In vivo Versuche in Mäusen

$$

%

&

''

p +R_min

Dabei entspricht [L]_tot der eingesetzten Konzentration an kaltem Lu·DTPA-NH₂ und p dem Hill-Koef-fizienten (Kurvensteigung). Um daraus eine von experimentellen Parametern unabhängige Gleichge-wichtskonstante (K_D) der Bindung von Lu·DTPA-NH₂ zu ermitteln, wurde die Cheng-Prusoff-Glei-chung (Cheng & Prusoff, 1973) angewandt:

K_D = IC₅₀ 1+

[ ]

EC₅₀

[L*] entspricht hier der konstanten Konzentration der radioaktiven Komponente im Verdrängungsex-periment und EC50 (Effective Concentration) der halb-maximalen Sättigungskonzentration der radio-aktiven Komponente im Fall des direkten Bindungsexperiments (ohne Kompetition).

2.7 In vivo Versuche in Mäusen

2.7.1 Pharmakokinetische (PK) Studien

Zur Bestimmung der Plasma-Halbwertszeit von unmodifizierten und PASylierten Fusionsproteinen wurden je Proteinkonstrukt insgesamt neun weibliche BALB/c Mäuse (Gewicht: 18-20 g) verwendet.

Die Proteininjektion erfolgte in die Schwanzvene (ohne vorherige Betäubung der Versuchstiere) in einer Dosis von 5 mg Protein in PBS je kg Körpergewicht bezogen auf den Anteil des unmodifizierten Proteins. Typischerweise wurde bei einer Maus mit 20 g ein Injektionsvolumen von ca. 100 μL mit einer 1 mg/mL Lösung des unmodifizierten Proteins eingesetzt. Im Fall des PASylierten Proteins wur-de die Konzentration wur-der Proteinstammlösung entsprechend wur-der größeren Molekülmasse erhöht.

Die insgesamt neun Mäuse wurden in drei Gruppen (N = 3) aufgeteilt, wobei allen Mäusen einer Gruppe zum gleichen Zeitpunkt Blut über die Schwanzvene entnommen wurde. Dies erfolgte in der Regel nach 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h, 24 h, 36 h und 48 h (Gruppe 1: 0,5 h, 2 h, 6 h, 24 h; Gruppe 2: 1 h, 4 h, 8 h, 36 h; Gruppe 3: 3 h, 12 h, 48 h). Dabei wurde 20-100 μL Blut entnom-men, aus dem durch Zentrifugation (13.000 rpm, 4 °C, 20 min) das Blutplasma zwecks anschließender Bestimmung der Test-Proteinkonzentration mittels quantitativem ELISA (siehe Abschnitt 2.3.9) abge-trennt wurde.

Zur Bestimmung der Plasma-Halbwertszeit wurden die ermittelten Proteinkonzentrationen gegen die Probenahmezeitpunkte aufgetragen. Die Kurvenanpassung zur Beschreibung des zweiphasigen Kon-zentrationsabfalls erfolgte mit dem Programm WinNonlin v6.1 (Pharsight, St. Louis, MO) gemäß der Gleichung:

c(t) = A ! e

+ B ! e

Dabei ist c(t) die Proteinkonzentration im Blutplasma (in nM) in Abhängigkeit von der Zeit t (in h) nach der Injektion, A der relative Achsenabschnitt (in nM) sowie α die kinetische Konstante (in h^-1) in der Verteilungsphase, während B und β den jeweiligen Parametern in der Eliminierungsphase entspre-chen. Weitere wichtige pharmakokinetische Parameter, wie die Area Under the Curve (AUC; in h⋅nM) sowie die Clearance (CL; in mL⋅h^-1⋅kg^-1) konnten dabei ebenfalls bestimmt werden.

2.7.2 Positronen-Emissions-Tomographie (PET)

Weiblichen CD1 Nacktmäusen (Alter: 6-8 Wochen) ohne Thymus (Charles River Laboratories, Sulz-feld) wurden 5 Mio. CEA-exprimierende LS-174T Zellen (Tom et al., 1976) in DMEM subkutan in die rechte Schulter injiziert, so dass sich in der Regel nach 10 Tagen ein solider Tumor (Gewicht: 100-300 mg) bildete.

Den Mäusen (N = 3) wurden dann unter Isofluran-Anästhesie 100 μL 5,6-7,1 MBq ¹²⁴I markiertes Pro-tein (T84.66-CL31d sowie dessen PASylierte Versionen; Spezifische Aktivität von Na¹²⁴I:

~1.1 MBq/pmol; siehe Abschnitt 2.5.2) in 100 μL HTT-Puffer in die Schwanzvene injiziert. Zur Be-rechnung der tatsächlich injizierten Dosis wurde die Radioaktivität der Spritzen vor und nach der In-jektion (in Bq) mit Hilfe eines CRC-15R Dosiskalibriergeräts (Capentic, Ramsey, New York) be-stimmt. Nach 4 h, 24 h bzw. 48 h wurden von jeder Maus unter Isofluran-Narkose für je 40 min dyna-mische Bilder in einem Inveon Kleintier-PET/CT Scanner (Siemens Medical Solutions, Erlangen) auf-genommen. Nach iterativer Rekonstruktion der Daten mit Hilfe des Algorithmus 3D-OSEM (3D Or-dered-Subsets Expectation Maximum Algorithm) wurden die Bilder zur Quantifizierung der prozentual injizierten Dosis pro Organgewicht (% ID/g) im geräteeigenen Inveon Research Workplace v4.2 Pro-gramm (Siemens Medical Solutions, Erlangen) analysiert. Zum besseren direkten Vergleich des Tu-mor/Hintergrund-Verhältnisses wurden die Bilder – dargestellt als Maximum Intensity Projection (MIP) – auf ein ähnliches Intensitätssignal im Tumor skaliert. Diese Experimente wurden in der Nu-klearmedizin am Klinikum Rechts der Isar, München durchgeführt.

2.7.3 Biodistributionsanalyse

Die spezifische Tumoranreicherung radioaktiv markierter Proteine oder Liganden (5,6-7,1 MBq ¹²⁴ I-markiertes T84.66-CL31d; Spezifische Aktivität von Na¹²⁴I: ~1.1 MBq/pmol sowie dessen PASylierte Versionen bzw. 1,0-1,3 MBq ¹²⁵I-markiertes T84.66-PAS(400)-CL31d; Spezifische Aktivität von Na¹²⁵I: 74 MBq/nmol und 3,3-7,3 MBq ¹⁷⁷Lu⋅DTPA-NH₂ oder (¹⁷⁷Lu⋅DTPA)₂; Spezifische Aktivität von ¹⁷⁷Lu: 131 MBq/mol; siehe Abschnitte 2.5.1 und 2.5.2) wurde 48 h nach Injektion in die Schwanz-vene durch quantitative Biodistributionsanalyse untersucht. Die Mäuse (N = 3) wurden dazu in einer CO₂-gesättigten Kammer eingeschläfert und die Organe in folgender Reihenfolge entnommen und in 20 mL γ-Zähler Messdöschen (Perkin Elmer LAS, Rodgau) überführt: Blut, Herz, Lunge, Schilddrüse, Tumor, Leber, Pankreas, Milz, Magen (entleert), Dünndarm (entleert), Dickdarm (entleert), Niere, Ne-benniere, Muskel, Knochen, Haut, Schwanz und Hirn. Nach Bestimmung der Organgewichte auf einer Feinwaage wurde die Radioaktivität des jeweiligen Organs im Wallac 1480 Wizard 3'' γ-Zähler quan-tifiziert. Den Organen im γ-Zähler vorangestellt wurden fünf Radioaktivitätsstandards, welche zur Umrechnung der Zerfälle pro Minute (cpm) — als Ausgabe des γ-Zählers — in Bq dienten. Diese wurden hergestellt, indem der Inhalt einer Spritze mit radioaktiv markiertem Protein (siehe Abschnitt 2.7.2) in 100 mL H₂O verdünnt und davon je 1 mL (1 %) in ein Messdöschen pipettiert wurde. Der prozentuale Anteil der injizierten Dosis (% ID) ergab sich aus der Differenz der auf den Zeitpunkt t₀ (Zeitpunkt der ersten Proteininjektion) nach folgender Formel normierten Radioaktivität der Spritzen vor und nach der Injektion

R

(t

) = R

! e

ln(2)

!_1/2!t

wobei R_n(t₀) der zerfallskorrigierten Radioaktivität (in MBq) normiert auf den Zeitpunkt t₀, R_t der Ra-dioaktivität einer Spritze vor bzw. nach der Injektion zum Zeitpunkt t, sowie τ_1/2 der Zerfallshalbwerts-zeit des Radionuklids entspricht. Diese normierte Radioaktivität wurde zudem um die bei der Injektion in die Schwanzvene verbliebene Radioaktivität korrigiert. Um den prozentualen Anteil der injizierten Dosis pro Gramm Organ (% ID/g) zu erhalten, wurde die % ID durch das Gewicht des jeweiligen Or-gans geteilt.

2.7.4 Autoradiographische Analyse von Gewebeschnitten

Die Verteilung der Radioaktivität innerhalb eines Organs wurde durch die autoradiographische Analy-se von Gewebeschnitten visualisiert. Dazu wurde direkt nach der Entnahme aus einem Versuchstier einer Mausgruppe (vgl. Abschnitt 2.7.2) das jeweilige Gewebe (Tumor bzw. Leber) mit Tissue-Tek Einbettmedium (Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn) überschichtet und auf Trockeneis bis zum Er-starren gelagert. Der Gewebeblock wurde dann in ein Kryo-Mikrotom CM1950 (Leika Biosystems, Nussloch) eingespannt. Im Anschluss wurden aus verschiedenen Bereichen des Organs ca. 10 μm dün-ne Schnitte abgetragen und auf eidün-nen Glas-Objektträger transferiert. Dieser Objektträger wurde in einer Fotokassette zusammen mit einer Phosphor Screen GP Digital Imaging Bildplatte (beides

East-man Kodak, Rochester, NY) über Nacht inkubiert. Die Intensität der durch die Strahlung des Iod-Ra-dioisotops erzielten Schwärzung des fotographischen Films wurde in dem laseroptischen Densitometer CR 35 BIO (Raytest Isotopenmessgeräte, Straubenhardt) mit einer internen Auflösung von 25 μm digitalisiert.

2.7.5 Computer-Programme und Datenbanken

Für die Analyse von DNA-Sequenzen sowie zur Planung von Oligonukleotidsequenzen wurde das Programm ApE (A plasmid Editor v1.17, M. Wayne Davis) verwendet. Zur Analyse von Proteinse-quenzen stand das am Lehrstuhl von Prof. Skerra entwickelte Programm ANTICALIgN zur Verfügung (Jarasch et al., 2016). Die Berechnung der Molekülmasse bzw. weiterer physikalischer und chemi-scher Parameter eines Proteins wie z.B. des molaren Extinktionskoeffizienten erfolgte mit Hilfe des ProtParam-Algorithmus (Gasteiger et al., 2003) auf dem ExPASy Server (www.expasy.org).

Die Visualisierung und Analyse von dreidimensionalen Proteinstrukturen wurde mit dem Programm Chimera v1.9 und den implementierten Funktionen durchgeführt (Pettersen et al., 2004). Proteinkri-stallstrukturinformationen wurden aus der Protein Data Bank (PDB; http://www.rcsb.org/pdb) bezo-gen. Chemische Strukturformeln wurden im Programm ChemDraw Ultra 8.0 (CambridgeSoft Corp., Cambridge, MA) gezeichnet.

Die Steuerung von Geräten und Apparaturen sowie die anschließende Datenauswertung erfolgte durch herstellereigene Programme:

SPR-Spektroskopie: BIAevaluation v4.1 (GE Healthcare, Freiburg) CD-Spektroskopie: Spectra Manager v1.53.05 (Jasco, Groß-Umstadt) ESI-MS: Compass Data Analysis v4.0 (Bruker Daltonics, Bremen) Durchflusszytofluorimetrie: FlowJo v8.8.6 (Tree Star, Ashland, OR) Fluoreszenzmikroskopie: AxioVision v4.8 (Carl Zeiss Microscopy, Jena)

Dünnschichtchromatographie (radioaktiv): PEARL & LauraLite (LabLogic, Sheffield) Biodistribution: Inveon Research Workplace v4.2 (Siemens Medical Solutions, Erlangen) Pharmakokinetische Studien: WinNonlin v6.1 (Pharsight, St. Louis, MO)

Die graphische Auswertung und Umsetzung der erhaltenen Daten erfolgte anschließend mit dem Pro-gramm KaleidaGraph v4.02 (Synergy Software Inc. Reading, PA).

SDS-PAGE Gele wurden digitalisiert und mit Hilfe des Programms Adobe Photoshop CS4 v11.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, CA) in Kontrast und Helligkeit optimiert. Abbildungen beste-hend aus mehreren Teilabbildungen wurden im Programm Adobe Illustrator CS4 v14.0.0 (Adobe Sy-stems Inc., Mountain View, CA) erstellt.

Wissenschaftliche Literatur wurde aus der Pubmed Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) bezogen.