2 Einleitung
2.5 Erkennung und Reparatur von UV‐induzierten DNA‐Schäden
Bei Schädigungen der DNA durch UV‐Licht werden vor allem zwei Reparaturwege aktiv, die Nukleo‐
tid‐Exzisions‐Reparatur (NER) und die Basen‐Exzisions‐Reparatur (BER). Die Hauptschäden bei UVC‐
Bestrahlung, 6‐4PPs und CPDs, werden durch die NER repariert. 6‐4PPs werden durch die BER wir‐
kungsvoll beseitigt, die hingegen bei der Reparatur von CPDs weniger effizient ist (Mitchell et al., 1985, Kim et al., 1994). Einzelne Basenfehlpaarungen in neu replizierter DNA werden über die Mismatch‐Reparatur (MMR) beseitigt. Diese entstehen trotz der proofreading‐Aktivität der Polymerase δ, welche zu 99 % erfolgreich ist, während der Replikation der DNA in der S‐Phase.
Dennoch treten immer wieder fehlerhafte Basenpaarungen vor allem in repetitiven Sequenzen auf, an denen die Polymerase oft nur ein ineffizientes proofreading durchführt (Jascur und Boland, 2006). Die molekularen Mechanismen der MMR sind nah verwandt zur NER und BER.
2.5.1 Basen‐Exzisions‐Reparatur
Die BER ist der am häufigsten genutzte Reparaturweg in der Natur und der Hauptweg für die Ent‐
fernung und Reparatur modifizierter Basen oder abasischer (apurine oder apyrimidine) Stellen (AP‐
Stellen), sowohl in Bakterien als auch in Säugern (Barnes und Lindahl, 2004). Veränderte Basen werden durch eine DNA‐Glycosylase erkannt und geschnitten, unterschiedliche Typen von Basenmodifikationen werden dabei durch spezielle Glycosylasen erkannt. So gibt es bislang 11 DNA‐
Glycosylasen in humanen Zellen, welche meist nur eine Klasse von DNA‐Schäden erkennen (Fried‐
berg et al., 2006). Bei der Reparatur wird die n‐glycosidische Bindung zwischen Base und Zucker‐
Rest des DNA‐Strangs (Desoxyribose) aufgelöst und es entsteht eine AP‐Stelle. Dieses Zwischenpro‐
dukt wird, ebenso wie spontan entstandene AP‐Stellen, durch eine AP‐Endonuclease prozessiert, um in weiteren Schritten die DNA‐Synthese und die Ligation durchführen zu können (Hoeijmakers, 2001, Amouroux et al., 2010).
Seite 21 Die BER wird in zwei Teilreparaturwege gegliedert. Beim „short‐patch“ wird genau 1 Nukleotid er‐
setzt. Über diesen Reparaturweg laufen 80‐90 % aller Reparaturprozesse ab, wohingegen der „long‐
patch“ nur einen Anteil von 10‐20 % hat. Hier werden im Allgemeinen 2‐10 Nukleotide ersetzt, wenn die AP‐Stelle nicht für die direkte Neusynthese geeignet ist, sondern weitere Schäden auf‐
weist. Die Beseitigung der AP‐Stelle erfolgt bei der „short‐patch“ Reparatur durch eine AP‐
Endonuklease, die 5´ von der AP‐Stelle schneidet und unter Bildung einer freien 3´‐OH‐Gruppe ein abasisches Deoxyribose‐Phosphat (dRP) bildet. Das dRP wird durch die Lyase‐Aktivität der DNA‐
Polymerase β entfernt und die fehlenden Nukleotide im gleichen Schritt aufgefüllt. Der verbleiben‐
de ESB wird anschließend über LigaseIII/XRCC1 geschlossen (Matsumoto und Kim, 1995, Sinha und Häder, 2002, Robertson et al., 2009). Zur Reparatur über „long‐patch“ BER wird zusätzlich PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigene) benötigt. Dieses Heterotrimer bildet einen Ring um die DNA mit dem Ziel, dem Polymerase‐Komplex, bestehend aus den Polymerasen β, ε, φ und η, größere Stabilität zu verleihen. Am freigelegten 5´‐OH Ende beginnt die Neusynthese des fehlenden DNA‐
Stücks, der alte DNA‐Strang wird dabei verdrängt. Die FLAP‐Endonuklease entfernt den alten DNA‐
Strang und es erfolgt die Ligation des ESBs (Wood et al., 2001).
2.5.2 Nukleotid‐Exzisions‐Reparatur
Die NER wurde schon in den 1960er Jahren von Robert Painter in Escherichia coli nachgewiesen. Der Mechanismus ist bis zu Eukaryoten hochkonserviert und wurde Ende der 1980er Jahre in Säugerzellen größtenteils aufgeklärt (Venema et al., 1990, Ljungman und Zhang, 1996). Über NER wird eine Vielzahl unterschiedlicher Läsionen repariert. Hierzu zählen sperrige DNA‐Läsionen, Crosslinks innerhalb von DNA‐Strängen, sowie CPDs und 6‐4PPs. Das gemeinsame Charakteristikum der Substrate, die von der NER erkannt werden, ist eine lokale Verformung der DNA‐Doppelhelix (Hess et al., 1997).
Insgesamt sind mehr als 25 Genprodukte an der NER beteiligt (Aboussekhra et al., 1995, Mu et al., 1995), von denen viele durch die Charakterisierung der Krankheit Xeroderma‐Pigmentosum (XP) identifiziert wurden. XP ist eine autosomal‐rezessiv vererbte Krankheit, die sich bei Patienten in einer stark erhöhten Empfindlichkeit gegenüber Sonnenlicht und einem erhöhten Hautkrebsrisiko äußert. Diesen Patienten ist es aufgrund eines Defektes in der NER nicht möglich, UV‐Schäden in der DNA zu reparieren. Dieser Defekt beruht auf Mutationen in einem von sieben Genen, die mit XPA bis XPG bezeichnet werden (Hoeijmakers, 1994, Sancar, 1996).
Das entscheidende Ereignis bei der NER ist die beidseitige Entfernung eines Nukleotid‐Schadens im DNA‐Strang, wobei die ausgeschnittenen Fragmente zwischen 24 und 32 Nukleotide lang sein kön‐
nen. Danach erfolgt das Auffüllen der entstandenen Lücke in der DNA durch eine Polymerase und schließlich die Ligation des neu sythetisierten DNA‐Abschnitts (Batty und Wood, 2000).
Die NER besitzt zwei untergeordnete Signalwege, die GG‐NER (Global Genome NER) (Mullenders et al., 1991, Feng et al., 2003) und die TC‐NER (Transcription Coupled NER) (Bohr et al., 1985, Mellon et al., 1987). Beide Wege unterscheiden sich nur in der Art der Erkennung des DNA‐Schadens (Shuck et al., 2008). Die GG‐NER beseitigt Schäden in Bereichen des Genoms, die nicht transkribiert werden,
wohingegen die TC‐NER die Reparatur von Schäden in Bereichen der DNA übernimmt, die aktiv transkribiert werden. Bis auf den unterschiedlichen Mechanismus in der Erkennung des Schadens sind beide Signalwege identisch (Abb. 8).
Kennzeichnend für die TC‐NER ist die Erkennung von DNA‐Schäden, welche den RNA‐PolymeraseII‐
Komplex blockieren (Fousteri und Mullenders, 2008). Bei der GG‐NER werden die Schäden der DNA durch den Protein‐Komplex XPC‐Rad23B erkannt. Sind die DNA‐Schäden durch UV‐Bestrahlung in‐
duziert, spielt zusätzlich die Erkennung durch den UV‐DDB (UV‐Damaged DNA‐Binding Protein)‐
Komplex eine Rolle (Sugasawa, 2009). Die Bindung dieser Proteine erleichtert die spätere Anlage‐
rung des Pre‐Inzisions‐Komplexes (Volker et al., 2001, Moser et al., 2005). Zunächst wird die DNA um die Schadensstelle geöffnet und entspannt, hierfür binden neben dem Faktor TFIIH (Human basal transcriptional Initiation Factor) RPA, XPA und XPG. Die ebenfalls zum TFIIH‐Komplex gehö‐
renden ATP‐abhängigen Helikasen XPB und XPD entwinden die DNA (Drapkin et al., 1994, Coin et al., 2007). Zu beiden Seiten des DNA‐Schadens wird die DNA nun von den Nukleasen XPG am 5´‐
Ende und ERCC1‐XPF (Excision Repair Cross Complementation group 1‐XPF) am 3´‐Ende geschnitten (O´Donovan et al., 1994), wobei die Schnitte asymmetrisch angesetzt werden. Am 3´‐Ende ist der Schnitt 2‐8 Nukleotide von der Läsion entfernt, am 5´‐Ende 15‐24 Nukleotide. Durch die beiden Schnitte wird ein einzelsträngiges Oligonukleotid‐Fragment frei, wodurch eine Lücke in der DNA von 25‐30 Nukleotiden entsteht. Wie auch im Falle der normalen DNA‐Replikation wird nun PCNA mit‐
tels RFC auf die DNA geladen (Kelman, 1997). Die DNA‐Polymerasen δ und ε synthetisieren DNA über die Lücke hinweg, der intakte Gegenstrang wird hierbei als Template verwendet (Gillet und Schärer, 2006). Die Stränge werden abschließend über die DNA‐Ligase verbunden (Araujo et al., 2000). Neuere Studien nehmen an, dass der XRCC1‐LigaseIII‐Komplex hauptsächlich am Ligationsschritt der NER beteiligt ist (Moser et al., 2007).
A B
Abb. 8: Schematischer Ablauf der Nukleotid‐Exzisions‐Reparatur
(A) Die Nukleotid‐Exzisions‐Reparatur (NER) besitzt zwei Signalwege, GGR (Global Genome Repair) und TCR (Transcription Coupled Repair). Die Erkennung des Schadens erfolgt bei der GG‐NER über die Komplexe XPC‐Rad23 (Xeroderma Pigmentosum C) und UV‐DDB (UV‐Damaged DNA‐Binding Protein). Die Einleitung des TC‐NER Wegs wird über die Blockie‐
rung der RNA‐PolymeraseII ausgelöst. Nach der Erkennung des Schadens treffen beide Signalwege zusammen. Durch die Bindung des TFIIH‐Komplexes, XPA und RPA erfolgt die Öffnung der DNA um den Ort des Schadens. Rechts und links des beschädigten DNA‐Strangs schneiden ERCC1‐XPF und XPG.
(B) Nach Entfernung des geschädigten DNA‐Abschnittes binden PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) und RFC (Repli‐
cation Factor C). Der Einzelstrang wird über DNA‐Polymerasen aufgefüllt und anschließend über eine DNA‐Ligase zusam‐
mengefügt (Fousteri und Mullenders, 2008).
Synthesis and ligation
Seite 23 2.5.3 Mismatch‐Reparatur
Die MMR ist an der Beseitigung von Fehlern in der DNA beteiligt, die während der Neusynthese der DNA entstanden sind. Daher führt der Verlust dieses Reparaturweges zu einer Ansammlung von Mutationen (100 bis 1000‐fache Fehlerrate während der Replikation), wodurch in der Folge die Entstehung unterschiedlicher Krebsarten begünstigt wird (Jascur und Boland, 2006). MMR ist ein evolutionär von Bakterien bis hin zu Säugern hochkonservierter Prozess, wobei das bakterielle Re‐
paratursystem biochemisch am besten untersucht ist (Modrich, 1991).
Die MMR kann in vier Phasen unterteilt werden. Zunächst erfolgt die Erkennung einer Fehlpaarung über hMSHα und hMSHβ (human MutS Homolog; MutS wurde zuerst in Bakterien entdeckt). Das Heterodimer hMSHα besteht aus hMSH2 und hMSH6 und erkennt Basen/Basen‐Fehlpaarungen und kurze Insertionen und Deletionen. hMSHβ ist zusammengesetzt aus hMSH2 und hMSH3 und er‐
kennt größere Insertionen und Deletionen (Peltomaki, 2003). Abgeleitet von der Kristallstruktur des MutS‐Proteins aus Bakterien wird davon ausgegangen, dass diese Proteine in Gegenwart von ATP wie eine Klammer an der doppelsträngigen DNA in der Nähe des Schadens binden und sich seitlich an ihr entlang bewegen (Gradia et al., 1997, Blackwell et al., 1998). Im humanen System ist es für hMSH nicht möglich, neu synthetisierte DNA vom korrekten Elternstrang zu unterscheiden, aber in gegenwärtigen Modellen wird angenommen, dass sich im neu synthetisierten Strang „nicks“ als Erkennungsmerkmal befinden (Thomas et al., 1991). In Bakterien hingegen ist die Erkennung des neu syntehtisierten Strangs über die Methylierung der DNA möglich.
Im nächsten Schritt rekrutiert der Komplex aus DNA, hMSH und ATP den MutL‐Komplex. Das Hete‐
rodimer MutL besteht aus hMLH1 und hPMS2 und entfernt die DNA‐Polymerase und PCNA vom neu synthetisierten Strang. Anschließend werden die ExonukleaseI (ExoI) und weitere Proteine der MMR rekrutiert, um die fehlerhaften Basen zu entfernen. Die Re‐Synthese der DNA erfolgt über DNA‐
Polymerase δ, eventuell sind die DNA‐Polymerasen α und ε ebenfalls daran beteilligt (Chang et al., 2000).