Reparaturmessungen im LCI‐System mittels GFP‐53BP1‐Foci

Um sicherzustellen, dass die während eines LCI‐Experiments gewählten Aufnahmebedingungen  keine zusätzlichen Foci induzieren oder Einfluss auf das Reparaturvermögen der Zellen haben, wur‐

de eine vollständige Reparaturkinetik mit GFP‐53BP1‐Foci ausgewertet. Die GFP‐53BP1‐Foci wurden 

0 2 4 6 8

0 5 10 15 20 25 30 35

Foci pro Zelle

Zeit nach Bestrahlung [h]

γ - H2AX untransfiziert 53BP1 untransfiziert

γ - H2AX transfiziert

hierfür in Bildern von G1‐Phase‐Zellen gezählt, die über das LCI‐System aufgenommen wurden (Abb. 

22 A). Anschließend sollte die Reparaturkinetik der G1‐Zellen der LCI‐Daten noch mit der Reparatur‐

kinetik von γ‐H2AX in G1‐Zellen der Immunfluoreszenz‐Mikroskopie verglichen werden, um die Sen‐

sitivität der Detektion und Auswertung der LCI‐Foci im Vergleich zu Foci der Immunfluoreszenz‐

Mikroskopie einschätzen zu können.  

Abb. 22: DSB‐Reparaturmessungen mittels LCI und Immunfluoreszenz‐Mikroskopie in 82‐6hTert‐Zellen nach IR       (A und C) Exponentiell wachsende 82‐6hTert‐Zellen wurden mit RFP‐LigaseI und GFP‐53BP1 transient transfiziert, 24 h  später in einem µ‐slide VI ausgesät, nach 48 h mit 1 Gy bestrahlt und das GFP‐53BP1‐Signal (GFP‐Filter, 350 ms, 3 Ebenen  mit 900 µm), sowie das RFP‐LigaseI‐Signal (TxR‐Filter, 350 ms, 1 Ebene) stündlich in 400‐facher Vergrößerung aufgenom‐

men (Maßstab = 10 µm). 

Zur Erstellung der Reparaturkinetik in lebenden Zellen wurde die Anzahl von GFP‐53BP1‐Foci in einer Gruppe von 82‐

6hTert‐Zellen, welche 6 bis 9 h vor Eintritt in die S‐Phase mit 1 Gy bestrahlt wurden, am Bildschirm ausgewertet. Über  einen Zeitraum von 8 h wurden stündlich DSBs in denselben Zellen gezählt, da jede Stunde festgelegte Positionen aufge‐

nommen wurden. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler zwischen den ausgewerteten Zellen dar. 

(B) 82‐6hTert‐Zellen wurden mit GFP‐53BP1 transfiziert, 24 h später in ein µ‐slide VI ausgesät und nach 48 h mit 1 Gy  bestrahlt. 2 h nach Bestrahlung wurde das GFP‐53BP1‐Signal in lebenden Zellen an festgelegten Positionen auf dem µ‐

slide VI im LCI‐System in 400‐facher Vergrößerung mit einer Belichtungszeit von 350 ms und 3 Ebenen (900 µm) aufge‐

nommen, die Zellen danach sofort fixiert und gegen γ‐H2AX gefärbt. Die gleichen Positionen wurden nochmals einges‐

cannt und dabei das γ‐H2AX‐Signal über den TxR‐Filter unter den gleichen Bedingungen wie zuvor GFP‐53BP1 aufgenom‐

men. Die Kolokalisation am Bildschirm zwischen nativem GFP‐53BP1, fixiertem (f) GFP‐53BP1 und γ‐H2AX ist gegeben,  allerdings sind die γ‐H2AX‐Foci etwas deutlicher erkennbar als GFP‐53BP1‐Foci (Maßstab = 10 µm). 

(D) Zur Erstellung der Reparaturkinetik wurden 82‐6hTert‐Zellen auf Deckgläschen ausgesät, nach 48 h mit 1 Gy bestrahlt,  nach 15 min, 2 h, 4 h, 6 h und 8 h fixiert und gegen γ‐H2AX gefärbt. Die Foci wurden bei 630‐facher Vergrößerung am  Mikroskop ausgezählt, die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung aus 2 unabhängigen Experimenten. Zum  direkten Vergleich wurde in diesem Graphen zusätzlich die Reparaturkinetik mittels GFP‐53BP1‐Foci in lebenden Zellen (C)  dargestellt. 

Seite 85  Die Auswertung der GFP‐53BP1‐Foci in G1‐Phase‐Zellen im LCI‐System zeigte nach Bestrahlung mit  1 Gy einen Induktionswert von 12 Foci, gefolgt von einer schnellen Abnahme der DSBs innerhalb  von 4 h auf 6 Foci. Ab 6 h nach Bestrahlung erfolgte die Abnahme der DSBs langsamer, so dass nach  8 h noch 4 Foci detektierbar waren (Abb. 22 C).  

Der Vergleich der Werte der mittels LCI aufgenommenen und am Bildschirm ausgewerteten GFP‐

53BP1‐Foci zur γ‐H2AX‐Kinetik in fixierten und am Mikroskop ausgewerteten Zellen (Kapitel 4.1.1.6)  zeigte ein Verhältnis von 1:2. Für jeden vergleichbaren Reparaturzeitpunkt wurden am Bildschirm  unter LCI‐Bedingungen jeweils halb so viele GFP‐53BP1‐Foci gezählt wie bei der Auswertung der γ‐

H2AX‐Foci am Mikroskop (Abb. 22 B, D).  

Beim Vergleich von GFP‐53BP1 in lebenden Zellen, am Bildschirm ausgewertet und γ‐H2AX in fixier‐

ten Zellen, am Mikroskop ausgewertet, war ein gleicher Verlauf der Reparaturkinetiken erkennbar. 

Die Aufnahmebedingungen induzierten keine zusätzlichen Foci und GFP‐53BP1 eignet sich zur Repa‐

raturmessung. Allerdings muss beachtet werden, dass das tatsächliche Level der GFP‐53BP1‐Foci  stets um die Hälfte unterschätzt wird. 

Da sich bei der Auswertung von Foci am Bildschirm und am Mikroskop ein Verhältnis von 1:2 ergab,  sollte noch einmal systematisch überprüft werden, ob die Halbierung der Focizahl tatsächlich nur  durch die Auswertung am Bildschirm zustande kam. Zur Überprüfung wurden Versuche zur Auswer‐

tung von GFP‐53BP1, 53BP1 und γ‐H2AX‐Foci an Mikroskop und Bildschirm durchgeführt (Abb. 23).  

2 h 4 h 8 h

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Foci pro Zelle

Zeit nach Bestrahlung

GFP-53BP1 (Bildschirm) 53BP1 (Bildschirm)

γ-H2AX (Bildschirm) GFP-53BP1 (Mikroskop) 53BP1 (Mikroskop)

γ- H2AX (Mikroskop)

Abb. 23: Vergleich zwischen Auszählung der DSBs am Mikroskop und am Bildschirm 

82‐6hTert‐Zellen wurden über Elektroporation mit GFP‐53BP1 und RFP‐LigaseI transfiziert und 24 h nach Transfektion im  µ‐slide VI ausgesät. 48 h nach Aussaat wurden die transfizierten Zellen mit 1 Gy bestrahlt und in den Inkubator des LCI‐

Systems gestellt. Nach 2 h, 4 h und 8 h Reparaturzeit wurden die Zellen einmal mit Durchlicht und Auflicht (GFP‐Filter)  abgescannt, um die GFP‐53BP1‐Foci aufzunehmen und die jeweiligen Zeitpunkte sofort fixiert. Nach Fixierung erfolgte die  Färbung entweder gegen γ‐H2AX oder 53BP1 und die gleichen Positionen wie vor der Fixierung wurden nochmals  abgescannt. So konnten GFP‐53BP1‐Foci, γ‐H2AX‐ oder 53BP1‐Foci später über eine Software (ACDsee) am Bildschirm in  G1‐Phase‐Zellen ausgewertet werden. Zusätzlich wurden die GFP‐53BP1‐Foci, γ‐H2AX‐ und 53BP1‐Foci der fixierten G1‐

Zellen am Mikroskop ausgewertet und mit den Foci‐Werten der Bildschirm‐Auswertung verglichen. Die Aufnahmen mit  dem LCI‐System erfolgten in 400‐facher Vergrößerung, am Mikroskop wurden die Foci der fixierten Zellen bei 630‐facher  Vergrößerung ausgezählt. 

Nach Bestrahlung mit 1 Gy wurden zu den Zeitpunkten 2 h, 4 h und 8 h GFP‐53BP1‐Foci in lebenden  Zellen, 53BP1 und γ‐H2AX nach Fixierung und Färbung zu den entsprechenden Zeitpunkten im LCI‐

System bei 400‐facher Vergrößerung abgescannt. GFP‐53BP1‐Foci, sowie 53BP1‐ und γ‐H2AX‐Foci  wurden nochmals über Immunfluoreszenz‐Mikroskopie bei 630‐facher Vergrößerung in G1‐Phase‐

Zellen gezählt. 

In beiden Fällen, sowohl bei der Auszählung am Bildschirm als auch am Mikroskop, nahm die  Focizahl über die Zeit nach Bestrahlung ab. Nach einer Reparaturzeit von 2 h lag der Wert bei 18‐20  Foci, wobei GFP‐53BP1‐Foci am niedrigsten, 53BP1‐Foci am höchsten lagen. Diese Tendenz war  auch 4 h nach Bestrahlung noch vorhanden, die Fociwerte bewegten sich zwischen 13 und 15. Nach  8 h Reparaturzeit waren noch 5‐6 Foci vorhanden, GFP‐53BP1 und 53BP1 zeigten fast denselben  Wert. Die durchschnittliche Anzahl der Foci von am Bildschirm ausgewerteten Zellen war im Ver‐

gleich zu den am Mikroskop ausgewerteten deutlich geringer. 2 h nach Bestrahlung waren noch 7‐

10 Foci vorhanden, 4 h nach Bestrahlung zwischen 5 und 7. Nach 8 h Reparaturzeit lag die Anzahl  der Foci bei 3‐4. Die γ‐H2AX‐ und 53BP1‐Foci lagen zu allen Zeitpunkten am höchsten. Am niedrigs‐

ten lagen die GFP‐53BP1‐Foci. Die Anzahl der am Bildschirm ausgezählten DSBs betrug nur etwa die  Hälfte der am Mikroskop ausgezählten. In der Erkennung der Foci bot die Zählung am Mikroskop  deutliche Vorteile. Die bessere Auflösung im Vergleich zum Bildschirm und das Durchfokussieren  durch den Zellkern spielen eine entscheidende Rolle in der besseren Erkennung der Foci. Bei der  mikroskopischen Auswertung fiel auf, dass die GFP‐53BP1‐Foci bei den jeweiligen Reparaturpunk‐

ten am niedrigsten im Vergleich zu 53BP1‐ und γ‐H2AX‐Foci lagen. Der Grund hierfür könnte darin  liegen, dass die fixierten GFP‐53BP1‐Foci relativ schwach zu den über Immunfluoreszenz gefärbten  53BP1‐ und γ‐H2AX‐Foci fluoreszierten und so nicht alle erkannt und gezählt werden konnten. Bei  der Auswertung am Bildschirm hingegen zeigte sich die Tendenz, dass die γ‐H2AX‐Foci stets höher  als GFP‐53BP1 und 53BP1 lagen. Diese waren im Vergleich heller, und somit waren auch schwach  gefärbte DSBs viel deutlicher zu erkennen.  

Bei allen ausgewerteten Zeitpunkten lag die Anzahl der am Mikroskop ausgewerteten Foci in der  G1‐Phase, sei es GFP‐53BP1, 53BP1 oder γ‐H2AX, doppelt so hoch wie bei den am Bildschirm aus‐

gewerteten Foci.  

Es konnte gezeigt werden, dass bei Anwendung der Methode des LCI keine Beeinträchtigungen von  Zellen sowohl durch die Aufnahmebedingungen als auch durch die Transfektion mit GFP‐53BP1 und  RFP‐LigaseI entstanden. Die Teilungsrate der Zellen und ihre Reparaturkapazität wichen nicht von  denen unbehandelter Zellen ab, und durch die Aufnahmebedingungen wurden keine zusätzlichen  DSBs induziert. Der Marker GFP‐53BP1 zur Identifizierung der DSBs kolokalisiert mit etablierten  Doppelstrangbruch‐Markern wie γ‐H2AX und 53BP1, allerdings wurde nur die Hälfte an GFP‐53BP1‐

Foci am Bildschirm im Vergleich zur Auszählung am Mikroskop detektiert. Dieser Umstand muss bei  zukünftigen Experimenten und Aussagen bezüglich der DSB‐Anzahl berücksichtigt werden.