2.5.1 Morphometrische Auswertung der Semidünnschnitte
Wenn die Nervenkabel so weit regeneriert waren, dass das Silikonröhrchen komplett durchwachsen war und die beiden Nervenstümpfe wieder miteinander verbunden waren, so wurde dies als makroskopische Regeneration gewertet. Diese Kabel, sowie die Autotransplantate in der 13 mm-Studie, wurden in Epon eingebettet, es wurden semidünne (1 µm) Querschnitte angefertigt und gefärbt wie unter Absatz 2.3.10 beschrieben. Um die Qualität dieser Regenerate zu überprüfen, wurde anschließend die Anzahl regenerierter, myelinisierter Axone an definierten Schnittpunkten gezählt. Abbildung 2-6 zeigt eine Übersicht über die analysierten Schnittpunkte in den einzelnen Studien. Um die Auswertung zu ermöglichen, wurden die Schnitte am Mikroskop mit angeschlossener Kamera bei 400-facher Vergrößerung mit dem Computerprogramm Cell^P® fotografiert. Da in dieser Vergrößerung nicht der gesamte Querschnitt auf ein Bild passte, wurden mehrere Einzelbilder mit der Programmfunktion „Multiple Image Alignment“ zusammengesetzt und als .tif-Datei abgespeichert. Die Auswertung erfolgte verblindet, um eine subjektive Beeinflussung durch den Untersucher zu verhindern. Außerdem wurde die gesamte Untersuchung vom gleichen Untersucher durchgeführt, um einen möglichen systemischen Fehler möglichst konstant zu halten.
Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Computersoftware AnalySIS-Pro® 3.1/3.2, die durch ein im Institut für Neuroanatomie entwickeltes Makro ergänzt wurde (TIMMER et al. 2003).
Alle Axone, die komplett myelinisiert waren, wurden mittels der Programmfunktion
„Zauberstab“ erfasst und als Partikel graphisch im Bild dargestellt. Mit der Funktion
„Partikelergebnisse“ konnte die Gesamtzahl myelinisierter Axone, deren Fläche in µm2 und Durchmesser in µm in einer Excel-Tabelle angezeigt werden. Aus diesen Werten wurde mithilfe des Computerprogramms GraphPad Instat 3.06 der Mittelwert für die Axonfläche
und den Durchmesser ermittelt. Außerdem wurde der Durchmesser des gesamten Nervenquerschnitts ausgemessen und daraus die Nervendichte berechnet. Dieser Wert gibt die Anzahl der Axone pro mm2 Nervenfläche an.
Abbildung 2-6: Schnittpunkte an den Nervenkabeln.
Gezeigt sind die Schnittpunkte für die 10 mm-Studie (A) und die 13 mm-Studie (B). In der Abbildung ist der proximale Stumpf links, der distale Stumpf ist rechts.
2.5.2 Bestimmung des g-ratio
Der g-ratio ist ein Maß für den Grad der Myelinisierung des Axons. Er errechnet sich aus dem Quotienten von Axondurchmesser und dem Durchmesser von Axon inklusive der Myelinscheide. Der ratio hat somit einen Wert zwischen Null und Eins. Je kleiner der g-ratio ist, desto besser ist die Myelinisierung. Einen optimalen Wert von 0,6 hat erstmals Rushton 1951 theoretisch berechnet (RUSHTON 1951).
Der g-ratio wurde ebenfalls mit dem Programm AnalySIS-Pro® 3.1/3.2 bestimmt. Um eine subjektive Auswahl der ausgewerteten Axone durch den Untersucher zu verhindern, wurde der Nervenquerschnitt in 100 x 100 µm große Quadrate aufgeteilt. In einem Quadrat wurden dann alle Axone vermessen und es wurden so viele Quadrate ausgezählt, bis mindestens 200 Axone vermessen wurden. Auch diese Auswertung erfolgte verblindet.
Da die Axone teilweise eine polygone Form aufwiesen, hätte dies den mittleren Durchmesser verfälscht. Daher wurde der Innendurchmesser als kreisäquivalenter Durchmesser anhand der folgenden Formel über die gemessene Axonfläche berechnet.
5mm 7,5mm
10mm
10mm
A
6,5mm
6mm 9,5mm 13mm distal
13mm
B
Formel 2-2: Berechnung des Innendurchmessers von Axonen
π Fläche messer
Innendurch =2⋅
Um den g-ratio zu bestimmen, wurde die Dicke der Mylinscheiden vermessen. Dieser Wert wurde zweimal zum Innendurchmesser addiert, um den Außendurchmesser zu erhalten.
Die Formel für den g-ratio berechnet sich daraus wie folgt.
Formel 2-3: Berechnung des g-ratios
) 2
(Innendurchmesser Myelindicke messer
Innendurch ratio
g
⋅ +
=
−
2.5.3 Auszählen der Überlebensrate PKH-GL 26-markierter Schwann-Zellen Die wie unter Absatz 2.3.11 beschrieben gefriergeschnittenen Präparate der PKH-GL26-markierten Implantate wurden am Fluoreszenz-Mikroskop möglichst zeitnah nach dem Eindeckeln bei 200-facher Vergrößerung ausgewertet. Dazu wurde der U-MNG-Filter (Anregungsspektrum 530 –550 nm, Sperrfilter > 570 nm) verwendet, bei dem die PKH-GL26-positiven Schwann-Zellen rot leuchteten. Die Kerne konnten mit dem U-MWU (Anregungsspektrum 330 – 385 nm, Sperrfilter > 420 nm) blau dargestellt werden. Es wurde jeder siebte Schnitt, bei dem ein durchgehendes Kabel vorhanden war, ausgewertet. Dabei wurde die Zellzahl auf 20 % der Schnittfläche mit Hilfe eines im Okular integrierten Zählrasters ausgezählt. Die PKH-GL26-positiven Schwann-Zellen innerhalb dieses Zählrasters wurden gezählt und im zweiten Filter verifiziert, es wurden nur PKH-GL26-positive Zellen gewertet, deren Zellkern im DAPI-Filter ebenfalls sichtbar war. Die Auswertung erfolgte erneut verblindet.
2.5.4 Auszählen der markierten DRGs/des markierten Rückenmarks
Die Cryoschnitte des retrograd markierten Rückenmark und der retrograd markierten DRGs (Absatz 2.3.12) wurden möglichst zeitnah nach dem Eindeckeln am Mikroskop ausgewertet.
Dabei wurden die DiI-positiven Motoneurone im Rückenmark und die DiI-positiven sensiblen Neurone in den DRGs am Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des Filter U-MNG mit
hat sein Anregungsmaximum bei 546 nm und sein Emissionsmaximum bei 563 nm (HONIG
and HUME 1986).
Bei den DRGs wurde zunächst für jedes DRG (L4 – L6) getrennt der erste Schnitt gesucht, bei dem deutlich DiI-positive Zellkörper erkennbar waren. Von diesem Schnitt ausgehend wurde jeder fünfte Schnitt bei 200-facher Vergrößerung ausgewertet. Dazu wurde die Gesamtzellzahl (GZZ) auf dem Schnitt ausgezählt. Aufgrund der starken Hintergrund-Färbung waren auch die unmarkierten Zellen größtenteils unter dem Filter erkennbar, ansonsten wurde die GZZ im Hellfeld festgestellt. Anschließend wurden die DiI-positiven Zellen gezählt und der prozentuale Anteil an der GZZ bestimmt.
Die Motoneurone konnten nicht prozentual ausgezählt werden, da es nicht möglich war, die GZZ auf diesen Schnitten zu bestimmen. Bei den Längsschnitten durch das Rückenmark wurde ebenfalls der erste bestimmt, auf dem DiI-positive Zellen zu erkennen waren und davon ausgehend wurde auf jedem fünften Schnitt die Anzahl an DiI-positiven Zellen bei 200-facher Vergrößerung ausgezählt. Die Auswertung erfolgte ebenfalls verblindet für die Versuchsbedingungen.