Aufbau eines LCI‐Systems

Da es sich in Versuchen mit dem LCI‐System stets um lebende Zellen handelt, die auch während des  Versuchs optimal versorgt sein müssen, ist die genaue Überwachung der Umgebungsbedingungen  bei der Anwendung dieser Methode ein kritischer Faktor. Daher mussten zunächst die Inkubations‐

bedingungen für die mikroskopischen Aufnahmen optimiert werden. Die Etablierung der Technik  und die dazu notwendigen Kontrollexperimente wurden gemeinsam mit Dipl.‐Biol. Eik Schumann  durchgeführt. 

Um die Temperatur konstant zu halten, wurde ein geschlossener Inkubator der Firma Pecon (Inku‐

bator XL‐3) auf das inverse Mikroskop Axiovert 200M (Zeiss) gesetzt (Abb. 15). Mittels einer Heiz‐

einheit wurde das Innere dieser Kammer auf 37°C erwärmt und die Temperatur geregelt. 

Zur optimalen CO₂‐Versorgung der Zellen über eine CO₂‐Einheit wurde zusätzlich eine kleine CO₂‐ Kammer angefertigt, welche passgenau auf den Objektträger‐Tisch aufgesetzt werden konnte. Das  auf die Zellen strömende CO₂ wurde außerdem durch eine Waschflasche mit sterilem Wasser gelei‐

tet und angefeuchtet, um ein Austrocknen der Zellen bzw. die Abnahme des Mediums in den Aus‐

saat‐Gefäßen zu verhindern.  

Bei der Wahl der Aussaatgefäße wurde darauf geachtet, dass sie über eine optische, dünne Oberflä‐

che zur optimalen Aufnahme der Bilder verfügen. Weiterhin sollten Gas‐ und Wärmeaustausch ge‐

währleistet und die Zellen in diesen Gefäßen zu fixieren sein. Die beste Lösung stellten in diesem  Fall Aussaatgefäße der Firma ibidi, das µ‐slide VI, dar. Weil das Volumen der µ‐slides VI relativ ge‐

ring ist, wurde als zusätzlicher Schutz gegen Austrocknung ein Tropfen Silikonöl auf die Oberfläche  des Mediums aufgebracht. 

Da die Aussaatgefäße für die Zellen zur Verbesserung der optischen Eigenschaften sehr dünnwandig  sind, unterlagen die Zellen schnell Temperaturschwankungen, sobald sie aus dem Inkubator ge‐

nommen wurden. Da sie jedoch zur Bestrahlung an die Röntgenröhre gebracht wurden und wäh‐

rend der Bestrahlung in ihr verbleiben mussten, wurde eine Styroporbox mit einer Bleimaske ange‐

fertigt, die stets auf 37°C temperiert war. Auf dieser Bleimaske mit entsprechenden Aussparungen  konnten die Aussaatgefäße fixiert und in der Box bestrahlt werden, ohne zu schnell auszukühlen. 

Eine zu starke Belichtung der Zellen kann über längere Zeiträume bei der Aufnahme zu Schädigun‐

gen z.B. an der DNA führen. Um Schäden der Zellen bei Durchlicht (DL)‐ und Auflicht (AL)‐

Aufnahmen über GFP‐ und TexasRed (TxR)‐Filter weitgehend zu vermeiden, erwiesen sich kurze  Belichtungszeiten (DL ~ 30 ms bis 50 ms, GFP‐Filter ~ 150 ms bis 600 ms und TxR‐Filter ~ 300 ms bis  700 ms) mit einem Kamera‐Gain von 4 als optimal. Zusätzlich wurde ein 6 %‐ bzw. 25 %‐Neutralfilter  inklusive UV‐Filter vor die HBO 100‐Lampe gesetzt. Die automatische Einstellung des Focus wurde  standardmäßig im Durchlicht ausgeführt. Für die Aufnahme des RFP‐LigaseI‐Musters der Zellen  wurde grundsätzlich eine Bildebene eingestellt. Zur Aufnahme der GFP‐53BP1‐Foci in den Zellen  wurden zur besseren Detektion 3 Ebenen im Abstand von 900 µm gewählt. Die zeitlichen Abstände  zwischen den Aufnahmezyklen lagen je nach Versuch zwischen 15 min bis zu 1 h. So konnten je  nach Zeitabstand und Anzahl der eingesetzten Filter zwischen den Zyklen 400 bis 600 Positionen  abgescannt werden. Die Aufnahmedauer während eines Experiments lag je nach Fragestellung zwi‐

Seite 75  schen 12 h und 24 h. Für die Aufnahmen wurde eine Charge‐Coupled‐Device (CCD)‐Kamera (CV‐

M4+CL) von JAI verwendet. 

Abb. 15: Komponenten des Live Cell Imaging‐Systems 

c   Mikroskop Axiovert 200M      h   Steuer‐Rechner mit Programm Metafer 

d   Inkubator XL           i   Scanning‐Tisch 

e   Lampe HXP 120        j   zusätzl. CO2‐Kammer, darunter Plastikabdeckungen 

f   CO2‐controller          k   µ‐slide VI 

g   tempcontrol 37‐2 digital       l   Waschflasche 

Um das inverse Mikroskop Axiovert 200M von Zeiss zu einem LCI‐System auszubauen, wurde der Inkubator XL der Firma  Pecon auf das Stativ des Mikroskops gesetzt. Da er vom Lampengehäuse bis zum Ansatz der Okulare reicht, wurde kein  zusätzliches Heizelement für die Objektive benötigt. Er ermöglicht durch sein großes Volumen die Inkubation bei relativ 

c  d

e  f  g  h

i j

k

l 

stabilen Temperatur‐Bedingungen. Zur CO2‐Begasung der Proben wurde eine zusätzliche CO2‐Kammer angefertigt, die  passgenau auf den Objekträger‐Halter des Scanning‐Tischs (Märzhäuser) aufgesetzt wird. Um zu verhindern, dass das CO2  zu schnell durch den nach unten offenen Scanning‐Tisch absinkt, wurden die freien Objektträger‐Plätze neben der Probe  mit Plastikabdeckungen verschlossen. Zum Einsetzen oder zur Entnahme der Proben aus dem Inkubator sind an der Vor‐

derseite des Inkubators jeweils zwei kleinere Schiebetüren und zwei etwas größere Scharniertüren angebracht.  

Zur Regulation der Temperatur wird die elektrische Einheit tempcontrol 37‐2 digital (Pecon) verwendet. Die aktuelle,  gemessene Temperatur wird auf dem Display angezeigt, gleichzeitig wird über eine Regeleinrichtung die Temperatur  konstant gehalten. Die Heizeinheit tempcontrol 37‐2 (Pecon) erwärmt das Innere des Inkubators über einen Zuleitungs‐

schlauch, ein eingebauter, auswechselbarer Filter minimiert die Staubbelastung im Innern des Systems. 

Die Einstellung der Konzentration des Luft/CO2‐Gemisches ist über eine Einheit zur CO2‐Kontrolle (Pecon) möglich. Hier  wird in einer Mischkammer Luft und CO2 auf eine Konzentration von 5 % CO2 eingestellt. Ein Lüfter verteilt das Gemisch  gleichmäßig im Inkubator. Ein Sensor registriert die aktuelle CO2‐Konzentration, und über eine Regeleinrichtung wird die  Menge an CO2, welche in die Mischkammer gelangt, gesteuert. 

Um die CO2‐haltige Luft anzufeuchten und so ein vorzeitiges Eintrocknen der begasten Proben zu vermeiden, wird das  Gasgemisch vor dem Auftreffen auf die Probe zusätzlich durch eine mit sterilem Wasser gefüllte Waschflasche geleitet. 

Die Zellen werden in die Kanäle des µ‐slide VI (ibidi) ausgesät. Die Kanäle bieten den Vorteil, dass sich die Zellen gleichmä‐

ßig bei der Aussaat verteilen. Diese Aussaat‐Gefäße bieten eine dünne optische Oberfläche zur optimalen Aufnahme von  Bildern im LCI‐System, außerdem ist der Gasaustausch gewährleistet. Durch die 6 Kanäle können mehrere Bedingungen  parallel getestet werden. 

Der Scanning‐Tisch der Firma Märzhäuser ermöglicht die automatisierte Aufnahme verschiedener  Positionen auf einem Objektträger. Definierte Positionen können ausgewählt, angesteuert und wie‐

derholt aufgenommen werden, der Verfahrbereich (130 mm x 100 mm) ist stufenlos einstellbar. 

Durch das Auswechseln der Einlegerahmen können sowohl Objektträger als auch Schalen fixiert  werden. Die Steuerung des Tisches sowie der Aufnahmebedingungen wurden über die Software  Metafer der Firma MetaSystems vorgenommen. 

Im Rahmen der Etablierung wurden Versuche zur Überprüfung der Bedingungen für das optimale  Wachstum der Zellen im LCI‐System sowie deren eventuelle Auswirkungen auf die lebenden Zellen  durchgeführt. Faktoren wie Akklimatisierung der Zellen in der neuen Umgebung, Temperatur, CO₂‐ Begasung und Aufnahmebedingungen während des Versuchs wurden über den Mitotischen Index  (MI), der die Anzahl der Zellteilungen pro Stunde an der Gesamtzellzahl angibt, untersucht. Die Be‐

stimmung des MI stellte sich als sehr sensitive Methode für den Nachweis der Vitalität von Zellen  heraus, da bereits bei kleinen Temperaturschwankungen innerhalb der Zellkultur die Werte des MI  über einen Zeitraum von einigen Stunden absanken, bevor die Zellen wieder ihre ursprüngliche  Teilungsgeschwindigkeit erreichten. 

Den Bezugspunkt bildeten unbehandelte, im Durchlicht aufgenommene U2OS‐Zellen. Unter optima‐

len Kulturbedingungen wurde eine sich gleichmäßig teilende, exponentiell wachsende Zellkultur  erwartet. Unter Beachtung aller zuvor aufgeführten Maßnahmen ergab sich schließlich ein kaum  schwankender MI über einen Zeitraum von mehreren Stunden. Die Untersuchung des MI wurde  zusätzlich mit U2OS‐Zellen durchgeführt, welche stabil mit dem Konstrukt GFP‐53BP1, einem Mar‐

ker für DSBs, transfiziert waren. Um das Konstrukt in den Zellen sichtbar zu machen, musste eine  Anregung des Fluorochroms über Auflicht einer spezifischen Wellenlänge erfolgen. Dies wurde  durch den Einsatz bestimmter Filtersätze (GFP‐Filter) zur Filterung des Auflichts erreicht. Auch bei  regelmäßiger Aufnahme mit Auf‐ und Durchlicht blieb der MI über mehrere Stunden stabil. Diese  Vorversuche zeigten, dass die gewählten Umgebungs‐ und Aufnahmebedingungen optimal für das  Wachstum der Zellen im LCI‐System waren und die Ergebnisse der nachfolgend durchgeführten  Versuche nicht beeinträchtigten oder verfälschten. 

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