Gradienten - Adhäsion und Proliferation

In dem ersten Versuchsteil wurden Spike-Gradienten hergestellt, welche einen fließenden Übergang von Spike-Strukturen mit einem mittleren Abstand von ca. 2 µm bis ca. 12 µm hatten.

Mit dem Abstand nahm auch die Größe bzw. Höhe der Spikes zu. Die Proben hatten Abmessungen von 5 mm x 10 mm. Für die Bewertung der Zelladhäsion und -proliferation wurden primäre Gingivafibroblasten (HGFib), immmortalisierte Fibroblasten (NIH/3T3), primäre Osteoblasten (NHOst) und immortalisierte Osteoblasten (MC3T3-E1) verwendet.

Diese Zelltypen wurden gewählt, um zellspezifische Effekte in Bezug auf die relevanten Gewebe und Unterschiede zwischen den immortalisierten Modellzellen mit den relevanteren primären Zellen zu identifizieren. Die NIH/3T3 und die MC3T3-E1 werden unter den immortalisierten und Tumor-Zellen am häufigsten für die Analyse von Implantatmaterialien und Topographien verwendet. Dies ergab eine PubMed-Recherche in der MEDLINE-Datenbank aus dem Jahr 2015 (siehe Tab. 3.1). Im „Advanced Search Builder“ wurden hierfür die Namen der gängigsten Ziellinien mit den jeweiligen Begriffen durch „AND“ kombiniert.

Die Zellen wurden für 1 d, 3 d und 7 d auf den Spike-Gradienten kultiviert. Dabei dienten eine Kulturdauer von 1 d der Bewertung der Zelladhäsion und eine Kulturdauer von 3 bzw. 7 d der Bewertung der Zellproliferation.

75

Abb. 3.8: Aufbau und Topographie der verwendeten Spike-Proben. Probenaufbau und mikroskopierte Bereiche der unterschiedlichen Spike-Proben. Ko. = Kontrolle, K = kleine Spikes, M = mittlere Spikes, G = große Spikes. Beispielhafte REM-Aufnahmen der Spike-Strukturen. Maßstab = 5 µm.

76

Tab. 3.1: Anzahl der Publikationen mit der Kombination unterschiedlicher Zelllinien und Begriffen der Implantat- bzw. Materialforschung. Die Suche wurde 2015 mit PubMed in der MEDLINE-Datenbank durchgeführt. Im „Advanced Search Builder“ wurden die Namen der Zelllinien mit den jeweiligen Begriffen kombiniert.

Fibroblasten-Zelllinien „implants“ „dental implants“ „topography“

MRC-5 4 1 1

Da unterschiedliche Bereiche der Probe unabhängig voneinander bewertet werden mussten, konnte kein quantitativer Protein-basierter Test wie bei der Analyse der NP angewandt werden.

Andererseits war hier die Interaktion der Zellen mit der Oberflächentopographie von besonderem Interesse. Daher wurde eine REM-Analyse der unterschiedlichen Bereiche vorgenommen. Es wurden REM-Aufnahmen in 3 x 5 Bereichen der Proben gemacht (siehe Abb. 3.8). Die Zelldichte wurde anhand der REM-Bilder qualitativ bewertet und in Kategorien (0 – 10) eingeteilt, wobei 0 die vollständige Abwesenheit von adhärenten Zellen darstellt und 10 der Zelldichte auf der glatten Kontrolle nach 7 Tagen entspricht. Drei bewertete Kategorien eines Spike-Abstandes wurden gemittelt (Abb. 3.8). Um die Proliferation der unterschiedlichen Zelltypen vergleichen zu können, wurden die Mittelwert auf die jeweilige glatte 24-h-Kontrolle (=1) normiert. Die Ergebnisse wurden als Zelldichte in Abhängigkeit der Spike-Abstände aufgetragen. Hierfür wurden jeweils 30 bis 40 Spike-Abstände der mittleren Aufnahme eines Spike-Bereiches gemessen, gemittelt und dem Mittelwert der Zelldichte des entsprechenden Bereiches zugeordnet. Für jeden Zelltyp wurde eine lineare Regressionslinie dargestellt. Für jede Bedingung wurden 9 Proben aus mindestens 3 Versuchen analysiert. Da die Spike-Abstände zwischen den Proben erheblich variierten, konnten diese nicht in den 5 aufgenommen Bereichen oder anderen zusammengefassten Bereichen als kategoriale Variable betrachtet werden, sondern mussten als stetige Variable angenommen werden. Daraus folgt eine Darstellung, in der die Spike-Abstände auf der X-Achse stetig in µm aufgetragen wurden.

77 Bereits nach einem Tag Kultur auf den Spike-Gradienten war für die HGFib, NHOst und NIH/3T3 ein Trend im Bewuchs der Strukturen zu beobachten. Mit steigendem Spike-Abstand nahm hier die Zelldichte ab (Abb. 3.9A). Bis zu einem Spike-Abstand von ca. 5 µm lag die Zelldichte noch zwischen 1 und 0,5. Mit steigendem Spike-Abstand waren immer weniger Zellen auf den Strukturen vorhanden. Dies wurde besonders bei den HGFib und den NHOst deutlich. Es war also eine bessere Zelladhäsion auf den kleinen als auf den großen Spikes festzustellen. Die Zelldichte der MC3T3-E1 lag zwischen 1 und 0,5, war jedoch nicht Abstand-abhängig. Die NIH/3T3 wiesen mit unter 0,5 eine deutlich geringere Zelldichte als die anderen Zelltypen auf, was für eine schlechte Adhäsion dieser Zellen spricht. Nach 3 Tagen Kultur zeigten die HGFib auf den kleineren Spikes eine wesentlich stärkere Proliferation als auf den größeren Spikes. Dabei lag das Maximum der Zelldichte bei 2 (Spike-Abstand 4,2 µm) und das Minimum bei 0 (Spike-Abstand 11,5 µm). Für alle anderen Zelltypen war keine Proliferation zu beobachten. Die NHOst wiesen mit steigendem Spike-Abstand eine leicht abnehmenden Zelldichte auf. Eine Abhängigkeit vom Spike-Abstand war für die NIH/3T3 und die MC3T3-E1 nicht zu beobachten. Nach 7 Tagen Zellkultur war bei allen Zelltypen eine deutliche Abhängigkeit der Zelldichte vom Spike-Abstand zu verzeichnen. Bis auf die NHOst waren alle Zelltypen stark proliferiert; und zwar umso stärker je geringer der Spike-Abstand ist. Die primären Osteoblasten zeigten lediglich eine maximale Zelldichte von 1,1 und eine minimale Zelldichte von 0,2. Bei den HGFib hingegen war mit einer Zelldichte von 2,8 bei einem Abstand von 3,2 µm und 0,67 bei 6,2 µm eine deutliche Abnahme mit Erhöhung der Spike-Abstände zu beobachten. Obwohl das abgedeckte Spektrum der Spike-Abstände für die NIH/3T3 und MC3T3-E1 wesentlich geringer ist als bei den primären Zellen, waren hier die größten Unterschiede in der Zelldichte zu beobachten. Die maximale Zelldichte betrug hier 3 bei 2,3 µm (NIH/3T3) bzw. 3,3 bei 2,9 µm (MC3T3-E1) und die minimale Zelldichte 0,3 bei 2,7 µm und 5,5 µm (NIH/3T3) bzw. 0,8 bei 4,6 µm (MC3T3-E1). Anhand der linearen Regression wurde sichtbar, dass die immortalisierten Zellen offenbar eine stärkere Abhängigkeit in Bezug auf die Spike-Abstände aufwiesen.

Auf Grund ihrer wesentlich geringeren Größe ist für Bakterien grundsätzliche eine andere Reaktion auf Mikro- oder Nanotopographien zu erwarten als für eukaryotische Zellen. Für die Untersuchung möglicher antibakterielle Effekte bzw. Beeinflussung der bakteriellen Adhäsion wurden die Spike-Gradienten insgesamt 5 h mit Kulturen von S. aureus kultiviert, mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt und mikroskopiert. Wie bei den Zellkulturen wurden 3 x 5 Bereiche mikroskopiert (siehe Abb. 3.8A). Die bakterielle Oberflächenbedeckung wurde als

78 Funktion der Spike-Abstände dargestellt. Je 6 Abstände wurden für jede Aufnahme gemessen und gemittelt. Es wurden 3 Versuche mit je 3 Proben durchgeführt.

Es bestanden große Unterschiede zwischen den Messwerten. Diese reichten von 43,1 % bis 221,1 % der Kontrolle und wiesen lediglich einen leichten Trend auf. Anhand der linearen Regression wurde eine geringfügig höhere Oberflächenbedeckung mit steigendem Spike-Abstand sichtbar (Abb. 3.9B). Fasste man die Messwerte in Kategorien für die Spike-Abstände zusammen, wurde dieser Trend mit Ausnahme der Kategorie 2 - 4 µm deutlicher. Der niedrigste Mittelwert lag bei 98,6 % der Kontrolle (Kategorie 4 - 6 µm), der höchste Wert lag bei 123,3

% (Kategorie 10 - 12 µm). Ein statistisch signifikanter Unterschied war jedoch nur zwischen der Kategorie 4 - 6 µm und 8 - 10 µm festzustellen (Abb. 3.9C).

79

80

3.3.2. Homogene Strukturen - Adhäsion und