Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Der ELISA wurde sowohl zum Nachweis der Bindungsaktivität von gereinigten Anticalinen und Anti-calin-Fusionsproteinen als auch zur Quantifizierung von Proteinen in Plasmaproben verwendet. Dabei kamen zwei verschiedene Formate zum Einsatz – ein indirekter und ein Sandwich-ELISA – die beide ein Me·DTPA-Doppelkonjugat bestehend aus dem Trägerprotein RNase (Fluka Chemie, Buchs, Schweiz) gekoppelt mit Y·DTPA und dem Steroid Digoxigenin (DIG) verwendeten (Kim et al., 2009).

Zur Herstellung dieses Konjugats wurde 183 nmol RNase in 1 mL Natriumhydrogencarbonat pH 8,3 (> 99,9 %) gelöst und nach Zugabe von 915 nmol (5-fach molarer Überschuß) p-SCN-Bn-CHX''-A-DTPA (SCN-p-SCN-Bn-CHX''-A-DTPA; Macrocyclics, Dallas, TX) in 10 μL DMF über Nacht bei 4 °C rollend inkubiert.

Anschließend wurde 366 nmol DIG-NHS gelöst in 20 μL DMF zugegeben und für 1 h bei RT inku-biert. Durch Gelfiltration an einer PD-10 Säule wurde das Konjugat in 100 mM Ammoniumacetat/Es-sigsäure pH 5 (> 99,9 %) umgepuffert, wobei gleichzeitig überschüssige Reagenzien abgetrennt wur-den. Die Beladung des Chelators mit einem Metall erfolgte durch Zugabe einer äquimolaren Lösung von YCl3 oder LuCl3, ebenfalls gelöst in 100 mM Ammoniumacetat/Essigsäure pH 5, und 10-minüti-ger Inkubation bei RT. Bis zur Verwendung wurde das beladene Doppelkonjugat bei -80 °C aufbe-wahrt. Im ELISA wurde Y·DTPA-RNase-DIG schließlich durch ein DIG-spezifisches Fab-AP-Konju-gat nachgewiesen, dessen enzymatische Aktivität (siehe unten) zur Quantifizierung der

Bindungsakti-vität zwischen den Anticalinen bzw. Anticalin-Fusionsproteinen und dem Metallchelat-Liganden ver-wendet wurde.

Nachweis der Bindungsaktivität von Anticalinen und deren Fusionsproteinen im indirekten ELISA Für die Bestimmung der Affinität für den Me·DTPA-Komplex wurden die Vertiefungen einer Mikroti-terplatte (MaxiSorp; 96-Vertiefungen) mit jeweils 50 μL einer 2,5 μg/mL Lösung des Strep-tag II-bin-denden Antikörpers StrepMAB-Immo beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden verbliebene Bindungsstellen in den Vertiefungen mit 200 μL einer 3 % (w/v) BSA-Lösung in PBS/0,1T abgesättigt, und nach 1 h bei RT wurde 5-mal mit je 300 μL PBS/0,1T im ELISA-Platten-wascher gespült. Je Vertiefung wurde dann 50 μL des gereinigten Anticalins bzw. Anticalin-Fusions-proteins in einer Konzentration von 100 nM in PBS/0,1T appliziert, für 1 h bei RT inkubiert und die Platte wie oben gewaschen. Eine Verdünnungsreihe von Y·DTPA-RNase-DIG wurde hergestellt, in-dem je Vertiefung 50 μL PBS/0,1T vorgelegt und dazu 50 μL Y·DTPA-RNase-DIG pipettiert wurden.

Nach sorgfältigem Mischen wurden davon wieder 50 μL entnommen und in die darauffolgende Ver-tiefung überführt, so dass auf diese Weise iterativ weitere 1:1 Verdünnungsstufen entstanden. Nach einstündiger Inkubation bei RT wurde die Platte gewaschen und zum Nachweis gebundener Ligand-Konjugate in jede Vertiefung 50 μL des DIG-bindenden Fab-AP-Konjugats (1:1000 in PBS/0,1T) pi-pettiert. Nach 1 h bei RT wurde die Platte erst wie oben mit PBS/0,1T und dann mit PBS gewaschen, bevor 100 μL einer 0,5 mg/mL p-Nitrophenylphosphat (pNPP)-Lösung in AP-Puffer zugegeben wur-de. Nach 3-minütiger Inkubation bei 37 °C wurde die enzymatische Hydrolyse des farblosen pNPP zum gelben p-Nitrophenolat bei einer Wellenlänge von 405 nm in dem ELISA-Photometer Spectra-Max 250 (Molecular Devices, Biberach a.d. Riss) für 15 min bei 37 °C verfolgt, wobei vor jeder mi-nütlichen Messung die Platte für 3 s linear geschüttelt wurde.

Nachweis der bispezifischen Bindungsaktivität von Duocalinen im Sandwich-ELISA

Die Fähigkeit von Duocalinen zur simultanen Bindung zweier unterschiedlicher Liganden wurde in einem Sandwich-ELISA nachgewiesen. Dazu wurde in jede Vertiefung einer MaxiSorp-Platte mit 96-Vertiefungen 50 μL des gereinigten Fibronektin-Fragments Fn7B8-His₆ – nachfolgend als Fn7B8 be-zeichnet (Gebauer et al., 2013) – in einer Konzentration von 50 μg/mL in TBS gegeben und für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach Blockieren jeder Vertiefung mit 200 μL 3 % (w/v) BSA in TBS/0,1T wurde die Platte wie oben mit TBS/0,1T gewaschen, bevor analog zum indirekten ELISA 50 μL einer Verdünnungsreihe des Duocalins für 1 h bei RT appliziert wurde. Durch Waschen mit TBS/0,1T wurden ungebundene Proteine entfernt, und daraufhin wurde in jede Vertiefung 50 μL der 100 nM Y·DTPA-RNase-DIG-Lösung in TBS/0,1T pipettiert, die für 1 h bei RT inkubiert wurde. Der Nachweis des gebundenen Metallchelat-Konjugats erfolgte anschließend analog zum indirekten ELI-SA.

Bestimmung der apparenten Dissoziationskonstante K_D mittels ELISA

Für die beobachtete Protein⋅Ligand-Komplexbildung wurde eine einfache monovalente Gleichge-wichtsreaktion angenommen. Die gemessene Anfangsgeschwindigkeit der Farbreaktion (ΔA/Δt) aus dem indirekten ELISA wurde gegen die jeweilige Ligandenkonzentration der Verdünnungsstufe [L]_tot aufgetragen und unter Verwendung des Programms KaleidaGraph (Synergy Software Inc. Reading, PA) die Dissoziationskonstante K_D nach der Gleichung

P!L

[ ]

[ ]

[ ]

K_D+

[ ]

durch nicht-lineare Regression bestimmt (Voss & Skerra, 1997). Dabei entspricht die Konzentration des Protein·Ligand-Komplexes [P·L] indirekt der enzymatischen Aktivität der Alkalischen Phospha-tase, während die konstante Gesamtkonzentration des immobilisierten Proteins [P]_tot – dem asymptoti-schen Maximalwert ΔA/Δt entsprechend – durch Kurvenanpassung ermittelt wurde.

Bestimmung der Plasma-Konzentration von therapeutischen Proteinen durch quantitativen Sandwich-ELISA

Zur Untersuchung der pharmakokinetischen Parameter von unmodifizierten und PASylierten Antica-lin-Fusionsproteinen war die Bestimmung der entsprechenden Proteinkonzentrationen in Plasmapro-ben der Maus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Proteininjektion erforderlich (siehe Abschnitt 2.7.1). Dazu wurde ebenfalls das oben beschriebene Sandwich-ELISA Format verwendet, um selektiv das intakte funktionelle Fusionsproteine nachzuweisen.

Im Fall der Duocalin-Varianten wurde in jede Vertiefung einer MaxiSorp-Platte mit 96-Vertiefungen 50 μL Fn7B8 mit einer Konzentration von 50 μg/mL in TBS-E gegeben und für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach Blockieren mit 200 μL 3 % (w/v) BSA in TBS-E/0,1T wurden die Vertiefungen wie oben mit TBS-5/0,1T gewaschen, und anschließend in 50 μL eine Verdünnungsreihe der bereits im Verhältnis 1:200 in TBS/0,1T verdünnten Plasmaproben (siehe Abschnitt 2.7.1) für 1 h bei RT inkubiert. Nach einem Waschschritt mit TBS/0,1T wurde 50 μL einer 100 nM Y·DTPA-RNase-DIG-Lösung in TBS/0,1T in die Vertiefungen gegeben. Der Inkubation für 1 h bei RT folgte ein weiterer Waschschritt sowie der Nachweis des gebundenen Metallchelat-Komplexes mit Hilfe von 50 μL des DIG-bindenden Fab-AP-Konjugats (1:1000 in TBS/0,1T), das ebenfalls für 1 h bei RT in-kubiert wurde. Die Farbreaktion erfolgte wie bereits beim indirekten ELISA beschrieben.

Zur Untersuchung der scFv/Anticalin-Fusionsproteine wurde 50 μL einer 2,5 μg/mL Lösung des re-kombinanten CEA (Sino Biological, Beijing, China) in TBS auf einer MaxiSorp-Platte immobilisiert.

Die Vertiefungen wurden mit 200 μL 3 % (w/v) BSA in TBS/0,1T blockiert und mit TBS/0,1T wie oben gewaschen, bevor 50 μL eine Verdünnungsreihe der bereits im Verhältnis 1:200 in TBS/0,1T verdünnten Plasmaproben (siehe Abschnitt 2.7.1) für 1 h bei RT appliziert wurden. Der weitere Nach-weis der scFv/Anticalin-Fusionsproteine erfolgte danach analog zu den Duocalin-Varianten.

In beiden Fällen wurde je MaxiSorp-Platte ebenfalls eine Verdünnungsreihe des jeweiligen gereinig-ten Fusionsproteins – versetzt mit 0,5 % (v/v) Plasma von unbehandelgereinig-ten Mäusen – angesetzt, um mit Hilfe der daraus resultierenden Standardkurve auf die Proteinkonzentration in den Plasmaproben schließen zu können. Dazu wurde mit Hilfe der Kurvenanpassung obiger Gleichung an die Daten-punkte des jeweiligen Standardproteins der K_D-Wert sowie [P]_tot ermittelt, um nach Umformung der-selben Gleichung zu

[ ]

[

]

[ ]

[

]

die Konzentration des in der jeweiligen Plasmaprobe enthaltenen Anticalin-Fusionsproteins [L]_tot zu errechnen.