Konstruktion von Duocalinen mit PAS-Linkern unterschiedlicher Länge

Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Duocaline N7A-CL31d und N7A-PAS(100)-CL31d im Vergleich zu den isolierten Anticalinen ähnliche Ligandenbindungseigenschaften aufweisen, bot sich die Konstruktion von Duocalinen mit deutlich längeren PAS-Linkern an. Die damit einhergehende Verlängerung der Plasma-Halbwertszeit (Schlapschy et al., 2013) sollte zu einer erhöhten Akkumula-tion des Proteins im Tumor führen, was im Hinblick auf ihren Einsatz im Bereich der nuklearmedizi-nischen Diagnostik/Therapie vorteilhaft erscheint.

Da eine hohe Bindungsaktivität für das tumorassoziierte Antigen (hier ED-B) zusätzlich von Vorteil für die Tumorakkumulation des Proteins ist, wurde statt N7A die affinitätsmaturierte Variante N7A.19 (= N7A(H40R/D47Y/Q128R/S87D)) in das Duocalin integriert. Diese weist mit einem K_D-Wert von 50 pM eine 100-fach höhere Affinität für ED-B auf (Mendler et al., unveröffentlicht). Eine einfache Subklonierung der BstXI-Kassette von N7A.19 auf dem Expressionsvektor pASK75-T7RBS-N7A-CL31d (siehe Abschnitt 3.2.4) war aufgrund der zusätzlichen BstXI-Erkennungssequenz im CL31d-Gen jedoch nicht möglich. Daher wurden die Mutationen für N7A.19 sukzessiv durch QuikChange-Mutagenese mit den Primern CM1/CM1_as, CM4/CM4_as, CM10/CM10_as sowie CM14/CM14_as in das N7A-Genfragment auf dem Vektor pASK75-T7RBS-N7A-CL31d eingeführt und mittels

Se-quenzanalyse verifiziert. Der für CL31d-codierende Genabschnitt wurde zudem auf genetischer Ebene optimiert, indem das seltene Arg-Codon AGG an den Positionen 70 und 72 durch QuikChange-Mutagenese mit dem Primerpaar EE39_for/EE39_rev jeweils durch das häufiger auftretende Basen-triplett CGC ersetzt wurden. Im Anschluss an diese Mutageneschritte wurde der erhaltene Duocalin-Expressionsvektor durch Restriktionsverdau mit SapI linearisiert und mit der Genkassette für das PAS-Polypeptide der Länge 200, welche aus dem Vektor pCR2.1-PAS#1.2(200)duoSapI (erhalten von Uli Binder, XL-protein) präpariert worden war, ligiert. Da während dieser Ligierung auch Genkassetten miteinander verknüpft werden, wurden hierbei auch Duocalin-Versionen mit PAS-Polypeptiden der Länge 400 and 600 erhalten.

N7A.19-CL31d sowie die PASylierten Varianten dieses Duocalins wurden im Cytoplasma von E. coli Origami B im 2 L-Maßstab bei 30 °C produziert, wobei bei Erreichen von OD₅₅₀ = 1,0 die Induktion der Genexpression für 4 h erfolgte. Danach zeigte sich in der SDS-PAGE des Gesamtzellextrakts eine Produktbande, die im Fall der Duocaline mit PAS-Linker verglichen mit der berechneten Proteinmasse eine geringere elektrophoretische Mobilität aufwies (Abbildung 25). Grund dafür ist eine durch die PAS-Sequenz verminderte Bindung der negativ geladenen SDS-Moleküle, was die Triebkraft der Elektrophorese verringert (Schlapschy et al., 2013). Die Zellen wurden im PANDA-Homogenisator aufgeschlossen und die Zelltrümmer sowie unlösliche Proteine durch Zentrifugation abgetrennt. Der überwiegende Anteil der Duocaline befand sich in löslicher Form im Überstand (Abbildung 25A) und wurde durch SA-Chromatographie vom Großteil der Wirtszellproteine getrennt.

Abbildung 25. Cytoplasmatische Produktion und Reinigung des Duocalins N7A.19-CL31d mit PAS-Linkern unterschiedlicher Länge. (A) SDS-PAGE der Produktion von N7A.19-PAS(400)-CL31d in Origami B-Zellen vor (Spur 1) und nach (Spur 2) Induktion sowie des unlöslichen (Spur 3) und löslichen (Spur 4) Proteinanteils nach dem mechanischen Zellaufschluss. (B) Auf die SA-Chromatographie folgte eine AEX in 20 mM CHES/NaOH pH 9,5 an einer Resource Q Säule, bei der weitere Verunreinigungen von N7A-PAS(400)-CL31d durch einen linearen NaCl-Gradienten separiert werden konnten. Inset: SDS-PAGE der Hauptfraktionen unter nicht-reduzierenden Bedingungen.

(C) Nach einer weiteren AEX in 20 mM Tris/HCl pH 7,5, die zur Abtrennung von Disulfidisomeren diente, erfolgte eine analytische SEC an einer Superdex 200 HR 10/30 in PBS. V0 = Ausschlussvolumen der Säule. (D) Vergleichende SDS-PAGE der Duocaline N7A.19-CL31d (Spur 1), N7A.19-PAS(200)-CL31d (Spur 2), N7A.19-PAS(400)-CL31d (Spur 3) und N7A.19-PAS(600)-CL31d (Spur 4) nach der SEC.

Zur weiteren Reinigung wurden die Duocaline einer Anionenaustauschchromatographie (AEX) bei pH 9,5 unterzogen (Abbildung 25B). Dabei werden die Wechselwirkungen mit den quartären Ammo-niumgruppen der Säulenmatrix offenbar hauptsächlich durch das Anticalin CL31d mit pI 6,5 vermit-telt, da das Duocalin insgesamt einen leicht basischen pI-Wert von 8,9 aufweist. Die Duocalin-Varianten wurden unabhängig von der PAS-Länge in einem linearen NaCl-Konzentrationsgradienten bei ca. 80 mM in einem scharfen symmetrischen Peak eluiert und so effizient von weiteren Verunrei-nigungen getrennt. Generell ermöglicht die AEX auch eine Abreicherung des negativ geladenen

Endo-1

toxins (Lipopolysaccharid; LPS), eines Bestandteils der Zellwand Gram-negativer Bakterien (Lee et al., 2002). Das Entfernen von Endotoxin bei der Präparation von Proteinwirkstoffen ist notwendig, da es im Versuchstier oder später im Menschen Fieber auslösen („Pyrogen) bzw. eine Immunreaktion hervorrufen kann (Heumann & Roger, 2002). Zur Abtrennung nicht-physiologischer Disulfidisomere, die in der SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen als schwache Banden der AEX-Haupt-fraktionen sichtbar waren (Abbildung 25B), wurden die Duocaline einer zweiten AEX unterzogen.

Dabei wurde der Puffer 20 mM Tris/HCl pH 7,5 verwendet, wodurch die Isomere auf der Säulenma-trix zurückgehalten wurden, wohingegen das korrekt gefaltete Duocalin im Durchlauf der Chromato-graphie erschien.

In der analytischen SEC zeigte N7A.19-CL31d eine im Vergleich zur berechneten Masse leicht redu-zierte apparente Molekülmasse von 37 kDa (Tabelle 11), was vermutlich auf seine nicht globuläre Form zurückzuführen ist. Demgegenüber wiesen die PASylierten Duocaline in Abhängigkeit von der Länge des PAS-Linkers ein vergrößertes hydrodynamisches Volumen auf (Abbildung 25C). Im Fall des Duocalins mit dem PAS(600)-Linker wurde eine 7-fache Volumenvergrößerung beobachtet (Tabelle 11). Alle vier produzierten Duocalinversionen lagen damit als reine monomere Spezies vor, wie auch durch SDS-PAGE bestätigt wurde (Abbildung 25D).

Der Einfluss der PAS-Länge auf die Bindungsaktivität der Duocaline für die Liganden ED-B und Y⋅DTPA wurde mittels SPR-Spektroskopie untersucht (Tabelle 10). Dabei nahm die Affinität für Fn7B8 mit steigender Linkerlänge – vor allem bedingt durch eine langsamere Assoziationskinetik – ab. Nichtsdestotrotz weist das Duocalin mit dem längsten PAS-Linker, N7A.19-PAS(600)-CL31d, immer noch eine hohe Bindungsaktivität gegenüber Fn7B8 (K_D = 686 pM) auf . Die Affinität für Y⋅DTPA-RNase wurde mit zunehmender PAS-Länge ebenfalls vermindert; hier führte aber sowohl die Verlangsamung der Komplexbildung als auch die Beschleunigung der Dissoziation gleichermaßen zur Reduktion der Bindungsaktivität.

Tabelle 10. Einfluss der Länge des PAS-Linkers auf die Bindungskinetik des Duocalins für die Liganden Y·DTPA-RNase und ED-B ermittelt durch SPR-Spektroskopie.

Y·DTPA-RNase Fn7B8