Produktion und funktionelle Charakterisierung von scFv/Anticalin-Fusionsproteinen

Im Hinblick auf die Anwendung des scFv/Anticalin-Fusionsproteins in der Radiodiagnostik/-therapie CEA-positiver Tumore sollten mit Hilfe der PASylation-Technologie – wie schon für die

bispezifi-schen Duocaline (siehe Abschnitt 3.2) – Varianten mit unterschiedlicher Molekülgröße und Plasma-Halbwertszeit generiert werden. Auf diese Weise kann die Akkumulation des Proteins im Tumor op-timiert werden (Mendler et al., 2015). Zu diesem Zweck wurden PAS-Polypeptide verschiedener Län-ge (200 und 400 AS) zwischen den beiden Bindeproteinen als Linker einLän-gefügt. Aus dem Vektor pNGAL98-N7A-CL31d zur periplasmatischen Produktion eines Duocalins (siehe Abschnitt 3.2.1) wurde zunächst der Genabschnitt für das Anticalin N7A durch die Restriktionsenzyme XbaI und SapI entfernt und dafür das ebenfalls mit XbaI und SapI geschnittene DNA-Fragment für das scFv T84.66 inseriert (Abbildung 34). Dieser Genabschnitt war dazu mittels PCR unter Verwendung der Oligodes-oxynukleotide D20 und EE50_rev sowie der Taq DNA-Polymerase aus dem Expressionsvektor pASK75-T84.66-CL31 (siehe Abschnitt 3.3.3) amplifiziert worden. Dabei wurde am 3'-Ende des scFv T84.66 die kurze Nukleotidsequenz 3'-TCG AGA AGT CGG-5' angefügt, welche eine SapI-Schnitt-stelle beinhaltet. Diese SapI-SchnittSapI-Schnitt-stelle diente nachfolgend zur Insertion von PAS-Genkassetten für 200 bzw. 400 Aminosäuren. Die Sequenzen der konstruierten Vektoren wurden mittels DNA-Sequen-zierung überprüft (siehe Abschnitt 2.2.5.7).

Abbildung 34. Konstruktion von periplasmatischen Expressionsvektoren für T84.66-PAS(n)-CL31d. Die zwi-schen den Genabschnitten von scFv T84.66 und CL31d gelegene SapI-Restriktionsschnittstelle diente zur anschlies-senden Insertion von PAS-Polypeptiden mit n = 200 bzw. 400 Aminosäuren.

Die periplasmatische Sekretion der Fusionsproteine erfolgte entweder in mit dem jeweiligen Vektor transformierten TG1-F^--Zellen bei OD₅₅₀ = 2,0 im 2 L-Maßstab oder in E. coli W3310 im 8 L-Labor-fermenter (siehe Abschnitt 2.3.1.2). Dabei konnte in der SDS-PAGE der Gesamtzellextrakte von Pro-ben vor und nach Induktion der Proteinproduktion mit aTc jeweils die Bildung einer Produktbande beobachtet werden (Abbildung 35). Wie für PASylierte Proteine charakteristisch, zeigte sich auch hier eine erheblich verminderte elektrophoretische Mobilität der Proteine im Vergleich zu ihrer kalkulier-ten Molekülmasse (Tabelle 14), was auf eine verminderte Bindung von SDS als Triebkraft der elektro-phoretischen Trennung zurückzuführen ist (Schlapschy et al., 2013).

SapI

3. Isolierung des Fragments mit 842 bp 1. XbaI / SapI

Abbildung 35. SDS-PAGE der bakteriellen Produktion von T84.66-CL31d mit verschiedenen PAS-Linkern. Un-tersucht wurde der Gesamtzellextrakt der mit dem entsprechenden Plasmid transformierten TG1-F^- Zellen vor (Spur 1) sowie nach (Spur 2) Induktion der Proteinproduktion bei OD550 = 2,0 und eine Probe des Periplasma-Extrakts (Spur 3) von T84.66-PAS(200)-CL31d sowie von T84.66-PAS(400)-CL31d (entsprechend für Spuren 4-6). Die Pfeile markie-ren die jeweils relevante Proteinbande.

Nach Präparation des periplasmatischen Extrakts (Abbildung 35, Spur 3 bzw. 6) wurden die PASylier-ten scFv/Anticalin-Fusionsproteine in Analogie zu T84.66-CL31 ohne PAS-Linker zunächst durch Strep-Tactin-Affinitätschromatographie isoliert und anschließend durch AEX gereinigt (nicht gezeigt).

Mit dem letzten Schritt wurde gleichzeitig das bakterielle Endotoxin aus den Proteinproben abgerei-chert, welches als pyrogener Bestandteil der äußeren Bakterienmembran bei in vivo Experimenten un-erwünscht ist (Lee et al., 2002). Zur biochemischen Charakterisierung wurden die gereinigten Fusi-onsproteine abschließend einer analytischen SEC sowie einer SDS-PAGE unterzogen (Abbildung 36).

Abbildung 36. Untersuchung von T84.66-CL31d sowie seiner zwei PASylierten Varianten mit analytischer SEC und SDS-PAGE. (A) Nach Isolierung der scFv/Anticalin-Fusionsproteine mit Hilfe des Strep-tag II Affinitätsanhäng-sels wurde das jeweilige SA-Eluat einer AEX unterzogen und anschließend durch SEC mit einer in PBS äquilibrierten

116,0 66,2

25,0 35,0 45,0

kDa M 1 2 3 4 5 6

18,4

116,0 66,2

25,0 35,0 45,0

kDa M 1 2 3

18,4 14,4

A B

V₀ 1 2

1 2 3

nicht-reduzierend reduzierend

Superdex 200 10/300 GL Säule (Bettvolumen: 24 mL) untersucht. Standardproteine: 1 = BSA (66 kDa), 2 = Carboan-hydrase (29 kDa); V0 = Ausschlussvolumen der Säule. (B) SDS-PAGE von CL31d (Spur 1), T84.66-PAS(200)-CL31d (Spur 2) und T84.66-PAS(400)-CL31d (Spur 3) nach der SEC.

Alle drei Proteine zeigten in der Gelfiltration ein homogen monodisperses Verhalten (Abbildung 36A). Das Elutionsvolumen von T84.66-PAS(200)-CL31d betrug 11,6 mL entsprechend einer appa-renten Molekülmasse von 213 kDa (Tabelle 14). Damit wurde das hydrodynamische Volumen durch den PAS(200)-Linker um den Faktor 3,3 im Vergleich zur kalkulierten Masse von 65 kDa vergrößert.

Für T84.66-PAS(400)-CL31d mit einer berechneten Masse von 81,5 kDa wurde ein Elutionsvolumen von 10 mL (= 437 kDa) und damit ein Vergrößerungsfaktor von 5,4 beobachtet. Das Fusionsprotein T84.66-CL31d ohne PAS-Linker eluierte dagegen bei einem der berechneten Masse entsprechendem Volumen von 15,0 mL (= 46 kDa). Die SDS-PAGE der drei Fusionsproteine unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen bestätigte die Homogenität der Präparationen (Abbildung 36B).

Des Weiteren wurde die Affinität der drei scFv/Anticalin-Fusionsproteine für ihre beiden Liganden und dabei der Einfluss des PAS-Polypeptids bestimmt (Tabelle 13). Die durch das Anticalin CL31d vermittelte Bindung an den für die späteren in vivo Versuche relevanten Lu·Chelat-Komplex wurde auf einem mit ca. 240 RU Lu·DTPA-RNase derivatisierten Sensorchip mittels SPR-Spektroskopie quantifiziert. Dazu wurde eine Konzentrationsreihe des jeweiligen Fusionsproteins in PBS/0,05T über den Sensorchip geleitet, und die kinetischen Parameter wurden durch Kurvenanpassung an das 1:1 Langmuir-Komplexbildungsmodell bestimmt (siehe Abschnitt 2.4.1). Die so ermittelte Assoziations-konstante k_on blieb für das Fusionsprotein mit PAS(200)-Linker im Vergleich zu T84.66-CL31d prak-tisch erhalten und war für T84.66-PAS(400)-CL31d nur wenig erniedrigt (Tabelle 13). Ursache hierfür ist vermutlich die verlangsamte Diffusion des Proteins in die Dextran-Matrix des Sensorchips als Fol-ge des vergrößerten hydrodynamischen Volumens. Zudem hatte der PAS-Linker überraschenderweise einen verlangsamenden Effekt auf die Dissoziationskinetik. Mit zunehmender PAS-Länge wurde eine Erniedrigung von k_off registriert (2-fach für PAS(200)-CL31d bzw. 5-fach für T84.66-PAS(400)-CL31d). Als mögliche Erklärung kommt ein negativer Einfluss des scFv T84.66 auf die Dissoziation der Fusionsproteine von Lu·DTPA-RNase in Frage, dessen Effekt durch Vergrößerung des Molekülabstands zum Anticalin abgeschwächt wird. In Folge dessen wurde der K_D-Wert von 4,9 ± 0,1 nM für das unmodifizierte Fusionsprotein auf 1,23 ± 0,02 nM für das Fusionsprotein mit dem PAS(400)-Linker erniedrigt.

Tabelle 13. Bindungseigenschaften von T84.66-CL31d sowie seiner PASylierten Versionen für Lu⋅DTPA-RNase sowie CEA ermittelt durch SPR-Spektroskopie bzw. Durchflusszytofluorimetrie.

Lu·DTPA-RNase CEA

k_on [10⁶ M^-1 s^-1]

k_off [10^-6 s^-1]^a

K_D [nM]^b

K_D [nM]

T84.66-CL31d 0,105 ± 0,001 517 ± 1,39 4,9 ± 0,1 1,40 ± 0,38 T84.66-PAS(200)-CL31d 0,106 ± 0,001 246 ± 1,34 2,31 ± 0,03 13 ± 1 T84.66-PAS(400)-CL31d 0,089 ± 0,001 110 ± 1,01 1,23 ± 0,02 22 ± 2

a Ermittelt aus einer Dissoziationszeit von 1500 s. ^b K_Dberechnet aus k_off/k_on.

Die Affinität der scFv/Anticalin-Fusionsproteine zum CEA wurde, wie schon in Abschnitt 3.3.4 erläu-tert, auf HT-29 Karzinomzellen mittels Durchflusszytofluorimetrie bestimmt (Tabelle 13). Die PASy-lierten Proteinvarianten zeigten ein von der Proteinkonzentration abhängiges sigmoidales Verhalten in der experimentell bestimmten Fluoreszenzintensität, wie es auch schon für T84.66-CL31 beobachtet wurde (vgl. Abbildung 33). Mit zunehmender PAS-Länge wurde eine Verringerung der Affinität für CEA beobachtet (T84.66-PAS(200)-CL31d um den Faktor 9,5 auf 13 ± 1 nM; T84.66-PAS(400)-CL31d um den Faktor 15,8 auf 22 ± 2 nM). Trotz der abgeschwächter Komplexbildung der PASylier-ten Fusionsproteine mit CEA auf den HT-29 Zellen liegt die Affinität nach wie vor im unteren nano-molaren Bereich und ist damit für eine in vivo Anwendung ausreichend.

3.3.6 Bestimmung der Plasma-Halbwertszeit von scFv/Anticalin-Fusionsproteinen in der