Die spontane Regeneration peripherer Nerven ist nach großem Substanzverlust und komplexen Verletzungen, wie sie z. B. nach Motorrad-Unfällen vorkommen, stark eingeschränkt. Der klinische Standard, die Verwendung autologer Transplantate, ist unter anderem aufgrund eingeschränkter Verfügbarkeit von Spendernerven ebenfalls nicht ausreichend. Es gibt daher intensive Bemühungen mittels „Tissue engineering“ biohybride Nerventransplantate herzustellen, die eine geeignete Leitstruktur für regenerierende Axone bieten und gleichzeitig durch Schwann-Zellen und neurotrophe Faktoren eine wachstumsfördernde Umgebung bieten. Dass Schwann-Zellen essentiell für die Regeneration verletzter Nerven sind, konnte bereits mehrfach gezeigt werden (LUNDBORG et al. 1982). Bei der Suche nach einem geeigneten Gerüstmaterial sind eine Vielzahl von Substanzen sowohl in vitro und in vivo als auch in klinischen Studien getestet worden. Ein vielversprechender Kandidat ist PolySia, die im Rahmen der DFG-Forschergruppe 548 als potentieller Grundbestandteil für ein biohybrides Nerventransplantat untersucht wird. Es konnten bereits vielversprechende Ergebnisse in in vitro-Studien erzielt werden (HAILE et al. 2008; HAILE et al. 2007). In der vorliegenden Arbeit sollte der Effekt von PolySia auf die periphere Nervenregeneration in vivo untersucht werden. Es wurde daher das Regenerationsmodell des N. ischiadicus adulter Ratten verwendet. Zunächst wurde eine Defektstrecke von 10 mm mittels Silikonröhrchen überbrückt, das mit Zellen, gelöster PolySia oder Schwann-Zellen und PolySia befüllt war. Als Negativkontrolle wurden mit Matrigel gefüllte
Silikonröhrchen verwendet. Nach einem Beobachtungszeitraum von 3 und 6 oder 8 Wochen wurden die Implantate entnommen und im Falle einer erfolgten Geweberegeneration weiter untersucht. Es wurde die Anzahl regenerierter myelinisierter Axone ermittelt und die Anzahl überlebender implantierter Schwann-Zellen. Mittels Tracing-Experimenten wurde die Anzahl regenerierter motorischer und sensorischer Nervenzellen bestimmt und außerdem wurde eine funktionelle Untersuchung mittels elektrodiagnostischen Messungen durchgeführt. In einer zweiten Studie wurde eine 13 mm lange Defektstrecke mit Schwann-, PolySia- oder Schwann-Zell + PolySia-haltigen Silikonröhrchen überbrückt. In diesem Fall diente das Autotransplantat als Positivkontrolle. Die funktionelle Regeneration wurde über einen Zeitraum von 10 Wochen mittels Verhaltensversuchen sowie ebenfalls elektrodiagnostischen Messungen untersucht und es wurde wieder die Anzahl regenerierter myelinisierter Axone ermittelt. Da das endgültige Ziel der Forschergruppe ein PolySia-basiertes Gerüst ist, das als Leitschiene für die auswachsenden Axone dienen kann, wurden in ersten Sondierungsversuchen PolySia-beschichtete Nanofasern und Nanopartikel in dem Regenerationsmodell des N. ischiadicus der Ratte auf ihre Bioverträglichkeit getestet.
Es sollten im Rahmen dieser Arbeit folgende Fragen geklärt werden:
1. Wie wirkt sich PolySia als lösliches Substrat auf das Auswachsen bzw. die Anzahl regenerierender Axone aus?
2. Wird die Regeneration motorischer und sensorischer Neurone von gelöster PolySia unterschiedlich beeinflusst?
3. Schafft lösliche PolySia ein förderndes Milieu, in dem die transplantierten Schwann-Zellen überleben können?
4. Wie wird die funktionelle Regeneration von löslicher PolySia beeinflusst?
5. Kann PolySia als Bestandteil verschiedener Gerüstkonstruktionen die periphere Nervenregeneration nach einer Quetschung bzw. im Regenerationsmodell der epineuralen Tasche ohne eine Immunreaktion auszulösen verbessern?
2 Material und Methoden 2.1 Materialien
2.1.1 Geräte
Cryostat: CM 3050, Leica, Nussloch, BRD
Heizplatte: BI, Barnstead Electrothermatic, UK
Mikroskope: Olympus IX70 mit Color View Soft
Imaging System, Olympus Optical Co.
GmbH, BRD
Olympus BX60 mit Color View Soft Imaging System, Olympus Optical Co.
GmbH, BRD
Olympus CK30-F200, Olympus Optical Co. GmbH, BRD
Mikrotom: RM 2155, Leica, Nussloch, BRD
Multifunktionsmischer: Roto-Shake Genie®, Scientific Industries, über Carl Roth GmbH + Co. KG,
Karlsruhe, BRD
OP-Mikroskop: Typ 613105, Nr. 177, Möller-Wedel, BRD
Zeiss
Rotarod: ROTO-ROD, IITC Life Science, Inc.,
Kalifornien, USA
Sterilbank: Thermo Fisher Scientific, Herasafe KS,
USA
Trockenschrank: Memmert GmbH&Co KG, Schwabach,
BRD
Wasserbad: GFL mbH, Burgwedel, BRD
Zellkulturinkubatoren: Sanyo CO2-Inkubator, Bad Nenndorf, BRD
Zentrifugen: Heraeus Varifuge 3.0R, HeraeusSepatech,
Hanau, BRD
2.1.2 Verbrauchsmaterialien, Chemikalien und Lösungen Zellkultur
Arabinosid-C (Ara-C): Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, BRD
Bovines Serumalbumin (BSA): PAA Laboratories GmbH, Cölbe, BRD
Collagenase IV: PAA Laboratories GmbH, Cölbe, BRD
Cryo-Röhrchen: Cryotube 1,8ml, Nunc, A/S, Roskilde, DK
Dispase: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
BRD
Dimethylsulfoxid (DMSO): Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, BRD
Dulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM): PAA Laboratories GmbH, Cölbe, BRD
DMEM/F12: PAA Laboratories GmbH, Cöle, BRD
Dynabeads® Pan Mouse IgG: Dynal Biotech, ASA Oslo, Norwegen
Eppendorf-Tubes: Sarstedt AG & Co, Numrecht, BRD
Fötales Kälberserum (FCS): PAA Laboratories GmbH, Cölbe, BRD
Forskolin: Calbiochem®, Merck Biosciences Ltd.,
Nottingham, UK
Glutamin, 200mM: PAA Laboratories GmbH, Cölbe, BRD
Hanks balanced salt solution, Mg- und Ca-frei: PAA Laboratories GmbH, Cölbe, BRD
Insulin: Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, BRD
Mehrlochplatten: Nunclon™Surface, Nunc GmbH & Co KG,
(96well, 24well, 6well) Wiesbaden, BRD
Natrium-Pyruvat: PAA Laboratories GmbH, Cölbe, BRD
Neubauerzählkammer: Superoir Marienfeld, Lauda-Königshausen, BRD
Paraformaldehyd (PFA): Fluka, Neu-Ulm, BRD
Pasteurpipetten: Brand GmbH, Wertheim, BRD
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep): PAA Laboratories GmbH, Cölbe, BRD Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS): Biochrom AG, Berlin, BRD
PKH26 red fluorescent cell linker-Kit: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, BRD
Plastikpipetten: Becton Dickinson, GmbH, Heidelberg,
BRD
Poly-L-Lysin (PLL): Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, BRD
Falcon®Röhrchen, 15ml und 50ml: Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, BRD
Trypsin/EDTA: PAA Laboratories GmbH, Cölbe, BRD
Zellkulturflaschen: Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, BRD
Operationstechnik
Arterienklemme: John Hopkins Bulldog Clamp, World
Precision Instruments, USA
Braunol: Braun, Melsungen, BRD
Bepanthen® Augen/Nasensalbe: Bayer Vital GmbH, Leverkusen, BRD
Chloralhydrat, reinst: Fluka-Chemie AG, Neu-Ulm, BRD
Futterpellets: Altromin Haltungsfutter, Altromin,
Altrogge, Lage, BRD
Heizdecke: AEG HK 5510, Electrolux, Stibel-Eltron,
Holzminden, BRD
Inzisionsfolie: Opraflex®, Lohman & Rauscher GmbH, Remsdorf, BRD
Kohlendioxid (CO2): Linde AG, Hamburg, BRD
Kragen: Elizabethan collar for rats, Kent Scientific
Corp., Conneticut, USA
Leovit Anti Bite Spray: Alvetra GmbH, Neumünster, BRD
Makrolonkäfige: Typ III und Typ IV S
Growth factor-reduced Matrigel™-Matrix: BD Biosciences, Bedford, USA
Nahtmaterial: Ethilon®-Faden, Johnson & Johnson Int.
USA
Natrium-Chlorid: Braun, Melsungen, BRD
Neuronenmarker DiI: Invitrogen™, Molecular Probes™, Eugene, Oregon, USA
OP-Besteck:
- anatomische Pinzette: Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, BRD
- chirurgische Pinzette: No. 08-231-130, Allgaier Instrumente GmbH, Frittlingen, BRD
- chirurgische Schere: No. 08-231-130, Allgaier Instrumente GmbH, Frittingen, BRD
- Metzenbaumschere: Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, BRD
- Uhrmacherpinzetten: Dumont No. 5, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, BRD
- VANNAS-Mikroschere: No. 15003-08, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, BRD
Perfusionskanüle: Knopfkanüle, Fine Science Tools GmbH,
Heidelberg, BRD
Rasierer: Einwegrasierer, Wilkinson Sword GmbH,
Solingen, BRD
Ratten: Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld, BRD
Janvier, Le Genest St. Isle, Frankreich Skalpell, No 21 und No 15: Produkte für Medizin AG, Köln, BRD
Silikonröhrchen: VWR International, Hannover, BRD
Standardeinstreu für Labortiere: Altromin, Altrrogge, Lage, BRD
Buprenophin: Temgesic®-Ampullen Injektionslösung,
Essex Pharma GmbH, München, BRD
Gewebeaufarbeitung und Einbettung/Färbung
Cacodylsäure Natriumsalz Trihydrat: Merck, Darmstadt, BRD
Corbitbalm: I. Hecht, Kiel-Hasseer, BRD
Dako-Pen: Dako, Glostrup, Dänemark
DAPI (4’,6-Diamino-2-phenylindol): Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, BRD
Deckgläser: Menzel GmbH + Co KG, Braunschweig, BRD
Dodecenylsuccinic acid anhydride (DDSA): Serva, Heidelberg, BRD D(+)-Saccharose, reinst: Riedel de Haen, Seelze, BRD
Ethanol: J. T. Baker, Deventer, Holland
Glasmesser: Leica, Nussloch, BRD
Glutaraldehyd: Sigma, Taufkirchen, BRD
Glycidether 100: Serva, Heidelberg, BRD
Hämatoxilin: Roth, Karlsruhe, BRD
Kaiser’s Glyceringelatine: Merck, Darmstadt, BRD
Kaliumdichromat: Merck, Darmstadt, BRD
Methylenacid anhydride (MNA): Serva, Heidelberg, BRD
Milchpulver: Bio-Magermilchpulver, Heirler Cenovis
GmbH, Radolfzell, BRD
Mowiol: Calbiochem®, Merck, Darmstadt, BRD
Objektträger, Superfrost®Plus: Menzel GmbH + Co KG, Braunschweig, BRD
Osmiumtetroxid (OsO4): Polyscience Inc., Warrington, USA
Tissue Tek®: O.C.T. Compound, Sakura Finetek Europe,
Holland
Toluidinblau: Merck, Darmstadt, BRD
Toluol: Merck, Darmstadt, BRD
Trisaline-Puffer, in H2O, pH = 7,4: Serva, Heidelberg, BRD
Triton X-100: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufheim,
BRD
2,4,6-tris(dimethyl-aminomethyl)phenol (DMP30): Serva, Heidelberg, BRD
Elektrodiagnostik und Verhaltensstudien
bipolare Haken-Stimulationselektrode: Medizintechnik MHH, Hannover, BRD Elektromyograph zur klinischen Anwendung: Keypoint® Portable, Medtronic Functional
Diagnostics A/S, Skovlunde, Dänemark Elektronische Stimulationseinheit: Keypoint® Portable, Medtronic Functional
Diagnostics A/S, Skovlunde, Dänemark
Nadel-Ableitelektroden: Disposable Scalp Needle Electrodes, Alpine bioMed, Skovlunde, Dänemark
Notebook: Toshiba Tecra 8200, Toshiba, Tokio,
Japan
Parafilm: Pechiney Plastic Packaging Inc., Neenah,
USA
Stempelfarbe: Pelikan, Hannover, BRD
Stempelkissen: Pelikan, Hannover, BRD
Videokamera: Canon MV20i, Digital Video Camcorder,
Canon, Japan
2.2 Zellkulturtechnik
2.2.1 Kultur-Medien
Schwann-Zell-Medium: DMEM, 10 % FCS, 1 % Pen/Strep, 1 % Natrium-Pyruvat, 1 % Forskolin, 1 % Glutamin
Schwann-Zell-Medium ohne Forskolin: DMEM, 10 % FCS, 1 % Pen/Strep, 1 % Natrium-Pyruvat, 1% Glutamin
Schwann-Zell-Medium 5%: DMEM, 5 % FCS, 1 % Pen/Strep, 1 % Natrium-Pyruvat, 1 % Forskolin, 1 % Glutamin
N1-Medium: DMEM F12, 100U/ml Pen/Strep,
1 mM Natrium-Pyruvat, 2 mM Glutamin, 0,006 µg/ml Insulin, 0,2 % N1-Supplement, 0,25 % BSA
N1-Supplement: 5 mg/ml Transferin, 16,11 mg/ml Putrescin, 3,14 µg/ml Progesteron, 5,77 µg/ml Natrium-Selenit
Dissoziationslösung: DMEM, 4 % FCS, 0,4 % Pen/Strep, 0,125 U/ml Collagenase IV, 1,25 U/ml Dispase
2.2.2 Gewinnung von neonatalen Schwann-Zellen der Ratte
Die verwendeten Schwann-Zellen sind Primärzellen. Die Isolation und Kultivierung neonataler Schwann-Zellen aus der Ratte wurde bereits 1979 von Brockes et al. beschrieben (BROCKES et al. 1979). In der vorliegenden Arbeit wurde ein bereits im Labor etabliertes Protokoll verwendet (HAASTERT et al. 2005; TIMMER et al. 2003). Dazu wurden die Zellen aus dem N. ischiadicus von 1 - 3 Tage alten Ratten gewonnen. Die Ratten wurden dekapitiert.
Der N. ischiadicus in beiden Hinterbeinen wurde von lateral aus freigelegt, ein möglichst großes Stück davon herausgenommen und in Hank’s balanced salt solution gelagert.
Schließlich wurde das Medium abgenommen und die gewonnenen Nerven mit Dissoziationslösung bei 37°C inkubiert. Nach 30 – 45 Min wurde die Reaktion durch Zugabe von Schwann-Zell-Medium ohne Forskolin gestoppt und für 5 Min bei 1000 rpm (= 235 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und die Nervenstückchen in Schwann-Zell-Medium ohne Forskolin resuspendiert. Mit geschliffenen Pasterurpipetten wurden die Zellen vereinzelt und in eine PLL-beschichtete kleine Zellkulturflasche ausgesät. Nach 24 h wurde Ara-C in einer Konzentration von 10 mM für 96 h zu den Zellen gegeben, um ein Überwachsen der Schwann-Zellen mit Fibroblasten zu verhindern.
2.2.3 Aufreinigung von neonatalen Schwann-Zellen der Ratte
Da bei der verwendeten Methode zur Gewinnung von Schwann-Zellen immer auch Fibroblasten mit isoliert wurden, die einen kürzeren Vermehrungszyklus haben als die Schwann-Zellen, mussten diese aus der Kultur entfernt werden. Dies geschah mittels Immunopanning (HAASTERT et al. 2005; WILLIAMS et al. 1986) etwa eine Woche nach der Isolation. Dazu wurden Dynabeads® Pan Mouse IgG verwendet. Bei diesem System sind
kleine Magnetkügelchen mit einem Durchmesser von 4,5 ± 0,2 µm an monoklonale Antikörper gekoppelt, die spezifisch die kristallinen Fragmente (Fc-Fragmente) aller Maus Immunglobuline G (IgG) binden.
20 µl der Magnetkugel-Lösung wurden zunächst in ein Eppendorf-Gefäß überführt und 3-mal mit je 1 Milliliter 0,1 % BSA in PBS (0,1 M, pH = 7,4) gewaschen. Dazu wurde von außen ein Magnet an das Eppendorf-Gefäß gehalten, so dass die Dynabeads magnetisch angezogen und an der Gefäß-Wand zurückgehalten wurden, während der Überstand abgenommen werden konnte. Die Dynabeads wurden danach 45 Min mit 200 µl Maus anti-Ratte Thy1-Antikörper (monoklonal, eigene Herstellung aus der Hybridomazelllinie Ox7) auf einem Multifunktionsmischer auf Eis inkubiert, um die Antikörper an die Magnetkugeln zu binden.
Anschließend wurden die Zellen in 300 µl Schwann-Zell-Medium suspendiert, zu dem Beads-Antikörper-Gemisch gegeben und 45 Min auf Eis inkubiert. Die Schwann-Zellen konnten schließlich aus dem Gemisch entfernt werden, da die Fibroblasten spezifisch an den Thy1-Antikörper und somit an die Magnetkugeln binden und diese mit Hilfe des Magneten im Eppendorf-Gefäß zurückgehalten wurden.
Die Schwann-Zellen wurden anschließend erneut ausgesät und die Aufreinigung bei Bedarf wiederholt.
2.2.4 Kulturbedingungen der neonatalen Schwann-Zellen
Die Schwann-Zellen wurden in PLL-beschichteten Kulturflaschen oder Mehrlochplatten mit Schwann-Zell-Medium bei 37°C und 8 % CO2 im Zellkulturinkubator inkubiert. Das Medium wurde alle 3 - 5 Tage gewechselt.
Sollten die Zellen für eine Transplantation verwendet werden, so wurde vorher ein Serumentzug durchgeführt. Dazu wurde 48 h vor der Transplantation Schwann-Zell-Medium mit 5 % FCS zu den Zellen gegeben. Nach 24 h wurde erneut ein Mediumwechsel durchgeführt. Diesmal bekamen die Zellen serumfreies N1-Medium. Weitere 24 h später wurden die Zellen schließlich für die OP abtrypsiniert und bis zur Implantation auf Eis gelagert (s. Absatz 2.3.3.1).
2.2.5 Passagieren der neonatalen Schwann-Zellen
Die Zellen wurden zunächst mit warmem PBS gewaschen. Anschließend wurde soviel Trypsin/EDTA auf die Zellen gegeben, dass der Zellrasen knapp bedeckt war. Die Zellen wurden mit dem Trypsin/EDTA für wenige Minuten bei 37°C inkubiert. Durch leichtes Klopfen lösten sich die Zellen vom Boden des Kulturgefäßes. Die Zellsuspension wurde mit mindestens der gleichen Menge FCS-haltigen Mediums versetzt und resuspendiert. Dadurch war ein Überschuss an Proteinen in der Suspension vorhanden, sodass das Trypsin von diesen inaktiviert wurde. Die Zellzahl in der Suspension konnte mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt werden. Anschließend wurde die Zellsuspension nach Verdünnung mit der gewünschten Menge an Medium auf neue Kulturgefäße oder Mehrlochplatten verteilt.
2.2.6 Einfrieren und Auftauen von neonatalen Schwann-Zellen
Zum Einfrieren der Zellen wurden diese zunächst mit warmem PBS gewaschen und danach trypsiniert (siehe Absatz 2.2.5). Die Zellsuspension wurde bei Raumtemperatur und 1000 rpm (= 235 x g) 5 Min zentrifugiert und der Überstand anschließend entfernt. Das Zellpellet wurde in kalter Einfrierlösung (Schwann-Zell-Medium mit 10 % DMSO) resuspendiert und auf Kryo-Röhrchen aufgeteilt. Die Kryo-Röhrchen wurden für 24 h bei -80°C eingefroren und dann in flüssigem Stickstoff gelagert.
Die so eingefrorenen Zellen wurden bei Bedarf so schnell wie möglich im Wasserbad bei 37°C aufgetaut, in ein Falcon-Röhrchen mit ca. 7 ml Schwann-Zell-Medium überführt und 5 Min bei 1000 rpm zentrifugiert. Danach wurde der Überstand abgenommen und die Zellen in Medium resuspendiert und in eine Zellkulturflasche überführt.
2.2.7 Fixieren von neonatalen Schwann-Zellen
Das Fixieren von Zellen erfolgte im Allgemeinen in Mehrlochplatten. Dazu wurden die Zellen, nachdem das Medium abgesaugt wurde, in PBS gewaschen und anschließend in 4%igem PFA in PBS für 20 Min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden sie 3-mal mit PBS gewaschen und bis zur weiteren Verwendung in PBS bei 4°C gelagert.
2.2.8 PKH-GL 26 Färbung von neonatalen Ratten-Schwann-Zellen
Um lebende Zellen fluoreszent zu markieren, wurde der rote Fluoreszenz-Fabstoff PKH-GL 26 den Herstellerangaben gemäß verwendet. Dieser Farbstoff wird stabil in die Zellmembran eingebaut und kann aufgrund dieser unspezifischen Bindung zur Färbung von verschiedenen Zelltypen verwendet werden.
Zum Färben wurden die Zellen trypsiniert (s. Absatz 2.2.5) und in dem mitgelieferten Diluent C resuspendiert. Anschließend wurde der 1:250-fach mit Diluent C verdünnte Fluoreszenzfarbstoff zu den Zellen gegeben und 3 - 4 Min inkubiert. Durch Zugabe der gleichen Menge Serum wurde die Reaktion gestoppt. Nach weiteren 90 sec Inkubation wurde das gleiche Volumen Medium hinzugegeben und die Zellen für fünf Min bei 1000 rpm (= 235 x g) zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend 2 Mal mit Medium gewaschen. Schließlich wurden die Zellen in der gewünschten Konzentration für die in vivo-Studien in Silikon-Röhrchen in den N. ischiadicus von adulten Ratten transplantiert (s. Absatz 2.3.3).
2.3 Tierexperimentelle Arbeiten
2.3.1 Das Rattenmodell
Um die Effekte von PolySia auf die Regeneration peripherer Nerven über große Defektstrecken in vivo untersuchen zu können, wurde ein etabliertes Rattenmodell mit Durchtrennung und Rekonstruktion der Axone des N. ischiadicus gewählt (HAASTERT et al.
2010; HAASTERT et al. 2006; TIMMER et al. 2003).
Für diese Untersuchungen wurden ca. acht Wochen alte und 180 – 200 g schwere, weibliche Sprague-Dawley Ratten (Rattus norvegicus) der Firma Charles River, sowie Lewis Ratten der Firma Janvier verwendet. Die Tiere wurden im Zentralen Tierlabor (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover unter Standardbedingungen (Raumtemperatur 22 ± 2°C, Luftfeuchtigkeit 55 ± 5%, Licht-Dunkel-Zyklus 14 h:10 h) in Makrolonkäfigen des Typs-IV auf Standardeinstreu in Gruppen zu vier Tieren gehalten. Die Futterpellets, sowie Wasser stand den Tieren ad libitum zur Verfügung. Die Versuche erfolgten mit Genehmigung der Bezirksregierung Hannover (Aktenzeichen 05/947 bzw. 08/1564) und in Übereinstimmung der Richtlinien für Tierversuche nach den Auflagen der Europäischen Gemeinschaft.
2.3.2 Versuchsdesign
Der linke N. ischiadicus der Versuchstiere wurde nach kompletter Durchtrennung auf unterschiedliche Weise rekonstruiert. In einer ersten Studie wurden Silikon-Röhrchen (Ø 1,5 mm, Wandstärke 0,4 mm) in eine 10 mm lange Lücke des N. ischiadicus implantiert (s. Abbildung 2-1). Die Röhrchen waren entweder mit GFR-Matrigel (A), GFR-Matrigel und PolySia (B), GFR-Matrigel und neonatalen Schwann-Zellen (C) oder GFR-Matrigel, PolySia und Schwann-Zellen (D) gefüllt. Um das Überleben der Zellen in vivo zu untersuchen, wurden außerdem in zusätzliche Tiere (Gruppen E, F) Schwann-Zellen transplantiert, die mit dem Fluoreszenzfarbstoff PKH-GL 26 markiert (s. Absatz 2.2.8) waren (entsprechend Gruppen C und D). In Tabelle 2-1 ist die Anzahl der Tiere in den verschiedenen Gruppen nochmal zusammengefasst. Tabelle 2-2 zeigt den Aufbau dieser Studie.
Abbildung 2-1: Läsionsmodell des N. ischiadicus.
In einer zweiten Studie wurde eine 13 mm lange Lücke mittels Silikon-Röhrchen überbrückt.
Da eine spontane Regeneration in diesem Modell bis zu einer Lücke von 12 mm möglich ist (LUNDBORG et al. 1982), konnten auf diese Weise die positiven Einflüsse der Implantate besser untersucht werden. In dieser Studie waren die Silikon-Röhrchen entweder mit GFR-Matrigel und PolySia (H), GFR-GFR-Matrigel und Schwann-Zellen (I) oder mit GFR-GFR-Matrigel, PolySia und Schwann-Zellen (J) befüllt. Als Positivkontrolle wurde ein autologes
Nerventransplantat (G; s. Absatz 2.3.3.1) gewählt. Tabelle 2-3 zeigt eine Übersicht über den Aufbau dieser Studie.
Ein weiteres verwendetes Läsionsmodell ist die epineurale Tasche, bei der das Epineurium des N. ischiadicus über eine Strecke von etwa 5 mm längs eröffnet und die Nervenfaszikel in diesem Stück durchtrennt und entnommen wurden (s. Absatz 2.3.5). In die dadurch entstandene Lücke wurden PolySia-beschichtete Vliese aus gerichteten Nanofasern gegeben, um deren Verträglichkeit in vivo erstmals zu testen. In diesem Vorversuch wurden nur 6 Tiere operiert. Die Regeneration wurde nach einer bzw. drei Wochen (n = 3) evaluiert.
PolySia-gekoppelte Nanopartikel wurden ebenfalls in einem ersten Vorversuch untersucht.
Dazu diente das Crush-Modell. Bei diesem Modell wird das Epineurium nicht eröffnet, sondern der Nerv gequetscht. So entsteht eine vergleichsweise geringe Verletzung für den Nerv, was eine schnellere und funktionell bessere Regeneration als die beiden oben beschriebenen Läsionsmodelle ermöglicht. Die Bioverträglichkeit suspendierter Nanopartikel in einem kurzen Regenerationszeitraum von drei Wochen sollte untersucht werden. Die Anzahl der Tiere in diesem Vorversuch lag ebenfalls bei n = 3 (s. Absatz 2.3.6).
Tabelle 2-1: Gruppeneinteilung der 10 mm-Studie.
Die lyophilisierte PolySia wurde in DMEM gelöst, mit GFR-Matrigel 1:1 gemischt und in einer Endkonzentration von 12,5 mg/ml in die Silikon-Röhrchen eingebracht. Im Fall einer Zellimplantation wurden jeweils 1,7 x 106 Schwann-Zellen in der Implantationsmatrix implantiert.
Tabelle 2-2: Design der 10 mm-Studie.
Tabelle 2-3: Design der 13 mm-Studie.
Die lyophilisierte PolySia wurde in DMEM gelöst, mit GFR-Matrigel 1:1 gemischt und in einer Endkonzentration von 12,5 mg/ml in die Silikon-Röhrchen eingebracht. Im Fall einer Zellimplantation wurden jeweils 1,7 x 106 Schwann-Zellen in der Implantationsmatrix implantiert.
2.3.3 Implantation von Silikon-Röhrchen
Die operativen Eingriffe selbst wurden von Frau PD Dr. Kirsten Haastert durchgeführt, um die Vergleichbarkeit mit anderen Studien der Arbeitsgruppe zu gewährleisten (HAASTERT et al. 2006). Die Operationsvorbereitungen und die Nachsorge der Tiere wurden von mir durchgeführt.
Die Tiere wurden gewogen, kurzzeitig mit CO2 betäubt und mit Chloralhydrat (370 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal narkotisiert. Während aller operativen Eingriffe wurden die Tiere auf eine Heizdecke gelegt, um ein Auskühlen zu verhindern. Zum Schutz vor dem Austrocknen der Augen wurden diese mit Bepanthen-Augensalbe bedeckt. Den Tieren wurde dann die linke Hinterextremität großzügig rasiert und mit 70 %igem Alkohol desinfiziert. Das Operationsfeld wurde mit steriler Inzisionsfolie abgeklebt. Die Operationen fanden mit Hilfe eines Operationsmikroskopes statt. Dabei wurde der linke N. ischiadicus freigelegt, indem die Haut parallel des Femurs über 2 - 3 cm mit einem Skalpell durchtrennt wurde und die Muskelbäuche des Musculus (M.) semitendinosus und des M. biceps femoris stumpf mit einer Metzenbaum-Schere und einer chirurgischen Pinzette voneinander getrennt wurden. Mit einer VANNAS-Mikroschere und Uhrmacherpinzetten (Dumont No.5) wurde der Nerv vom umliegenden Bindegewebe befreit und schließlich ein ca. 6 mm langes Stück oberhalb der Bifurkation in den N. tibialis und den N. peroneus (fibularis communis) entfernt. Die entstandene Lücke wurde mit einem 13 bzw. 16 mm langem Silikon-Röhrchen überbrückt, um die Regeneration über lange Defektstrecken untersuchen zu können. Der proximale Nervenstumpf wurde durch Einziehen eines epineuralen Knopfheftes 2 mm tief in das Silikon-Röhrchen eingebracht und die Röhrchen wurden dann mit den entsprechenden Materialien befüllt. Dann wurde der distale Stumpf ebenfalls mittels Knopfheft 1 mm tief im
Die Tiere wurden gewogen, kurzzeitig mit CO2 betäubt und mit Chloralhydrat (370 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal narkotisiert. Während aller operativen Eingriffe wurden die Tiere auf eine Heizdecke gelegt, um ein Auskühlen zu verhindern. Zum Schutz vor dem Austrocknen der Augen wurden diese mit Bepanthen-Augensalbe bedeckt. Den Tieren wurde dann die linke Hinterextremität großzügig rasiert und mit 70 %igem Alkohol desinfiziert. Das Operationsfeld wurde mit steriler Inzisionsfolie abgeklebt. Die Operationen fanden mit Hilfe eines Operationsmikroskopes statt. Dabei wurde der linke N. ischiadicus freigelegt, indem die Haut parallel des Femurs über 2 - 3 cm mit einem Skalpell durchtrennt wurde und die Muskelbäuche des Musculus (M.) semitendinosus und des M. biceps femoris stumpf mit einer Metzenbaum-Schere und einer chirurgischen Pinzette voneinander getrennt wurden. Mit einer VANNAS-Mikroschere und Uhrmacherpinzetten (Dumont No.5) wurde der Nerv vom umliegenden Bindegewebe befreit und schließlich ein ca. 6 mm langes Stück oberhalb der Bifurkation in den N. tibialis und den N. peroneus (fibularis communis) entfernt. Die entstandene Lücke wurde mit einem 13 bzw. 16 mm langem Silikon-Röhrchen überbrückt, um die Regeneration über lange Defektstrecken untersuchen zu können. Der proximale Nervenstumpf wurde durch Einziehen eines epineuralen Knopfheftes 2 mm tief in das Silikon-Röhrchen eingebracht und die Röhrchen wurden dann mit den entsprechenden Materialien befüllt. Dann wurde der distale Stumpf ebenfalls mittels Knopfheft 1 mm tief im