Nanofasern

Es wurden insgesamt sechs Tiere mit den Nanofasern im Läsionsmodel der epineuralen Tasche implantiert, von denen drei Exemplare nach 1 Woche und die anderen drei Tiere nach 3 Wochen perfundiert wurden. Abbildung 3-21 zeigt das leere Epineurium während der Implantation nach dem Heraustrennen der Nervenfasern (A) und nach dem Einsetzen der Nanofasern (B). Nach 1 Woche war makroskopisch eine Volumenzunahme der Läsionsstelle erkennbar (C). Das umliegende Gewebe zeigte keine Veränderung.

Abbildung 3-21: Verlauf der Operation und der Regeneration im Modell der epineuralen Tasche.

Abbildung A zeigt den N. ischiadicus nach dem Heraustrennen der Nervenfasern aus dem Epineurium. Es ist die leere „Tasche“ erkennbar (Markierungen), die eine Länge von 5 mm hat. Abbildung B zeigt den Nerv nach dem Einsetzen des Faservlieses. Das Epineurium ist mit vier Nähten geschlossen worden. In Abbildung C ist der Nerv, 1 Woche nach der Implantation entnommen, gezeigt.

Abbildung 3-22: HE-gefärbte Schnitte der Nanofaser-implantierten Nerven nach 3 Wochen.

Das Faservlies ist als nur schwach gefärbte Struktur erkennbar (Pfeile). Die Abbildung zeigt einen Querschnitt durch den explantierten Nerv.

Das entnommene Gewebe wurde 10 µm dick gefriergeschnitten und zunächst HE-gefärbt (Abbildung 3-22). Das Faservlies ist nach 3 Wochen im Querschnitt erkennbar (Pfeile).

A B

A

C

Vereinzelt sind Zellkerne im Vlies sichtbar, dass heißt, es sind einige Zellen in das Vlies eingewachsen. Es sind keine gleichmäßigen, längsgerichteten Fasern erkennbar, wie sie im gesunden Nerv vorkommen. Außerdem sind sehr viele Zellkerne in der epineuralen Tasche vorhanden, was darauf schließen lässt, dass eine große Anzahl an Zellen in die Läsionsstelle eingewandert ist.

Daraufhin wurden immunhistochemische Färbungen der Schnitte angefertigt, um die vorhandenen Zellen eindeutig identifizieren zu können. Die Nanofasern wurden mithilfe des PolySia-spezifischen Antikörpers mAB 735 angefärbt und sollten unter dem Fluoreszenzmikroskop durch Verwendung des Alexa-555 Zweitantikörpers rot erscheinen.

Eventuell durch die Läsionsstelle gewachsene Axone wurden mittels anti-Neurofilament (NF)-Antikörper, Schwann-Zellen mit dem anti-S100-Antikörper angefärbt und Makrophagen, die bei einer Inflammation ausgelöst durch das Fremdmaterial aktiviert worden sein könnten, wurden mit Hilfe des anti-ED1-Antikörpers markiert. Diese Antikörper wurden mit dem Sekundärantikörper Alexa-488 sichtbar gemacht und erschienen daher grün.

Zusätzlich wurden in allen Schnitten die Zellkerne mit DAPI blau markiert.

Abbildung 3-23 zeigt die Färbungen der nach 1 Woche entnommenen Nerven. Die Nanofasern sind aufgrund der Eigenfluoreszenz des Vlieses eindeutig erkennbar (Pfeile). Eine spezifische Färbung mit dem mAB735-Antikörper war dagegen negativ (nicht gezeigt) so dass die PolySia, mit der die Fasern beschichtet waren, nicht nachgewiesen werden konnte.

Die Schwann-Zellen haben sich am Epineurium zusammengelagert (Abbildung B). Es wachsen vereinzelt Axone durch die Läsionsstelle (Abbildung C, D). Allerdings wachsen diese ebenfalls am Epineurium entlang und nutzen somit die Schwann-Zellen als Leitschienen und nicht die Fasern. Es ist außerdem erkennbar, dass rund um das Vlies die Anzahl an DAPI-markierten Zellkernen deutlich höher ist, als in der Peripherie (Abbildung A, C). Da diese Zellen S100-negativ sind, könnte es sich hierbei um Makrophagen handeln. Die Abbildungen B und D zeigen eindeutig, dass sowohl die Schwann-Zellen als auch die Axone nicht direkt am Faservlies entlang wachsen.

Abbildung 3-23: Nervenschnitte 1 Woche post OP.

Die Querschnitte der nach 1 Woche entnommenen Nerven zeigen die mit S100 markierten Schwann-Zellen (A) und durch die epineurale Tasche gewachsene Axone mittels NF-Färbung (C). In den Abbildungen B und D sind Längsschnitte gezeigt. Abbildung B zeigt die Schwann-Zellen, die sich zu Büngner-Bändern zusammengelagert haben (Pfeilspitzen). Das Faservlies ist anhand seiner Eigenfluoreszenz sichtbar (Pfeile). Abbildung D zeigt Axone (Pfeilspitzen), sowie ebenfalls das Faservlies daneben (Pfeile).

Die anti-ED1-Färbung (Abbildung 3-24 A) zeigt eine starke Aktivierung der Makrophagen um das Vlies. Das implantierte Material oder die Läsion scheinen eine inflammatorische Reaktion ausgelöst zu haben. Um auszuschließen, dass es sich bei den angefärbten Axonen nicht um Fasern handelt, die während der Entfernung des Nervengewebes vor der Implantation versehentlich übersehen wurden, wurde eine weitere Färbung durchgeführt.

Dabei wurde ein Antikörper verwendet, der gegen das Growth Associated Protein-43 (GAP-43) gerichtet ist, das spezifisch in Wachstumskegeln auswachsender Axone exprimiert wird.

Die Färbung der Axone mit diesem anti-GAP-43-Antikörper bestätigt, dass es sich bei diesen Axonen um neu auswachsende Neurone handelt (Abbildung 3-24 B).

A B

C D

A B

Abbildung 3-24: Makrophagen- und Axon-Färbung 1 Woche post OP.

Abbildung A zeigt aktivierte Makrophagen (Pfeilspitzen), durch ED1 markiert. Die GAP-43-Färbung in Abbildung B zeigt, dass es sich bei den die epineurale Tasche überbrückenden Axonen um neu ausgewachsene

handelt. Diese orientieren sich allerdings nicht am Vlies (Pfeile).

Abbildung 3-25 zeigt, dass 3 Wochen nach der OP in den Längsschnitten ebenfalls ein paar durch die Läsionsstelle gewachsene Axone vorhanden sind, die aber wieder am Epineurium anstatt an den Nanofasern entlang wachsen (Abbildung B). Die Makrophagen sind ebenfalls noch in großer Zahl vorhanden (Abbildung A), was darauf hindeutet, dass die Nanofasern eine Reaktion des Immunsystems ausgelöst haben.

Abbildung 3-25: Makrophagen- und Axon-Färbung 3 Wochen post OP.

Die anti-ED1-Färbung in Abbildung A zeigt eine große Anzahl an Makrophagen (Pfeilspitzen). Abbildung B zeigt die anti-Neurofilament-Färbung der nach 3 Wochen explantierten Nerven. Die Axone wachsen wieder nicht am Vlies (Pfeile) entlang.

Die verwendeten Nanofasern sind in dieser Form nicht biokompatibel, da durch das Material eine Immunreaktion ausgelöst wird. Daher nutzen die auswachsenden Axone nicht die Fasern

B A

A B

als Leitschienen, sondern das Epineurium. Des Weiteren konnte die PolySia auf den Fasern nicht nachgewiesen werden, da die immunhistochemische Färbung negativ war. Insofern konnte mit diesen Versuchen nicht geklärt werden, ob die PolySia nach einem Beobachtungszeitraum von 1 bzw. 3 Wochen stabil mit den Fasern assoziiert ist. Die Nanofasern sind daher in der verwendeten Form nicht als Nerveninterponat verwendbar.