Es konnte bereits gezeigt werden, dass das Einwachsen von durchtrennten Axonen in die Rückenmarksläsion durch die Anwesenheit PolySia-sezernierender Astrozyten deutlich gesteigert wird (EL MAAROUF et al. 2006). Auch das Einbringen von Polysialyltransferase-überexprimierenden Schwann-Zellen in eine Rückenmarksquetschung führte zu einer schnelleren und besseren Remyelinisierung und somit zu einer verbesserten funktionellen Regeneration (PAPASTEFANAKI et al. 2007). In diesen beiden Studien wurde gezeigt, dass PolySia im ZNS eine permissive Umgebung für die Gliazellen schafft und dadurch die Regeneration fördert. Auch im PNS konnten Polysialyltransferase-exprimierende Schwann-Zellen in einem End-zu-Seit-Anastomose-Modell die Regeneration fördern, was durch einen erhöhten Faserdurchmesser, eine erhöhte Myelindicke und eine bessere funktionelle Regeneration gezeigt werden konnte (GRAVVANIS et al. 2005). Diese Ergebnisse zeigen die positiven Effekte von PolySia auf die Regeneration verletzter Nerven. Somit scheint die Entwicklung biohybrider Nerveninterponate mit PolySia als Gerüstsubstanz ein vielversprechender Ansatz zu sein. In einer in vitro-Studie konnte bereits gezeigt werden, dass exogene, gelöste PolySia das Überleben und die Proliferation von neuralen und Gliazellen nicht behindert (HAILE et al. 2007). Dies stimmt mit den Ergebnissen überein, die in den vorliegenden Studien gewonnen wurden. PolySia hat das Überleben der implantierten PKH-GL26-markierten Schwann-Zellen in eine 10 mm lange Defektstrecke nicht beeinflusst.
Durch die Implantation von PolySia und Schwann-Zellen konnte zudem die Anzahl
myelinisierter Fasern im Vergleich zu Matrigel-gefüllten Silikonröhrchen signifikant verbessert werden und auch die elektrodiagnostischen Messungen zeigten eine verbesserte motorische Regeneration in den PolySia-haltigen Transplantaten. Im Vergleich zum Autotransplantat waren die PolySia + SZ’-transplantierten Tiere jedoch über eine 13 mm lange Defektstrecke unterlegen. Allerdings bieten die Autotransplantate ein ideales Milieu für die regenerierenden Axone inklusive der Endo- und Perineurien der degenerierten Fasern.
Alternative Interponate sollten dementsprechend eine Leitstruktur bieten, an denen die Axone auswachsen können. Da dies in der vorliegenden Studie nicht der Fall war, sondern gelöste PolySia verwendet wurde, waren diese Interponate noch nicht ideal. In den Verhaltenstests schnitten die Tiere mit den Autotransplantaten jedoch nicht besser ab als die anderen Transplantationsgruppen. Da sowohl in den sensorischen als auch in den motorischen Tests keine Verbesserungen erkennbar waren, scheint es sich nicht um eine selektive Regeneration von einer bestimmten Fasergruppe gehandelt zu haben. Stattdessen wäre es möglich, dass durch die Autotransplantate zwar ein Auswachsen der Axone ermöglicht wird, jedoch viele Fasern fehlgerichtet wachsen. Somit kommt es nicht zu einer funktionellen Wiederherstellung, obwohl die Anzahl an regenerierten Axonen größer ist als in den anderen Gruppen. Es konnte bereits gezeigt werden, dass Motoneurone nach der Verletzung peripherer Nerven in der Lage sind, die PolySia-Expression hochzuregulieren und damit erfolgreich zu den Muskeln auszuwachsen (FRANZ et al. 2008). Man müsste also die Vorteile des Autotransplantates, das ideale Milieu inklusive Leitschienen, mit der Verwendung von PolySia zum zielgerichteten Wachstum kombinieren, um eine optimale funktionelle Regeneration zu erreichen. Aus diesem Grund wurden in weiteren Versuchen PolySia-basierte Nanomaterialien getestet. Die hohe Anzahl an Makrophagen 3 Wochen nach der Implantation deutet jedoch darauf hin, dass die verwendeten Nanofasern nicht biokompatibel sind. Zudem war es nicht möglich, die PolySia auf den Fasern nachzuweisen. Es kann dementsprechend keine Aussage darüber getroffen werden, ob die Fasern die PolySia stabil gebunden hatten.
Eine Aussage über mögliche Effekte von PolySia auf diesen Fasern ist ebenfalls nicht möglich. Es ist demzufolge notwendig, die Fasern dahingehend zu modifizieren, dass sichergestellt werden kann, dass sie PolySia auf ihrer Oberfläche tragen. Der Kern der Fasern muss ebenfalls ohne die Verwendung toxischer Substanzen hergestellt werden. Auf diese Weise produzierte Fasern müssten schließlich erneut getestet werden, um das Prinzip der Nanofasern zu etablieren. Auch über die Effekte der Nanopartikel kann aus den vorliegenden Ergebnissen keine eindeutige Aussage getroffen werden. Es scheint eine normale
Regeneration über den Beobachtungszeitraum von 3 Wochen im Nerven stattgefunden zu haben. Nach dieser Zeit waren noch Makrophagen in der Läsionsstelle erkennbar, ihre Anzahl war jedoch nicht sehr hoch. Es könnte sich deshalb auch um residente Zellen handeln, die physiologischerweise im Nerven vorkommen (VARGAS and BARRES 2007). Allerdings konnten die Partikel sowohl 3 Wochen nach der Implantation als auch direkt nach der Injektion in den gequetschten Nerv nicht lokalisiert werden. Darum ist es nicht möglich, eine Aussage über ihre Beteiligung an der Regeneration zu treffen und es sollten weitere PolySia-basierte Materialien getestet werden, um die optimale Applikationsform für die PolySia in einem idealen biohybriden Nerventransplantat zu bestimmen. Die Nanotechnologie bietet in dieser Hinsicht den Vorteil, dass die Materialien gut den Bedürfnissen angepasst werden können und ein hohes Oberflächen-Volumenverhältnis besitzen (KNOPP et al. 2009).
In einer kürzlich erschienenen in vitro-Studie wurden bereits Nanofasern aus einem PolySia-Polyethylenoxid-Gemisch gesponnen und das Überleben immortalisierter Schwann-Zellen darauf erfolgreich getestet (ASSMANN et al. 2010). PolySia-basierte Nanofasern sind somit eine mögliche Variante als Teil eines biohybriden Nerventransplantates.
Des Weiteren wurde ein PolySia-basiertes Hydrogel bereits in vitro getestet und zeigte keine negativen Effekte auf das Wachstum darauf kultivierter Schwann-Zellen sowie neuronaler Vorläuferzellen und sensorischer Neurone (HAILE et al. 2008) oder von PC12-Zellen (BERSKI
et al. 2008). Und auch PolySia-dotierte Kollagen-Matrices beeinträchtigten das Zellwachstum immortalisierter Schwann-Zellen sowie von PC12-Zellen nicht (BRUNS et al. 2007). In einer weiteren Studie konnten außerdem verschiedene Derivate der PolySia hergestellt werden, die sowohl weiter funktionalisiert als auch zu Polymeren weiterverarbeitet werden können (SU et al. 2010). Diese Moleküle bieten interessante Alternativen zur Herstellung weiterer PolySia-basierter Materialien. Zusätzlich konnte PolySia erfolgreich an silanisierten Glasoberflächen immobilisiert werden (STEINHAUS et al. 2010). All diese Ergebnisse zeigen verschiedene Möglichkeiten auf, wie PolySia als Teil eines biohybriden Nerventransplantates verwendet werden kann.
5 Zusammenfassung
Janett Kreth
Förderung der peripheren Nervenregeneration durch "Tissue engineering" - In vivo-Applikation von polySia-basierten Biomaterialien
Zur Überbrückung großer Defektstrecken peripherer Nerven mittels biohybrider Nerventransplantate sollte in der vorliegenden Arbeit Polysialinsäure (PolySia) als mögliche Gerüstsubstanz getestet werden. Der klinische Standard nach Verletzungen peripherer Nerven mit großem Substanzverlust, das autologe Transplantat, hat verschiedene Nachteile. Hierzu zählen der Verlust der Sensibilität an der Entnahmestelle des Spendernerven, eine Ungleichheit zwischen Spender- und Empfängernerv bezüglich der Größe und der Qualität der Fasern und eine zusätzliche Operation für den Patienten. Daher ist die Herstellung biohybrider Nerventransplantate mittels „Tissue engineering“ eine mögliche Alternative. Die Gerüstsubstanz sollte biokompatibel, permeabel und degradierbar sein. Zudem sollte das Gerüst mit Schwann-Zellen gefüllt sein und neurotrophe Faktoren bereitstellen. Um mögliche Effekte exogener PolySia auf die Nervenregeneration zu evaluieren, wurde in einer ersten Studie eine 10 mm lange Defektstrecke im N. ischiadicus adulter Ratten mittels Silikonröhrchen überbrückt. Diese waren mit gelöster PolySia, Schwann-Zellen oder PolySia und Schwann-Zellen gefüllt. Als Negativkontrolle dienten Matrigel-gefüllte Silikonröhrchen.
In einer zweiten Studie wurde eine 13 mm lange Defektstrecke entweder mit Silikonröhrchen, gefüllt mit PolySia, Schwann-Zellen oder PolySia und Schwann-Zellen, überbrückt und mit dem Autotransplantat verglichen. Es konnte in der 10 mm-Studie eine deutliche Verbesserung der histomorphometrischen Parameter in den PolySia-transplantierten Tieren festgestellt werden, sowie elektrodiagnostisch eine bessere funktionelle Regeneration. Die Ergebnisse der 13 mm-Studie zeigen jedoch, dass der Einsatz gelöster PolySia in einem Silikonröhrchen dem Autotransplantat unterlegen ist. Für ein ideales biohybrides Nerventransplantat ist eine Leitstruktur, die der extrazellulären Matrix ähnelt, nötig. Darum wurden in weiteren Versuchen PolySia-basierte Nanomaterialien auf ihre Biokompatibilität getestet. Die verwendeten Nanofasern lösten jedoch eine Immunreaktion im Gewebe aus und die Nanopartikel konnten nicht mehr im Tier nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit
konnte gezeigt werden, dass PolySia das Potential zur Gerüstsubstanz biohybrider Nerventrasplantate besitzt, eine Weiterentwicklung der Materialien ist jedoch notwendig, um für die klinische Anwendung geeignete Interponate zu bekommen.
6 Summary
Janett Kreth
Tissue-engineered approach to enhance peripheral nerve regeneration - in vivo application of polySia-based scaffolds
Biohybrid nerve transplants are a possibility to bridge long gaps in peripheral nerves.
Therefore polysialic acid (PolySia) was tested as scaffold material in this study. The clinical gold standard is the use of an autogenous nerve graft. However this has several drawbacks like a loss of function at the donor site, a mismatch in quality and size between donor and host tissue and an additional operation for the patient. Therefore the fabrication of biohybrid nerve transplants via the concept of tissue engineering may be an alternative. The scaffold material should be biocompatible, permeable and degradable. Additionally the transplant could be filled with Schwann cells and decorated with neurotrophic factors. To evaluate possible effects of exogenous PolySia we bridged a 10 mm gap in the sciatic nerve of adult rats with silicone tubes filled with soluble PolySia, Schwann cells or PolySia plus Schwann cells. As a negative control Matrigel-filled silicone tubes were used. In a second study, a 13 mm gap was bridged either with soluble PolySia, Schwann cells or PolySia plus Schwann cells and these conditions were compared to an autograft. In the 10 mm study enhanced regeneration concerning histomorphometrical parameters as well as electrodiagnostically measured functional recovery was found. However the results of the 13 mm study show that using silicone tubes filled with soluble PolySia is still inferior compared to an autograft. This shows clearly the need for a scaffold resembling the extracellular matrix. In additional experiments PolySia-based nanomaterials were tested for biocompatibility. Unfortunately the nanofibers used showed an immune response and the nanoparticles were undetectable in vivo.
With the present results it could be shown that PolySia is a candidate material for tissue engineering approaches in peripheral nerve repair. But the present nanomaterials have to be further developed to fit the needs for clinical applications.
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