Zytoskelett war nicht gestört und die Zellkerne waren rund (Abb. 3.26B, Abb. 3.27B/F). Auf den mittleren und großen Spikes hatten die HGFib, NHOst und MC3T3-E1 eine geringere Fläche und die primären Zellen waren wesentlich länglicher als auf der Kontrolle und auf den kleinen Spikes. Zusätzlich waren die Zellkerne deformiert und das Zytoskelett war gestört. Bei den kreisförmigen Aussparungen im Zytoskelett waren nun die Spikes zu erkennen (Abb. 3.26C/D, Abb. 3.27C/D/G/H). Die NIH/3T3 hatten alle Spike-Strukturen komplett bewachsen. Auf Grund der hohen Zelldichte waren die Zellmorphologie und die Interaktion mit der Topographie nicht mehr zu bestimmen. Die Zellkerne hatten hier überall eine runde Morphologie (Abb. 3.26E-H).

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Abb. 3.26: Morphologie von Fibroblasten nach 14 Tagen Migration auf homogenen Spike-Strukturen.

HGFib (A-D) und NIH/3T3 (E-H) wurden für 14 Tagen auf glatten Kontrollen (A/E), kleinen Spikes (B/F), mittleren Spikes (C/G) und großen Spikes (D/H) kultiviert. Die Zellen wurden fixiert und mit Phalloidin-TRITC (rot) und DAPI (blau) gefärbt. Die Spikes wurden durch indirektes Licht (grün) visualisiert. Maßstab = 50 µm.

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Abb. 3.27: Morphologie von Osteoblasten nach 14 Tagen Migration auf homogenen Spike-Strukturen.

NHOst (A-D) und MC3T3-E1 (E-H) wurden für 14 Tagen auf glatten Kontrollen (A/E), kleinen Spikes (B/F), mittleren Spikes (C/G) und großen Spikes (D/H) kultiviert. Die Zellen wurden fixiert und mit Phalloidin-TRITC (rot) und DAPI (blau) gefärbt. Die Spikes wurden durch indirektes Licht (grün) visualisiert. Maßstab = 50 µm.

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