3 Material und Methoden
3.9 Proteinanalytische Methoden
3.9.1 Ernte und Lyse der Zellen zur Gewinnung von Gesamtprotein
Zum Nachweis von Proteinen wurden Zellen entsprechender Zelllinien in Zellkultur‐Schalen ausge‐
sät und 48 h inkubiert. Zur Ernte der Zellen wurde das Medium abgenommen, die Zellen 1 Mal mit 10 ml PBS gewaschen, erneut 10 ml kaltes PBS auf die Zellen gegeben und der Zellrasen mit einem
Schaber vom Boden der Zellkultur‐Schale abgeschabt und im PBS aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen 10 min bei 300xg und 4°C zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes wurden die Zellen in 200 µl Lysepuffer aufgenommen, der Zellaufschluss erfolgte über die Sonifizierung mit‐
tels eines Ultraschallstabes (2 Mal 10 s). Die lysierten Zellen wurden 30 min auf Eis gehalten und anschließend 30 min bei 13000xg und 4°C abzentrifugiert, um feste Zellbestandteile abzutrennen.
Vom Lysat wurde eine Proteinbestimmung nach Bradford durchgeführt, anschließend konnte der Überstand in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei ‐ 20°C einge‐
froren werden. Eine längere Lagerung der Gesamtproteine erfolgte bei ‐ 80°C.
Das Prinzip der Proteinbestimmung nach Bradford basiert auf einem Farbumschlag des Farbstoffs Coomassie‐Brillant‐Blau von rot (ungebundene Form) mit Absorptionsmaximum bei 470 nm zu blau (Komplexbildung mit Proteinen) und einer Verschiebung des Absorptionsmaximums auf 595 nm.
Die Zunahme der Absorption bei 595 nm durch die Komplexbildung wird gegen den ungebundenen Farbstoff gemessen und ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung. Zur Proteinbestim‐
mung wurde 1 µl des Zelllysats in 800 µl H2O gegeben. Nach Zugabe von 200 µl Bradford‐Reagenz wurde die Probe gevortext und bei RT 5‐10 min inkubiert. Als Kontrolle wurden 2 µl Lysepuffer in 800 µl Aqua dest. gegeben und ebenfalls 200 µl Bradford‐Reagenz zupipettiert. Die Messung der Absorption der Proben erfolgte am Photometer bei 595 nm. Die erhaltenen Extinktions‐Werte wur‐
den mit einer BSA‐Eichkurve verglichen und die Proteinkonzentration ermittelt.
3.9.2 SDS‐Polyacrylamid‐Gelelektrophorese
Zur Analyse der Proteine wird die SDS‐Polyacrylamid‐Gelelektrophorese (SDS‐PAGE) verwendet. Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgt über ein Polyacrylamid‐Gel. Proteine besitzen von Natur aus je nach Aminosäure‐Zusammensetzung verschiedene isoelektrische Punkte und un‐
terschiedliche Sekundärstrukturen. Durch die Zugabe des Detergens SDS (Natriumdodecylsulfat) werden nicht‐kovalente Wechselwirkungen im nativen Protein zerstört, die Eigenladung der Protei‐
ne wird überdeckt und sie weisen eine konstant negative Ladung auf. Sie können dadurch unabhän‐
gig von Ladung und Struktur allein anhand ihres Molekulargewichts aufgetrennt werden. Die Zuga‐
be von 2‐Mercaptoethanol zu den Proben dient der Zerstörung der Disulfidbrücken. Zusätzlich wer‐
den die Proteine durch Hitze denaturiert, somit gestreckt, und entsprechend ihrer Länge aufge‐
trennt.
In der SDS‐Gelelektrophorese werden zwei Arten von Gelen kombiniert. Das Sammelgel mit einem Tris‐HCl‐Puffer‐System ist weitporig (meist 5%ig) und dient der Konzentration der Probe. Glycinat‐
Ionen, die als Zwitterionen vorliegen (Gly +/‐), dienen als Folge‐Ionen, Chlorid‐Ionen dienen als Leit‐
Ionen, da sie schneller als die Glycinat‐Ionen zum positiven Pol wandern. Zwischen diesen beiden Ionenarten bewegen sich die Proteine und gelangen gemeinsam an das Trenngel. Das Trenngel (Tris‐HCl‐Puffer‐System pH 8,8) ist engporig (7 %ig bis 16 %ig) und trennt die Proteine auf. Beim pH‐
Sprung von Sammel‐ auf Trenngel entstehen Glycinat‐Anionen, die sich zu den Chlorid‐Ionen orien‐
tieren und ebenfalls schnell zur Anode laufen. Die Proteine werden nach ihrer Größe aufgetrennt.
Seite 51 Zur Auftrennung der Proteine ATM und ATR wurde ein 7 %‐iges Trenngel (Zusammensetzung siehe Tab. 6) in Kombination mit einem Sammelgel (Zusammensetzung siehe Tab. 7) in einem Elektropho‐
rese‐System der Firma Hoefer verwendet.
Zum Gießen des Gels wurden zunächst zwei Glasplatten in die Apparatur gespannt und das Trenngel bis etwa 1,5 cm unterhalb der Stelle gegossen, wo später der Kamm für die Aussparung der Taschen endete. Das Gel wurde mit Isopropanol überschichtet und zum Polymerisieren 1 h bei Raumtempe‐
ratur stehen lassen. Danach wurde das Isopropanol abgegossen. Das Sammelgel wurde nach dem Auspolymerisieren des Trenngels gegossen und der Kamm luftblasenfrei eingesetzt. Dieser wurde nach dem Polymerisieren (30 min) entfernt. Das Gel wurde in der Elektrophoresekammer fixiert, die Kammer mit Laufpuffer befüllt und die Taschen für die Proben mit Puffer gespült.
Die unter 3.9.1 vorbereiteten Proben wurden mit 5‐fach Laemmli‐Puffer versetzt, 5 min bei 80 °C erhitzt und nach kurzem Abzentrifugieren zusammen mit einem Proteinstandard zur Größenbe‐
stimmung (HiMark™Prestained HMW Protein Standard) auf das Gel aufgetragen. Die Auftrennung der Proteine erfolgte für etwa 2 h bei 125 V. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel aus der Kammer entfernt, die Glasplatten vorsichtig abgenommen und das Sammelgel abgetrennt.
Das Gel konnte so für die Analyse im Western Blot (siehe Kapitel 3.9.3) eingesetzt werden.
Tab. 6: Polyacrylamidgel (7 %)
Komponente Volumen
H2O bidest
30% AA:0,8% BAA (Rotiphorese®Gel 30) Gellösung B
5,1 ml 2,3 ml 2,5 ml 10 % SDS
10 % APS TEMED
100 µl 50 µl 5 µl
Tab. 7: Sammelgel
Komponente Volumen
H2O bidest
30% AA:0,8% BAA (Rotiphorese®Gel 30) Gellösung C
9,0 ml 2,2 ml 3,8 ml 10 % APS
TEMED
100 µl 40 µl
3.9.3 Western Blot
Der Western Blot bezeichnet das Übertragen oder „blotten“ von Proteinen, welche z.B. über SDS‐
PAGE aufgetrennt wurden, auf eine Trägermembran. Anschließend können die Proteine auf der Membran mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen werden.
Das Polyacrylamid‐Gel mit den aufgetrennten Proteinen wurde hierzu luftblasenfrei auf die Nitro‐
zellulose‐Membran gebracht und jeweils auf das Gel bzw. unter die Membran 3 in Transferpuffer getränkte Filterpapiere und 1 ebenfalls in Transferpuffer getränkter Schwamm gelegt. Dieser Auf‐
bau (Tank‐Blot‐Verfahren) wurde in die Kammer eingesetzt und diese mit Blotpuffer aufgefüllt. An‐
schließend wurde ein elektrisches Feld senkrecht zum Gel angelegt. Die Übertragung der Proteine auf die Membran erfolgte mit einer Stromstärke von 80 mA über Nacht bei 4°C.
Zur Überprüfung der Proteinübertragung wurde die Membran mit Ponceau S gefärbt. Nach an‐
schließender Entfärbung in einem Wasserbad wurde die Membran 1 h bei 4°C in Blockpuffer inkubiert, um unspezifische Bindungen der Antikörper zu verhindern. Nach zwei Waschschritten von je 10 min mit TBS‐T schloss sich die Inkubation der Membran mit der primären Antikörperlösung für ATM (mouse monoclonal, 1:500 in Antikörper‐Lösung) oder ATR (rabbit polyclonal, 1:500 in Anti‐
körper‐Lösung) über Nacht bei 4°C an. Nach dreimaligem Waschen der Membran mit TBS‐T für je‐
weils 10 min folgte die Inkubation mit der sekundären Antikörperlösung (goat‐anti‐mouse 1:10000 und goat‐anti‐rabbit 1:30000) für 1 h bei RT. Der Nachweis der Proteine erfolgte nach 3 Wasch‐
schritten mit TBS‐T für je 10 min durch ein Chemilumineszenz‐Reagenz (Lumilight Kit, Roche). Die Komponenten Luminol und Enhancer‐Lösung wurden kurz vor Verwendung nach Angaben des Her‐
stellers 1:1 gemischt und die Membran 1 min mit der Lösung inkubiert. Die Detektion des mit Meerrettichperoxidase konjugierten Zweit‐Antikörpers erfolgte am Chemismart5000.