Funktionelle Produktion rekombinanter Proteine in E. coli

2.3.1.1 Anzucht, Induktion und Ernte von E. coli-Kulturen im Schüttelkolben Produktion im Periplasma von E. coli

Zur bakteriellen Produktion von Lcn2 bzw. Anticalinen und scFv T84.66 sowie der unmodifizierten und PASylierten Anticalin-Fusionsproteine T84.66-CL31 und des Duocalins N7A-CL31 wurden Ex-pressionsvektoren verwendet, auf denen das jeweilige Strukturgen mit dem Gen für die bakterielle Signalsequenz des OmpA (Outer Membran Protein A) fusioniert vorlag. Die durch die OmpA-Signal-sequenz vermittelte Translokation des rekombinanten Proteins in das oxidierende Milieu des periplas-matischen Raums ermöglicht die Ausbildung von Disulfidbrücken und damit die korrekte Faltung der Proteine. Durch selektive Permeabilisierung der äußeren Membran unter Komplexierung zweiwertiger Ionen mittels EDTA kann die Periplasmafraktion gewonnen werden, während die Sphäroplasten durch die hypertonen Bedingungen – mit der im Aufschlusspuffer enthaltenen hohen Konzentration an Sac-charose – stabilisiert werden (Skerra, 1989).

50 mL LB/Amp-Medium (Medium versetzt mit 100 mg/L Ampicillin) wurde mit einer Einzelkolonie der E. coli-Stämme JM83 oder TG1-F^- (siehe Abschnitt 2.1.1), die zuvor mit dem entsprechenden Plasmid transformiert worden waren (siehe Abschnitt 2.2.2), beimpft und über Nacht bei 30 °C und 200 rpm kultiviert. Danach wurde 2 L LB/Amp-Medium im Verhältnis 1:50 mit der stationären Über-nachtkultur angeimpft, bei 22 °C und 200 rpm geschüttelt und die Genexpression nach Erreichen von OD₅₅₀ = 0,5 durch Zugabe von 200 μL aTc (2 mg/mL) für 3 h induziert. Insbesondere bei der Produk-tion von Lcn2 bzw. Anticalinen konnte eine signifikante Erhöhung der Proteinausbeute durch Induk-tion der Genexpression bei OD₅₅₀ = 2,5 erzielt werden. Dazu wurde 2 mL LB/Amp-Medium in einem

13 mL-Kulturröhrchen mit einer Einzelkolonie eines mit dem entsprechenden Vektor transformierten E. coli-Stammes inokuliert und für 6-8 h bei 37 °C und 200 rpm geschüttelt. 2 L LB/Amp-Medium wurde dann mit 1 mL der Vorkultur beimpft und die Zellen über Nacht bei 22 °C und 200 rpm kulti-viert, so dass typischerweise am nächsten Morgen bei OD₅₅₀ = 2,5 die Genexpression, wie oben be-schrieben, induziert werden konnte. Die Induktionsdauer betrug hier 5 h. Die E. coli-Kultur wurde durch Zentrifugation (F10-4x1000 LEX, 5000 rpm, 4 °C, 15 min) geerntet, das Kulturmedium verwor-fen und noch vorhandene Restflüssigkeit sorgfältig mit einer Pipette abgezogen.

Zur Präparation der periplasmatischen Zellfraktion wurde das Sediment in 20 mL (nach Induktion bei OD₅₅₀ = 0,5) bzw. 40 mL (nach Induktion bei OD₅₅₀ = 2,5) eiskaltem Periplasma-Aufschlusspuffer zü-gig resuspendiert und für 30 min bei 4 °C rollend inkubiert, bevor die Sphäroplasten durch Zentrifuga-tion abgetrennt wurden (Sigma 4K15, 4420 g, 4 °C, 15 min). Der Überstand wurde einem weiteren Zentrifugationsschritt unterzogen (SS-34, 17.000 rpm, 4 °C, 15 min), woraufhin der nun geklärte Peri-plasma-Extrakt über Nacht bei 4 °C gegen das 100-fache Volumen SA-Puffer (siehe Abschnitt 2.1.9) dialysiert wurde. Unmittelbar vor der Reinigung der rekombinanten Proteine mittels Streptavidin-Affi-nitätschromatographie (siehe Abschnitt 2.3.2) wurde der Extrakt sterilfiltriert (0,45 μm).

Produktion im Cytoplasma von E. coli

Zur Produktion von ChromoCalinen und Duocalinen (mit oder ohne PAS-Linker) wurde der E. coli-Stamm Origami B (siehe Abschnitt 2.1.1) eingesetzt, der durch Mutationen in den Genen für die Thio-redoxin-Reduktase (trxB) und die Glutathion-Reduktase (gor) über ein weniger reduzierendes Milieu im Cytoplasma verfügt, so dass die Ausbildung von strukturellen Disulfidbrücken ermöglicht wird.

Origami B-Zellen wurden mit dem entsprechenden Expressionsvektor transformiert, 50 mL 2xYT/Amp-Medium mit einer Einzelkolonie inokuliert und die Kultur für 16 h bei 37 °C und 200 rpm geschüttelt. 40 mL dieser stationären Vorkultur wurden in 2 L vorgewärmtes 2xYT/Amp-Medium überführt und die Zellen bis OD₅₅₀ = 0,5 (ChromoCaline) bzw. OD₅₅₀ = 1 (Duocaline) bei 30 °C und 200 rpm kultiviert. Durch Einstellen der Induktorkonzentration auf 200 μg/L aTc wurde die Genex-pression für 4-5 h induziert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation (F10-4x1000 LEX, 5000 rpm, 4 °C, 15 min) sedimentiert, das Kulturmedium dekantiert und die Zellen nach kurzem Käl-teschock (15 min, -20 °C) für die Streptavidin-Affinitätschromatographie (siehe Abschnitt 2.3.2) in 20 mL SA-Puffer resuspendiert. Der mechanische Zellaufschluss erfolgte im PANDA Zellhomogeni-sator (GEA Niro Soavi, Parma, Italien) bei kontinuierlichem Fluß für 5 min bei 1500 bar, wobei die Probe durch eine Rückflußkühlung auf 4 °C temperiert wurde. Nach Abtrennung von Zelltrümmern durch Zentrifugation (SS-34, 17.000 rpm, 4 °C, 30 min) wurde der Zellextrakt sterilfiltriert (0,45 μm) und sofort zur chromatographischen Reinigung eingesetzt.

Zur Analyse der Proteinproduktion in Abhängigkeit von der Induktionsdauer wurden Gesamtzellex-trakte zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Zellkultivierung präpariert. Dazu wurde jeweils 1 mL der Kultur zentrifugiert (Eppendorf 5415R, 13.200 rpm, 4 °C, 2 min) und der Überstand sorgfältig abge-zogen. Nach Resuspendieren der Zellen in 80 μL Benzonase-Lösung (12,5 U/mL in

Benzonase-Puf-fer) und Zugabe von 20 μL 5x reduzierenden Auftragspuffer für die SDS-PAGE (siehe Abschnitt 2.3.5) wurde die Probe für 1 h bei 4 °C inkubiert und nach Hitzebehandlung (95 °C, 5 min) mittels SDS-PAGE analysiert.

2.3.1.2 Anzucht, Induktion und Ernte von E. coli-Kulturen im Laborfermenter

Vor allem für in vivo Experimente wurden größere Mengen eines rekombinanten Proteins benötigt, die durch ein diskontinuierliches Fermentationsverfahren von E. coli im 8 L-Maßstab hergestellt wurden (Schiweck & Skerra, 1995). Dabei wurden die Bakterienzellen in einem Mineralsalzmedium kulti-viert, dem Ammoniak als Stickstoff- und Glucose als Kohlenstoffquelle zugesetzt wurde, und durch Kontrolle der Temperatur, des pH-Wertes und des Sauerstoffpartialdrucks homöostatische Wachs-tumsbedingungen eingestellt.

Als Vorvorkultur wurde 2 mL LB/Amp-Medium mit einer frisch transformierten Einzelkolonie ange-impft und für 8 h bei 37 °C und 200 rpm inkubiert. Eine Vorkultur bestehend aus 360 mL Mineralsalz-medium, 40 mL 20 % (w/v) Glucose, 4 mL 1 M MgSO₄, 400 µL Antibiotika-Stammlösung und 400 μL Thiamin-Stammlösung wurde im Verhältnis 1:1000 mit der Vorvorkultur beimpft und für 24-26 h bei 30 °C und 200 rpm geschüttelt. Typischerweise betrug die Zelldichte der stationären Vorkul-tur OD₅₅₀ = 1,5-2,0. Für die Hauptkultur wurde ein 10 L-Kulturgefäß mit Rühreinheit mit 7 L Mineral-salzmedium autoklaviert und über einen Trichter mit 800 mL 20 % (w/v) Glucose, 80 mL 1 M MgSO₄, je 8 mL Antibiotika- sowie Thiamin-Stammlösung, je 4 mL FeCl₃- und Zn-Acetat-Lö-sung, 10 mL Spurenelement-Lösung sowie 1-2 mL 30 % (v/v) Antifoam A befüllt. Das Medium wur-de zunächst durch Druckluft begast und wur-dem Sauerstoffpartialdruck vor Inokulation mit wur-der Vorkultur der relative Wert „100 %“ zugeordnet. Im Verlauf der Fermentation wurde eine ausreichende Versor-gung der Kultur mit Sauerstoff durch gesteuerte Begasung mit Druckluft und reinem Sauerstoff ge-währleistet. Ein konstanter pH-Wert ergab sich durch gesteuerte Titration von 12,5 % (w/v) Ammo-niak-Lösung. Mit Hilfe eines Wasserbades wurde das Medium auf 25 °C temperiert und unter Rühren (470 rpm) mit 400 mL der stationären Vorkultur angeimpft. Nach typischerweise 12-14 h Kultivie-rungszeit hatten die Zellen die exponentielle Wachstumsphase erreicht, ab der die Kohlenstoffversor-gung durch Zudosierung von 50 % (w/v) Glucose gewährleistet wurde, welche ab OD₅₅₀ = 7,5 mit 14 mL/h, ab OD₅₅₀ = 12,5 mit 20 mL/h, ab OD₅₅₀ = 18,5 mit 30 mL/h und ab OD₅₅₀ = 22,5 mit 40 mL/h erfolgte. Weiterhin wurden der Kultur bei OD₅₅₀= 13 nochmals je 4 mL FeCl₃- bzw. Zn-Stammlösung und 10 mL der Spurenelement-Lösung zugesetzt. Bei einer Zelldichte von OD₅₅₀ = 20 wurde die Gen-expression durch Zugabe von 800 μL 5 mg/mL aTc induziert und die Kultivierung für ca. 2,5 h fortge-setzt. Zur Zellernte wurde die Kultur zunächst auf 4 °C gekühlt und dann zügig durch Zentrifugation (H-6000 A und F10-4x1000 LEX, 5000 rpm, 4 °C, 25 min) sedimentiert.

Zur Präparation des Extrakts wurde die gesamte Zellmasse in vorgekühltem Periplasma-Aufschlusspuffer in einem Volumen von 2 mL L^-1 OD^-1 zunächst mit den Händen grob zerkleinert und für 10 min bei 4 °C unter Rühren bis zur vollständigen Homogenisierung inkubiert, und dann die

Zell-suspension auf 15 mM EDTA (0,5 M EDTA-Stammlösung pH 8) und 250 μg Lysozym/mL (20 mg/mL Lysozym-Stammlösung in Aufschlusspuffer) eingestellt und für weitere 20 min gerührt.

Die grobe Abtrennung der Sphäroplasten erfolgte in einem ersten Zentrifugationsschritt (SLA-1500, 11.500 rpm, 4 °C, 25 min), dem sich ein zweiter, sowie bei Bedarf, ein dritter Zentrifugationsschritt anschloss.

Für die folgende Affinitätschromatographie an Streptavidin-Sepharose (siehe Abschnitt 2.3.2) wurde der gesamte geklärte Extrakt bei 4 °C unter Rühren 3x gegen 5 L SA-Puffer dialysiert und vor dem Säulenauftrag durch Filtration (0,45 μm) von ausgefallenem Protein und anderen Partikeln befreit.