Zu Kapitel 4.4.9: Bedeutung von γ‐H2AX im Zusammenhang mit ATM und ATR und dessen Check‐
point‐Funktion nach UVC‐Bestrahlung
Die folgenden Bildausschnitte zeigen Übersichtsbilder fixierter, asynchroner Zellkulturen von 82‐6hTert‐, F02‐98hTert‐ und AT7Bi‐Zellen. Die Zellen wurden unbestrahlt belassen, mit 6 J/m2 oder 12 J/m2 be‐
strahlt und entweder sofort nach Bestrahlung (Abb. 55) oder 2 h nach Bestrahlung (Abb. 56) fixiert. DSBs wurden mit γ‐H2AX‐Primärantikörper und FITC‐gekoppeltem Sekundärantikörper (grün) nachgewiesen.
Zellen der G2‐Phase wurden über Färbung mit einem Primärantikörper gegen anti‐phospho Histone H3 (Ser 10) und rotem Sekundärantikörper identifiziert. Die DNA wurde mit DAPI (blau) angefärbt. Die Über‐
sichtsbilder wurden in 400‐facher Vergrößerung aufgenommen und bestehen aus mehreren Ebenen.
Alle Bilder der jeweiligen Färbung wurden mit der gleichen Belichtungszeit aufgenommen. Nach Bestrah‐
lung und sofortiger Fixierung war keine deutlich Zunahme an γ‐H2AX‐Foci, weder in G2‐Phase‐Zellen noch in den übrigen Zellzyklus‐Phasen zu erkennen, auch die Anzahl von Zellen mit einem flächigen Sig‐
nal nahm nicht signifikant zu. Bei Fixierung der Zellen 2 h nach Bestrahlung konnte eine Zunahme von Zellen mit einer flächigen Phosphorylierung von H2AX (pannukleäres Signal) beobachtet werden. Diese Zellen entsprechen Zellen der G1‐ und G2‐Phase. Zellen mit Zunahme an γ‐H2AX‐Foci konnten auch nach der längeren Reparaturzeit von 2 h nicht detektiert werden.
A 0 J/m
2γ‐H2AX phospho H3 DAPI überlagert
82‐6hTert
F02‐98hTert
AT7Bi
Seite 181
B 6 J/m
2γ‐H2AX phospho H3 DAPI überlagert
C 12 J/m
2γ‐H2AX phospho H3 DAPI überlagert
Abb. 55: Übersichtsbilder der γ‐H2AX Phosphorylierung nach 0 h
Exponentiell wachsende Zellen der Zelllinien 82‐6hTert, F02‐98hTert und AT7Bi wurden zur Kontrolle unbestrahlt belassen (A) oder mit 6 J/m2 (B) und 12 J/m2 (C) bestrahlt. Sofort nach Bestrahlung wurden die Zellen fixiert und eine Färbung gegen γ‐H2AX und phospho H3 durchgeführt. Der polyklonale anti‐phospho H3 Antikörper erkennt nicht nur spezifisch Zellen während der Mitose, auch Zellen in der G2‐Phase werden erkannt. Die Färbung fällt hier schwächer aus als in mitotischen Zellen. Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt. Die Übersichtsbilder wurden in 400‐facher Vergrößerung und gleicher Belich‐
tungszeit der jeweiligen Färbung aufgenommen.
82‐6hTert
F02‐98hTert
AT7Bi
82‐6hTert
F02‐98hTert
AT7Bi
A 0 J/m
2γ‐H2AX phospho H3 DAPI überlagert
B 6 J/m
2γ‐H2AX phospho H3 DAPI überlagert
82‐6hTert
F02‐98hTert
AT7Bi
82‐6hTert
F02‐98hTert
AT7Bi
Seite 183
C 12 J/m
2γ‐H2AX phospho H3 DAPI überlagert
Abb. 56: Übersichtsbilder der γ‐H2AX Phosphorylierung nach 2 h
Exponentiell wachsende Zellen der Zelllinien 82‐6hTert, F02‐98hTert und AT7Bi wurden zur Kontrolle unbestrahlt belassen (A) oder mit (B) 6 J/m2 und (C) 12 J/m2 bestrahlt. 2 h nach Bestrahlung wurden die Zellen fixiert und eine Färbung gegen γ‐
H2AX und phospho H3 durchgeführt. Der polyklonale anti‐Histon H3 Antikörper erkennt nicht nur spezifisch Zellen wäh‐
rend der Mitose, auch Zellen in der G2‐Phase werden erkannt. Die Färbung fällt hier schwächer aus als in mitotischen Zellen. Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt und die Übersichtsbilder in 400‐facher Vergrößerung und gleicher Belichtungs‐
zeit der jeweiligen Färbung aufgenommen.
Zu Kapitel 4.4.6: γ‐H2AX‐Signal in synchronisierten G1‐Phase‐Zellen nach UVC‐Bestrahlung
Die Bildausschnitte zeigen Übersichtsbilder fixierter, in der G1‐Phase synchronisierter Zellen von 82‐
6hTert. Zeitgleich zur Stimulation mit FCS wurde zur Markierung von S‐Phase‐Zellen EdU ins Medium gegeben. Die Zellen wurden entweder nicht bestrahlt und fixiert oder mit 12 J/m2 bestrahlt und nach 18 h fixiert. DSBs wurden mit γ‐H2AX‐Primärantikörper und FITC‐gekoppeltem Sekundärantikörper (grün) nachgewiesen. Zellen der S‐Phase wurden über Färbung mit Alexa Fluor 594 (rot) des Click‐iT™
Kits (Invitrogen) detektiert. Die DNA wurde mit DAPI (blau) angefärbt. Die einzelnen Färbungen wurden in dieser Darstellung überlagert. Die Übersichtsbilder selbst bestehen aus 9 Einzelbildern, wovon jedes in 400‐facher Vergrößerung aufgenommen wurde und aus mehreren Ebenen besteht. Alle Bilder der jewei‐
ligen Färbung wurden mit der gleichen Belichtungszeit aufgenommen. In unbestrahlten Zellen und Fixie‐
rung nach 15 min war in vielen Zellen kein γ‐H2AX‐Focus, in wenigen Zellen 1 bis 4 Foci zu erkennen. 1 Zelle zeigte ein etwas stärkeres pannukleäres Signal, wenige Zellen konnten als S‐Phase positiv (rot) ge‐
wertet werden.
82‐6hTert
AT7Bi F02‐98hTert
Abb. 57: Übersichtsbild einer unbestrahlten Kultur von 82‐6hTert‐Zellen
Eine in der G1‐Phase synchronisierte Kultur von 82‐6hTert‐Zellen wurde zeitgleich mit FCS und EdU zum Medium gegeben, um Zellen, welche im Verlauf des Experiments in die S‐Phase gelangten, zu markieren. Die Zellen wurden zum Zeitpunkt 45 min nach Stimulation fixiert. Die Bilder wurden in 400‐facher Vergrößerung aufgenommen. Für die jeweiligen Färbun‐
gen wurden dieselben Belichtungszeiten gewählt.
Nach Bestrahlung der 82‐6hTert‐Zellen mit 12 J/m2 und Fixierung nach 18 h konnten mehr G1‐Phase‐
Zellen mit stärkerem und leichterem pannukleärem Signal als bei der unbestrahlten Probe nach soforti‐
ger Fixierung detektiert werden. In einzelnen Zellen der G1‐Phase waren γ‐H2AX‐Foci zu erkennen, die Anzahl der Foci war allerdings im Vergleich zu unbestrahlten Zellen kaum erhöht und bewegte sich zwi‐
schen 1 und 4 Foci. 18 h nach Bestrahlung waren mehr Zellen S‐Phase‐positiv (rot), Zellen, die S‐Phase‐
positiv waren und gleichzeitig ein sehr starkes pannukleäres Signal (grün) zeigten, wurden in dieser Überlagerung gelb dargestellt.
Die WT‐Zellen der Zelllinie 82‐6hTert dienten als Beispiel, in Zellen der Zelllinie AT7Bi konnten ähnliche Verhältnisse nach Bestrahlung von Zellen mit Foci und Zellen mit pannukleärem Signal gefunden werden.
Die Anzahl der Zellen mit pannukleärem Signal in F02‐98hTert Zellen war im Gegensatz zu den zuvor genannten Zelllinien verringert.
Seite 185
Abb. 58: Übersichtsbild einer mit UVC bestrahlten Kultur von 82‐6hTert‐Zellen
Eine in der G1‐Phase synchronisierte Kultur von 82‐6hTert‐Zellen wurde 30 min vor Bestrahlung mit 12 J/m2 zeitgleich mit FCS stimuliert und EdU zum Medium gegeben, um Zellen, welche im Verlauf des Experiments in die S‐Phase gelangten, zu markieren. Die Zellen wurden zum Zeitpunkt 18 h nach Bestrahlung fixiert. Die Bilder wurden in 400‐facher Vergrößerung aufgenommen. Für die jeweiligen Färbungen wurden dieselben Belichtungszeiten gewählt.