4 Ergebnisse
4.1 Charakterisierung des G1/S‐Checkpoints in der lebenden Zelle
4.1.3 Zeitliche Regulation und Sensitivität des G1/S‐Checkpoints mittels LCI
System bei 400‐facher Vergrößerung abgescannt. GFP‐53BP1‐Foci, sowie 53BP1‐ und γ‐H2AX‐Foci wurden nochmals über Immunfluoreszenz‐Mikroskopie bei 630‐facher Vergrößerung in G1‐Phase‐
Zellen gezählt.
In beiden Fällen, sowohl bei der Auszählung am Bildschirm als auch am Mikroskop, nahm die Focizahl über die Zeit nach Bestrahlung ab. Nach einer Reparaturzeit von 2 h lag der Wert bei 18‐20 Foci, wobei GFP‐53BP1‐Foci am niedrigsten, 53BP1‐Foci am höchsten lagen. Diese Tendenz war auch 4 h nach Bestrahlung noch vorhanden, die Fociwerte bewegten sich zwischen 13 und 15. Nach 8 h Reparaturzeit waren noch 5‐6 Foci vorhanden, GFP‐53BP1 und 53BP1 zeigten fast denselben Wert. Die durchschnittliche Anzahl der Foci von am Bildschirm ausgewerteten Zellen war im Ver‐
gleich zu den am Mikroskop ausgewerteten deutlich geringer. 2 h nach Bestrahlung waren noch 7‐
10 Foci vorhanden, 4 h nach Bestrahlung zwischen 5 und 7. Nach 8 h Reparaturzeit lag die Anzahl der Foci bei 3‐4. Die γ‐H2AX‐ und 53BP1‐Foci lagen zu allen Zeitpunkten am höchsten. Am niedrigs‐
ten lagen die GFP‐53BP1‐Foci. Die Anzahl der am Bildschirm ausgezählten DSBs betrug nur etwa die Hälfte der am Mikroskop ausgezählten. In der Erkennung der Foci bot die Zählung am Mikroskop deutliche Vorteile. Die bessere Auflösung im Vergleich zum Bildschirm und das Durchfokussieren durch den Zellkern spielen eine entscheidende Rolle in der besseren Erkennung der Foci. Bei der mikroskopischen Auswertung fiel auf, dass die GFP‐53BP1‐Foci bei den jeweiligen Reparaturpunk‐
ten am niedrigsten im Vergleich zu 53BP1‐ und γ‐H2AX‐Foci lagen. Der Grund hierfür könnte darin liegen, dass die fixierten GFP‐53BP1‐Foci relativ schwach zu den über Immunfluoreszenz gefärbten 53BP1‐ und γ‐H2AX‐Foci fluoreszierten und so nicht alle erkannt und gezählt werden konnten. Bei der Auswertung am Bildschirm hingegen zeigte sich die Tendenz, dass die γ‐H2AX‐Foci stets höher als GFP‐53BP1 und 53BP1 lagen. Diese waren im Vergleich heller, und somit waren auch schwach gefärbte DSBs viel deutlicher zu erkennen.
Bei allen ausgewerteten Zeitpunkten lag die Anzahl der am Mikroskop ausgewerteten Foci in der G1‐Phase, sei es GFP‐53BP1, 53BP1 oder γ‐H2AX, doppelt so hoch wie bei den am Bildschirm aus‐
gewerteten Foci.
Es konnte gezeigt werden, dass bei Anwendung der Methode des LCI keine Beeinträchtigungen von Zellen sowohl durch die Aufnahmebedingungen als auch durch die Transfektion mit GFP‐53BP1 und RFP‐LigaseI entstanden. Die Teilungsrate der Zellen und ihre Reparaturkapazität wichen nicht von denen unbehandelter Zellen ab, und durch die Aufnahmebedingungen wurden keine zusätzlichen DSBs induziert. Der Marker GFP‐53BP1 zur Identifizierung der DSBs kolokalisiert mit etablierten Doppelstrangbruch‐Markern wie γ‐H2AX und 53BP1, allerdings wurde nur die Hälfte an GFP‐53BP1‐
Foci am Bildschirm im Vergleich zur Auszählung am Mikroskop detektiert. Dieser Umstand muss bei zukünftigen Experimenten und Aussagen bezüglich der DSB‐Anzahl berücksichtigt werden.
Seite 87 den. Darüber hinaus sollte die Bestimmung der Sensitivität des Checkpoints in Bezug auf DSBs am G1/S‐Übergang erfolgen. Dies wurde durch die gleichzeitige Transfektion von 82‐6hTert‐Zellen mit RFP‐LigaseI zur Markierung des S‐Phase‐Eintritts der Zellen und GFP‐53BP1 zur Quantifizierung von DNA‐DSBs erreicht. Mittels beider Marker war es möglich, in einzelnen, über mehrere Stunden ver‐
folgten Zellen die Anzahl der DSBs zum Zeitpunkt des Übertritts von der G1‐Phase zur S‐Phase zu bestimmen (Abb. 24).
Abb. 24: 82‐6hTert‐Zelle transfiziert mit RFP‐LigaseI und GFP‐53BP1 im Übertritt von G1‐Phase in S‐Phase
82‐6hTert‐Zellen wurden mit RFP‐LigaseI und GFP‐53BP1 transient transfiziert. Durch das Konstrukt RFP‐LigaseI wurde der Übertritt von der G1‐Phase in die S‐Phase durch Ausbildung eines spezifischen Musters angezeigt, GFP‐53BP1‐Foci mach‐
ten die Anzahl der Doppelstrangbrüche nach Anregung des Fluorochroms mit Auflicht sichtbar. 1 h nach Bestrahlung der Zellen mit 1 Gy waren in der G1‐Phase GFP‐53BP1‐Foci induziert worden, welche über den dargestellten Zeitraum von 5 h repariert wurden. Zwischen Stunde 2 und 3 nach Bestrahlung progressierte die Zelle mit GFP‐3BP1 Foci in die S‐Phase.
Zur Untersuchung des Einsetzens des G1/S‐Checkpoints in 82‐6hTert‐Zellen nach Bestrahlung mit 1 Gy wurden die mit RFP‐LigaseI und GFP‐53BP1 transfizierten 82‐6hTert‐Zellen in zwei Kanäle eines µ‐slide VI ausgesät und 48 h im Brutschrank inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die exponen‐
tiell wachsenden Zellen eines Kanals mit 1 Gy bestrahlt, der zweite Kanal blieb unbestrahlt und diente als Kontrolle. Die Zellen wurden anschließend weiter im LCI‐System inkubiert. Dabei wurden stündlich Aufnahmen über einen Zeitraum von 30 h in 400‐facher Vergrößerung sowohl der unbestrahlten als auch der bestrahlten Zellen im Auflicht‐ und Durchlichtmodus angefertigt. Um die zeitliche Regulation des G1/S‐Checkpoints nach IR zu untersuchen, wurden in 44 unabhängigen Experimenten bestrahlte und unbestrahlte Zellen ausgewertet, die sich noch nicht geteilt hatten und im Laufe des Aufnahmezeitraums in die S‐Phase gelangten. Die Anzahl der Zellen, die in die S‐
Phase gelangten, wurde akkumuliert (Abb. 25).
Abb. 25: Progression von Zellen aus der G1‐Phase in die S‐
Phase im LCI‐System
RFP‐LigaseI und GFP‐53BP1 transfizierte 82‐6hTert‐Zellen wurden in die Kanäle des µ‐slides VI ausgesät und 2 Tage im Brutschrank inkubiert. Die exponentiell wachsenden Zellen wurden vor der Aufnahme im LCI‐System mit 1 Gy bestrahlt oder unbestrahlt belassen und anschließend im LCI‐System mit DL und AL (TxR‐Filter, Belichtungszeit 350 ms) stündlich über 30 h aufgenommen. Die von der G1‐Phase zur S‐Phase übertretenden einzelnen Zellen wurden aufgrund des sich ausbildenden LigaseI‐Musters identifiziert, die Anzahl dieser Zellen akkumuliert und gegen die Zeit nach Bestrahlung aufgetragen.
Die Anzahl der unbestrahlten, in die S‐Phase eintretenden Zellen nahm über einen Zeitraum von 18 h gleichmäßig zu. Bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes nahm die Rate der in die S‐Phase eintretenden Zellen ab, was auf eine Depletion der G1‐Phase zurückzuführen war. Nach Bestrahlung der Zellen mit 1 Gy konnte während der ersten 5 h nach Bestrahlung kein Unterschied in der Rate der von der G1‐Phase in die S‐Phase eintretenden Zellen zur Kontrolle festgestellt werden. Ab die‐
sem Zeitpunkt bis zum Ende des Beobachtungszeitraums gelangten allerdings nur noch wenige Zel‐
len in die S‐Phase, was auf ein Einsetzen des G1/S‐Checkpoints zurückzuführen sein könnte. Somit konnte in diesem Ansatz in lebenden Zellen gezeigt werden, dass der G1/S‐Checkpoint etwa 5 h nach Bestrahlung einsetzt.
Die Doppeltransfektion der Zellen ermöglichte nun, in denselben Zellen den Übergang von der G1‐
Phase in die S‐Phase zu bestimmen und gleichzeitig das DSB‐Level zu messen. In 91 mit 1 Gy be‐
strahlten Zellen und 150 unbestrahlten Zellen wurden GFP‐53BP1‐Foci über die gesamte Dauer des Bebachtungzeitraums quantifiziert. Aufgrund der geringen Transfektionseffizienz in den primären Fibroblasten wurden 44 unabhängige Versuche durchgeführt, welche in den folgenden Graphen zusammengefasst wurden (Abb. 26).
Die Reparaturkinetiken bestrahlter Zellen zeigten eine Abnahme der Focizahlen, eine Reparatur von DSBs fand somit statt. Allerdings war eine große Streuung zwischen den einzelnen Zellen zu erken‐
nen, weshalb die in der G1‐Phase bestrahlten Zellen relativ zu ihrem Eintritt in die S‐Phase gruppiert wurden. Auf diese Weise erhielt man eine Aussage darüber, mit wie vielen DSBs Zellen in die S‐
Phase gelangten, bevor der Checkpoint aktiviert wurde bzw. auch zu späteren Zeiten, wenn er voll eingesetzt hatte.
0 5 10 15 20 25 30
0 40 80 120 160 200 240
Anzahl S-Phase-Zellen (akkumuliert)
Zeit nach Bestrahlung [h]
0 Gy 1 Gy
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A B
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2
0 5 10 15 20 25
GFP-53BP1-Foci pro Zelle
Zeit, relativ zum Eintritt in die S-Phase [h]
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2
0 5 10 15 20 25
GFP-53BP1-Foci pro Zelle
Zeit, relativ zum Eintritt in S-Phase [h]
9,1 h - 12 h 6,1 h - 9 h 3,1 h - 6 h 0 h - 3 h 9,1 h - 12 h 6,1 h - 9 h 3,1 h - 6 h 0 h - 3 h
Abb. 26: Entwicklung der DSBs nach Bestrahlung mit 1 Gy in der G1‐Phase und beim Übergang zur S‐Phase
(A) 82‐6hTert‐Zellen wurden über Elektroporation mit den Konstrukten GFP‐53BP1 zur Untersuchung der DNA‐
Doppelstrangbrüche und RFP‐LigaseI zur Identifikation der Zellzyklus‐Phase transfiziert und in die Kanäle eines µ‐slide VI ausgesät. In exponentieller Wachstumsphase wurden die Zellen mit 1 Gy bestrahlt bzw. unbestrahlt belassen und über einen Zeitraum von 24 h im Live Cell Imaging‐System mit DL und AL (TxR‐Filter, GFP‐Filter, Belichtungszeit 350 ms, 1 Ebene bzw. 3 Ebenen mit 900 µm) in 400‐facher Vergrößerung aufgenommen. In den aufgenommenen Bildern wurden anschlie‐
ßend am Bildschirm die auftretenden GFP‐53BP1‐Foci in G1‐Phase‐Zellen ausgezählt. Der 0 h‐Punkt auf der Abszisse zeigt den Zeitpunkt des Eintritts der Zellen in die S‐Phase an, vor diesem Punkt befinden sich die Zellen in der G1‐Phase.
(B) Die Zellen sind gruppiert dargestellt. In der bestrahlten, als auch in der unbestrahlten Probe zeigen die Gruppen die Population an Zellen, die sich zum Zeitpunkt der Bestrahlung zwischen 0 h und 3 h, zwischen 3,1 h und 6 h, zwischen 6,1 h und 9 h und zwischen 9,1 h und 12 h vor der S‐Phase befanden. Die Fehlerbalken geben den Standardfehler über die ausgewerteten Zellen an.
In der unbestrahlten Probe lag die Anzahl der GFP‐53BP1‐Foci in allen Gruppen zwischen 0,7 und 1,5 DSBs. Die mit 1 Gy bestrahlten Zellen zeigten in allen dargestellten Gruppen eine Induktion zwi‐
schen 12 und 17 Foci. Zum Zeitpunkt des S‐Phase‐Eintritts zeigte die Gruppe, welche 9 h bis 12 h vor S‐Phase‐Eintritt bestrahlt wurde, noch 2,5 unreparierte DSBs, die zwischen 6 h bis 9 h bestrahlte Population noch 3,3 unreparierte DSBs. Die Gruppe, welche zwischen 4 h bis 6 h und 0 h bis 3 h bestrahlt wurde, zeigte noch 4,4, bzw. 8,2 unreparierte DSBs. Somit besaßen Zellen, welche zu ei‐
nem späteren Zeitpunkt nach Bestrahlung in die S‐Phase eintraten, zum Zeitpunkt des S‐Phase‐
Eintritts niedrigere Foci‐Werte, da die DSBs in der G1‐Phase repariert werden konnten. Die Zellen traten zu allen Zeitpunkten mit einem erhöhten Focilevel in die S‐Phase ein (Abb. 26). Da der G1/S‐
Checkpoint nur langsam einsetzt, gelangten viele Zellen besonders in den ersten 6 h nach Bestrah‐
lung mit einer erheblichen Anzahl an DSBs in die S‐Phase (Abb. 27). Zudem wurden auch zu späte‐
ren Zeitpunkten vereinzelt Zellen mit einem erhöhten Focilevel gefunden.
Zusammengefasst konnte in diesen Experimenten in lebenden Zellen gezeigt werden, dass der G1/S‐Checkpoint nur langsam einsetzt. Folglich treten in den ersten 6 h viele Zellen mit einer hohen Anzahl an DSBs in die S‐Phase ein.
0 Gy
1 Gy
G1‐Phase S‐Phase G1‐Phase S‐Phase
Abb. 27: Anzahl von GFP‐53BP1‐Foci bei S‐Phase‐
Eintritt der Zellen
82‐6hTert‐Zellen wurden mit GFP‐53BP1 und RFP‐
LigaseI transfiziert und über 24 h im LCI‐System auf‐
genommen. Aufgetragen wurde die Anzahl der in den Zellen gezählten GFP‐53BP1‐Foci im ersten Bild der S‐Phase. Gleichzeitig war zu erkennen, wann die Zellen nach Bestrahlung in die S‐Phase eintraten. Die unterschiedlich großen Blasen in der Darstellung geben an, wie viele Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt die gleiche Zahl an GFP‐53BP1‐Foci auf‐
wiesen.