Homogene Strukturen - Adhäsion und Proliferation

3. Ergebnisse

3.3. Spike-Strukturierungen

3.3.2. Homogene Strukturen - Adhäsion und Proliferation

Auf Grund der beobachteten Unterschiede in Abhängigkeit der Spike-Abstände wurde im zweiten Teil der Untersuchungen das Zellverhalten auf homogene Spike-Strukturen mit definierten Spike-Abständen detaillierter analysiert. In Anbetracht des erheblichen Produktionsaufwandes und einer großen Anzahl benötigter Proben (n = 72, exklusive Überschuss) für eine aussagekräftige Datenlage, mussten Proben mit sehr kleinen Abmessungen verwendet werden. Jede Probe bestand aus einem Quadranten (2 mm Kantenlänge) mit kleinen Spikes (mittlerer Spike-Abstand 2,3 µm), einem Quadranten mit mittelgroßen Spikes (mittlere Spike-Abstand 5,5 µm), einem Quadranten mit großen Spikes (mittlerer Spike-Abstand 7,6 µm) und einem Quadranten mit einer glatten Kontrollfläche (Abb.

3.8B). HGFib, NIH/3T3, NHOst und MC3T3-E1 wurden auf die Spike-Quadrate ausgesät und für 24 h und 72 h kultiviert. Für eine Quantifizierung und Bewertung der Zellmorphologie wurden die Zellen in dieser Versuchsreihe mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt. Dies hatte auch den Vorteil, dass die Zellmorphologie nicht durch den Trocknungsprozess und das Sputtern beeinflusst wurde. Für die Quantifizierung wurden die Zellkerne mit DAPI gefärbt.

Eine Färbung mit Phalloidin-TRITC diente der Bewertung der Zellfläche und Morphologie.

Mit Hilfe einer Antikörperfärbung von pFAK konnten die fokalen Adhäsionen (FAs) visualisiert und so die Güte der Adhäsion bewertet werden. Die Aufnahme der Zellen erfolgte in 2D mit Fluoreszenzmikroskopie und in 3D mit konfokaler Laserscanningmikroskopie (CLSM). Die Aufnahme der Reflektion der Oberflächentopographie während der CLSM konnte verwendet werden, um die Interaktionen zwischen Zellen und Spike-Strukturen zu analysieren. Für die qualitative Bewertung wurde darauf geachtet, repräsentative Bereiche bzw.

Zellen auszuwählen. Für die Quantifizierung wurden die Färbungen mit Hilfe von ImageJ ausgezählt bzw. ausgemessen. Die Daten sind als Box-Whisker-Plots (5. bis 95. Perzentil) dargestellt. Um die unterschiedlichen Zelltypen vergleichen zu können, sind alle Daten als Prozent der jeweiligen Kontrolle dargestellt. Für jede Bedingung wurden 9 Proben aus mindestens 3 Versuchen analysiert. Für die 24-h-Kultur der NIH/3T3 konnten nur 8 Proben analysiert werden.

Die Aufnahmen der Fluoreszenzmikroskopie zeigten nach 24 h Kultur bei allen Zelltypen eine ähnliche Veränderung der Morphologie auf den unterschiedlichen Spike-Topographien. Auf

81 den glatten Kontroll-Flächen hatten die Zellen eine fibroblastoide Zellmorphologie mit Zellausläufern und ausgeprägten Stressfasern. An den Enden der Stressfasern waren die länglichen FAs zu erkennen (Pfeile, Abb. 3.10A, 3.11A, 3.12A, 3.13A). Auf den kleinen Spikes waren die Zellen etwas kleiner, hatten eine etwas rundere Form und die Stressfasern waren weniger deutlich ausgeprägt. Die FAs waren wesentlich kleiner und eher rund als länglich (Pfeile, Abb. 3.10B, 3.11B, 3.12B, 3.13B). Bei den mittleren Spikes waren deutliche Unterschiede zwischen den primären und den immortalisierten Zellen auszumachen. Die primären Zellen waren wesentlich länglicher bzw. spindelförmig als auf der Kontrollfläche. Die immortalisierten Zellen waren deutlich geschrumpft und hatten weniger Zellausläufer als auf der Kontrolle. Dies galt besonders für die NIH/3T3. Alle Zelltypen zeigten auf den mittleren Spikes nur noch schlecht ausgeprägte Stressfasern und wiesen kreisförmige Lücken im Actinzytoskelett auf. Die Zellkerne waren deformiert und es waren kaum FAs zu identifizieren (Abb. 3.10C, 3.11C, 3.12C, 3.13C). Die Zellmorphologie auf den großen Spikes war bei allen Zelltypen mit der auf den mittleren Spikes vergleichbar (Abb. 3.10D, 3.11D, 3.12D, 3.13D).

Die 3D-Modelle bestätigten weitgehend die Morphologie aus den Fluoreszenzaufnahmen. Auf der Kontrolle und den kleinen Spikes lagen die Zellen flach auf der glatten Oberfläche bzw.

den Spikes (Abb. 3.10E/F, 3.11E/F, 3.12E/F, 3.13E/F). Auf den mittleren und großen Spikes lagen die Zellen nicht mehr flach auf den Strukturen, sondern sanken teilweisen in diese hinein.

Die Spike-Strukturen durchbrachen dabei das Actinzytoskelett. Ausläufer der Zellen verliefen zwischen den Spikes. Dies galt besonders für die primären Zellen (Abb. 3.10G/H, 3.11G/H, 3.12G/H, 3.13G/H).

Die FAs waren bei allen Zelltypen sowohl bei der Kontrolle als auch auf den kleinen Spikes auf einer Ebene konzentriert. Durch Veränderung des Fokus in der z-Ebene konnten mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie bei den mittleren und großen Spikes nur ganz vereinzelt FAs detektiert werden. Weiterhin wurde versucht, mit Hilfe der konfokalen Laserscanningmikroskopie die FAs entlang der z-Achse zu detektieren. Auch hier waren nur sehr vereinzelt oder gar keine FAs zu detektieren. Ein zusätzliches Problem bei der konfokalen Mikroskopie war eine starke Autofluoreszenz der Spike-Strukturen.

Anhand der Bilder zeigten alle Zelltypen nach 72 h Kultur eine vergleichbare Morphologie wie nach 24 h (Abb. 3.14 bis 3.16). Um Unterschiede, wie die Zellzahl, Zellfläche oder Zellform zwischen den Zeitpunkten zu untersuchen, war eine größere Zellzahl nötig. Eine entsprechende quantitative Analyse wird im folgenden Abschnitt beschrieben.

Abb. 3.10: Morphologie von HGFib nach 24 h Kultur auf homogenen Spike-Strukturen.

Fluoreszenzaufnahmen der Zellen auf der Kontrolle (A), kleinen Spikes (B), mittleren Spikes (C) und großen Spikes (D). Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau), das Actinzytoskelett mit Phalloidin-TRITC (rot) und die FAs mit DyLight488 (grün) gefärbt. FAs sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Maßstab = 50 µm. 3D-Modelle der Zellen auf der Kontrolle (E), kleinen Spikes (F), mittleren Spikes (G) und großen Spikes (H).

Abb. 3.11: Morphologie von NIH/3T3 nach 24 h Kultur auf homogenen Spike-Strukturen.

Abb. 3.12: Morphologie von NHOst nach 24 h Kultur auf homogenen Spike-Strukturen.

Abb. 3.13: Morphologie von MC3T3-E1 nach 24 h Kultur auf homogenen Spike-Strukturen.

Abb. 3.14: Morphologie von HGFib nach 72 h Kultur auf homogenen Spike-Strukturen.

Abb. 3.15: Morphologie von NIH/3T3 nach 72 h Kultur auf homogenen Spike-Strukturen.

Abb. 3.16: Morphologie von NHOst nach 72 h Kultur auf homogenen Spike-Strukturen.

Abb. 3.17: Morphologie von MC3T3-E1 nach 72 h Kultur auf homogenen Spike-Strukturen.

90 Der erste Teil der quantitativen Auswertung beschäftigte sich mit dem Einfluss der Spike-Größe auf die unterschiedlichen Zelltypen (Abb. 3.18). Hierfür wurden die Werte der unterschiedlichen Strukturen innerhalb eines Zelltyps miteinander verglichen. Bis auf die Werte der HGFib nach 24 h war die Zellzahl bei allen Bedingungen niedriger als auf der Kontrolle.

Bei dem Vergleich der Spike-Größe war weder nach 24 h noch nach 72 h ein großer Einfluss auf die Anzahl der unterschiedlichen Zelltypen zu verzeichnen. Nur nach 24 h waren geringfügig weniger Zellen auf den kleinen Spikes als auf den mittleren und großen Spikes zu beobachten (Abb. 3.18A/B). Die Proliferation war für alle Zelltypen auf der Kontrolle am höchsten. Für die Fibroblasten war die Proliferation auf den kleinen Spikes signifikant höher als auf den mittleren und großen Spikes, dort fand kaum bzw. nur eine sehr geringe Proliferation statt (um 100 % der 24h-Werte). Dabei war die Abhängigkeit von der Spike-Größe bei den NIH/3T3 am stärksten. Für die Osteoblasten waren kaum Proliferation und keine Abhängigkeit von der Spike-Größe zu beobachten. Die Zellfläche war nach 24 h und 72 h bei allen Bedingungen im Vergleich zur Kontrolle deutlich reduziert. Auf die Zellfläche hatte die Spike-Größe einen deutlichen Einfluss. Nach 24 h hatten hier die HGFib, die NIH/3T3 und die MC3T3-E1 mit über 50 % der Kontrolle auf den kleinen Spikes eine signifikant höhere Zellfläche als auf den mittleren und großen Spikes, wo die Zellfläche deutlich unter 50 % lag (Abb. 3.18C). Nach 72 h war sogar bei allen Zelltypen eine wesentlich und signifikant höhere Zellfläche auf den kleinen Spikes als auf den mittleren und großen Spikes zu verzeichnen (Abb.

3.18D). Unterschiede zwischen den mittleren und den großen Spikes waren nicht zu sehen. Die Zellmorphologie wurde als Aspect Ratio (Quotient der beiden Zellachsen) beschrieben. Je höher der Wert war, desto länglicher waren die Zellen. In Bezug auf die Zellmorphologie zeigten vor allem die primären Zellen eine Abhängigkeit von der Spike-Größe. Diese Abhängigkeit war nach 72 h stärker ausgeprägt als nach 24 h. Sowohl die HGFib als auch die NHOst waren auf den mittleren Spikes länglicher als auf den kleinen und großen Spikes, was sich in entsprechenden Signifikanzen wiederspiegelte. Bei den immortalisierten Zellen waren lediglich die NIH/3T3 nach 24 h auf den kleinen Spikes signifikant länglicher als auf den anderen Spikes (Abb. 3.18E/F).

Abb. 3.18: Parameter der Adhäsion und Morphologie auf homogenen Spike-Strukturen (Einfluss der Größe). HGFib, NIH/3T3, NHOst und MC3T3-E1 wurden für 24 h und 72 h auf homogenen Spike-Strukturen kultiviert. Die Zellzahl wurde über eine DAPI-Färbung (A, B), die Zellfläche und Aspect Ratio über eine Phalloidin-TRITC-Färbung (C-F) bestimmt. Es sind Box-Plots der Daten von 9 Replikaten aus mindestens 3 Versuchen dargestellt. Signifikanzen wurden mit einer Two-Way-ANOVA ermittelt (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p

< 0,001).

Der zweite Teil der quantitativen Auswertung beschäftigte sich mit dem Vergleich der unterschiedlichen Zelltypen innerhalb einer Strukturierung (Abb. 3.19). Die Werte sind mit denen der Abb. 3.18 identisch, jedoch anders dargestellt. Jetzt werden die vier Zelltypen innerhalb einer Spike-Größe miteinander verglichen, um Unterschiede herauszuarbeiten. Nach 24 h Kultur wiesen die HGFib im Vergleich zur Kontrolle eine höhere Zellzahl auf als die anderen Zelltypen. Signifikant waren diese Unterschiede bei den mittleren Spikes zwischen den

92 HGFib und den NIH/3T3 sowie zwischen den HGFib und den MC3T3-E1 und bei den großen Spikes zwischen den HGFib und den NIH/3T3. Die anderen Zelltypen unterschieden sich kaum voneinander (Abb. 3.19A). Nach 72 h Kultur hatten die NIH/3T3 eine geringere Zellzahl als die anderen Zelltypen. Besonders bei den mittleren und großen Spikes waren nur noch sehr wenig NIH/3T3-Zellen vorhanden. Hier war jeweils ein signifikanter Unterschied zwischen den NIH/3T3 und den HGFib sowie zwischen den NIH/3T3 und den MC3T3-E1 zu beobachten (Abb. 3.19B). Die Proliferation der NIH/3T3 auf den kleinen Spikes war signifikant höher als die der anderen Zelltypen. Die HGFib und die NIH/3T3 wiesen hier nur eine geringe Proliferation auf, die MC3T3-E1 nahmen in ihrer Zellzahl sogar etwas ab. Auf den mittleren und großen Spikes fand kaum Proliferation statt. Unterschiede waren lediglich bei den mittleren Spikes zu beobachten, wo die HGFib und die MC3T3-E1 stärker proliferiert sind als die NIH/3T3 (Abb. 3.20B). Die Zellfläche der NIH/3T3 war auf den kleinen Spikes signifikant größer als bei den anderen Zellen. Die HGFib hatten die zweitgrößte Zellfläche, welche signifikant höher war als die der NHOst. Auf den mittleren und großen Spikes lag die Zellfläche aller Zelltypen unter 50 % der Kontrolle. Es gab hier keine signifikanten Unterschiede (Abb.

3.19C). Nach 72 h waren mehr Unterschiede in der Zellfläche zwischen den Zellen zu verzeichnen, wobei die NIH/3T3 auf jeder Struktur im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle die größte Fläche aufwiesen. Auf den kleinen Spikes betrug die Zellfläche sogar über 100 % der Kontrolle und war damit signifikant höher als die der anderen Zellen. Weiterhin war die Zellfläche der HGFib signifikant höher als die der MC3T3-E1. Alle Zelltypen hatten auf den mittleren und großen Spikes eine deutlich geringere Zellfläche als auf der Kontrolle. Bei den mittleren Spikes war die Fläche der NIH/3T3 signifikant größer als die der anderen Zelltypen, bei den großen Spikes war sie nur signifikant höher als die der MC3T3-E1 (Abb. 3.19D). In Bezug auf die Zellmorphologie waren bereits nach 24 h deutlich Unterschiede auf allen Strukturen zu erkennen. Die NIH/3T3 waren auf allen Strukturen rundlicher als die Kontrolle, alle anderen Zellen länglicher. Auf den kleinen Spikes waren die NHOst und die MC3T3-E1 signifikant länglicher als die NIH/3T3, auf den mittleren und großen Spikes waren alle Zelltypen signifikant länglicher als die NIH/3T3. Zwischen den HGFib, den NHOst und den MC3T3-E1 waren kaum Unterschiede zu beobachten (Abb. 3.19E). Nach 72 h waren jedoch mehr Abweichungen in der Zellform zwischen den Zelltypen zu verzeichnen. Die HGFib und die NHOst waren teilweise um den Faktor 2 (HGFib) und teilweise sogar um den Faktor 3 (NHOst) länglicher als die immortalisierten Zellen. Diese blieben leicht abgerundet (NIH/3T3) bzw. etwas länglicher als die Kontrolle (MC3T3-E1). Auf den kleinen Spikes waren die NHOst

93 signifikant länglicher als die NIH/3T3. Auf den mittleren und den großen Spikes waren sogar beide primären Zelltypen signifikant länglicher als die immortalisierten Zellen (Abb. 3.19F).

Eine Quantifizierung der FAs war nur auf den Kontrollen und kleinen Spikes möglich, da auf den anderen Strukturen kaum FAs zu detektieren waren. Die FA-Länge wurde in Kategorien eingeteilt (Auflösungsgrenze 0,5 µm) und die Werte der kleinen Spikes auf die der Kontrolle normiert. Es wurde sichtbar, dass für beide Zeitpunkte und alle Zelltypen der Anteil an kleinen FAs (0,5 - 1 µm) auf den kleinen Spikes deutlich größer war als auf der Kontrolle und der Anteil an größeren FAs (> 1,5 µm) deutlich abnahm. Den größten Anteil an kleinen FAs hatten dabei die MC3T3-E1 mit 334 % bei 24 h und 321 % bei 72 h. Bei den anderen Zelltypen lag dieser Anteil um die 200 % bei 24 h und zwischen 150 % und 200 % bei 72 h. Der Anteil von FAs im Bereich 1 - 1,5 µm war bei allen Zellen ähnlich wie bei der Kontrolle. Mit steigender FA-Länge nahm der Anteil im Vergleich zur Kontrolle bei allen Zelltypen in ähnlichem Maße ab, bis er bei 3 - 3,5 µm FA-Länge fast bei 0 % (24 h) bzw. bei 0 - 28 % (72 h) angekommen war (Abb.

3.19G/H).

Abb. 3.19: Parameter der Adhäsion und Morphologie auf homogenen Spike-Strukturen (Vergleich der Zelltypen). HGFib, NIH/3T3, NHOst und MC3T3-E1 wurden für 24 h und 72 h auf homogenen Spike-Strukturen kultiviert. Die Zellzahl wurde über eine DAPI-Färbung (A, B), die Zellfläche und Aspect Ratio über eine Phalloidin-TRITC-Färbung (C-F) und die FA-Länge mit einer pFAK-Antikörperfärbung bestimmt. Es sind Box-Plots (A-F) bzw. Mittelwerte und Standardabweichungen (G) der Daten von 9 Replikaten aus mindestens 3 Versuchen dargestellt. Signifikanzen wurden mit einer Two-Way-ANOVA ermittelt (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p

< 0,001).

Abb. 3.20: Proliferation auf homogenen Spike-Strukturen. HGFib, NIH/3T3, NHOst und MC3T3-E1 wurden für 24 h und 72 h auf homogenen Spike-Strukturen kultiviert, die Zellzahl über eine DAPI-Färbung und die Proliferation als % der jeweiligen 24h-Mittelwert berechnet. Die Darstellungen zeigen den Vergleich der Spike-Größen (A) sowie der Zelltypen (B). Es sind Box-Plots der Daten von 9 Replikaten aus mindestens 3 Versuchen dargestellt. Signifikanzen wurden mit einer Two-Way-ANOVA ermittelt (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

Im Dokument Eine systematische Analyse der Zytokompatibilität innovativer Implantatmaterialien (Seite 97-112)