In-vitro-Versuche zum Vergleich der Rezeptorexpression auf Spinalganglien bei

3. Material und Methoden

3.4. In-vitro-Untersuchungen

3.4.2. In-vitro-Versuche zum Vergleich der Rezeptorexpression auf Spinalganglien bei

3.4.2.1. Funktionelle Rezeptoruntersuchungen an murinen Spinalganglienneuronen verschiedener Mausstämme mittels Ca²⁺-Influx Messungen

Die Messungen wurden, wie in 3.4.1.2. beschrieben, an Spinalganglienneuronen von jeweils vier BALB/c-, CD-1- und C57BL/6-Mäusen durchgeführt. Analog zu den 3.3. beschriebenen In-vivo-Versuchen in 3.3.1. wurde hier der Fokus auf den H2/4R-Agonisten 4-Methylhistamin gelegt. Tabelle 21 zeigt die für diesen Versuch verwendeten Stimuli.

Tabelle 21: Stimuli für die Ca²⁺-Influx-Messungen und ihre eingesetzten Konzentrationen Stimulanz Zielstruktur Konzentration

4-Methylhistamin H2R, H4R 0,1 mmol/l

Histamin H1R, H2R,

H3R, H4R

1 mmol/l

Capsaicin TRPV1 1 µmol/l

AITC TRPA1 1 µmol/l

Die Konzentrationen wurden nach Angaben in der Literatur verwendet oder aus früheren Versuchen abgeleitet (ROSSBACH et al. 2011; FUKUYAMA et al. 2017). AITC = Allyisothiocyanat

Material und Methoden

55 3.5. Statistische Auswertung

Die Ergebnisse der In-vivo-Versuche wurden mittels Kastengraphik (Boxplots) mit Median, oberem/unterem Quartil und Minimum/Maximum angegeben. Diese Antennen stellen in diesem Fall die minimalen und maximalen Werte der Untersuchungsergebnisse dar. Die statisitsche Auswertung erfolgte mit GraphPadPrism (Version 7, GraphPad Software Inc.).

Hierbei wurde davon ausgegangen, dass die Stichproben nicht normalverteilt sind (Stichprobenartige Tests der Versuchsergebnisse auf Normalverteilung mittels D-Agostino-Pearson omnibus normality test und Shapiro-Wilk normality test). Daraus ergab sich die Anwendung des nicht parametrischen Kruskal-Wallis-Tests und als Post-hoc-Test der ebenfalls nicht parametrische Mann-Whitney-U-Test.

Die Einzelwerte zu den durchgeführten Versuchen befinden sich in den Tabellen im Anhang.

Die reaktiven Zellen der Ca²⁺-Influx-Messungen wurden als Prozent der Gesamtneurone dargestellt. Eine statistische Auswertung der Inhibition wurde mittels des Exakten Test nach Fisher durchgeführt.

Bei allen Versuchen wurde hierbei ein Signifikanzwert (p) von unter 0,05 als statistisch signifikantes Ergebnis gewertet. P-Werte von 0,05 bis 0,09 wurden als Werte mit Tendenz zur Signifikanz angesehen und in der Post-hoc-Analyse weiterhin berücksichtigt.

Bei multiplen Vergleichen erfolgte keine Berechnung der Korrektur nach Bonferroni.

Ergebnisse

4. Ergebnisse

4.1. In-vivo-Versuche

4.1.1. Kratzverhalten nach intradermaler 4-Methylhistamin-Injektion bei vier unterschiedlichen Mausstämmen

Zunächst wurde das Kratzverhalten von zwei Inzuchtstämmen (BALB/c, C57BL/6) und zwei Auszuchtstämmen (NMRI, CD-1) nach intradermaler Gabe verschiedener Mengen von 4-Methylhistamin (4-MH) untersucht (Abb.8). In NMRI- und BALB/c-Mäusen konnte kein signifikanter Anstieg des Kratzverhaltens im Vergleich zu der Kontrollgruppe (NaCl) in applizierten Mengen von bis zu 500 nmol/50 µl ausgelöst werden. In BALB/c-Mäusen zeigte sich nach Injektion von 500 nmol/50 µl eine tendenzielle Erhöhung der Anzahl der Kratzattacken im Vergleich zur Kontrollgruppe. Eine Erhöhung der Injektionsmenge auf 1 µmol/50 µl führte zu einem signifikanten Anstieg der Kratzantwort (siehe Anhangstabellen). CD-1-Mäuse zeigten ab einer Menge von 500 nmol/50 µl einen signifikanten Anstieg des Kratzverhaltens, C57BL/6-Mäuse bereits ab 100 nmol/50 µl.

Weiterhin ist erkennbar, dass sich bei 5 und 50 nmol/50 µl die CD-1-Mäuse im Vergleich zu den anderen Mäusen signifikant mehr kratzten. Aufgrund der Ergebnisse wurde der CD-1-Auszuchtstamm für die weiteren Juckreizversuche genutzt. Zusätzlich wurden einige Teilversuche mit dem C57BL/6-Inzuchtstamm durchgeführt.

Ergebnisse

Abbildung 8: Dosis-Wirkungsbeziehung des 4-methylhistamininduzierten Juckreizes vergleichend bei BALB/c-, C57BL/6-, NMRI- und CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. DarstellungmittelsKastengraphikenmit unteren(25%)/ oberen(75%) QuartilenundMinimum/Maximum; n = 4 – 6 pro Gruppe. Die angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf ein intradermal appliziertes Injektionsvolumen von 50 µl; N/A = nicht untersucht. Die mit * angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige NaCl-Gruppe; die mit " * " angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die Anzahl der Kratzattacken der CD-1-Mäuse im Vergleich zu denen der anderen untersuchten Mausstämme: ***p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). KWT = Kruskal-Wallis-Test.

a N

200 C57BL/6 (KWT: p = 0,0004)

BALB/c (KWT: p = 0,0165)

Ergebnisse

4.1.2. Dosis-Wirkungsbeziehung verschiedener Histaminrezeptor-Agonisten bei CD-1-Mäusen

Zur Bestimmung der im weiteren Verlauf der Studie zu verwendenden Dosierungen wurde für die eingesetzten Histaminrezeptor-Liganden eine Dosis-Wirkungs-Beziehung an sechs bis acht Wochen alten CD-1-Mäusen ermittelt (Abb. 9). Histamin zeigte ab einer Menge von 25 nmol/50 µl einen signifikanten Anstieg des Kratzverhaltens im Vergleich zur Kontrollgruppe. 2-Pyridylethylamin zeigte erst ab einer Injektionsmenge von 1 µmol/ 50 µl einen signifikanten Anstieg. HTMT und 4-MH zeigten ab 50 nmol/50 µl einen signifikanten Anstieg. Sowohl ST-1006 als auch Amthamin zeigten einen signifikanten Anstieg des Kratzverhaltens bereits ab 10 nmol/50 µl. Die aus diesen Versuchen ermittelten Dosierungen, die in den weiteren Untersuchungen verwendet wurden, sind Tabelle 22 zu entnehmen.

Tabelle 22: Ermittelte Dosierungen der Histaminrezeptor-Agonisten für die weitere Verwendung Substanz Angesprochene Rezeptoren Applizierte Menge in nmol/50 µl

Histamin H1R, H2R, H3R, H4R 25

HTMT H1R, H2R 100

2-Pyridylethylamin H1R 1000

4-Methylhistamin H2R, H4R 50

ST-1006 H4R 50

Ergebnisse

Abbildung 9: Untersuchungen zum Kratzverhalten nach intradermaler Gabe verschiedener Histaminrezeptor-Liganden in unterschiedlichen Konzentrationen bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 6 pro Gruppe. Die angegebenen Mengen beziehen sich auf ein Injektionsvolumen von 50 µl. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige NaCl-Gruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test).

KWT = Kruskal-Wallis-Test.

Ergebnisse

4.1.3. In-vivo-Untersuchungen zur Transmission des über den H4R induzierten Juckreizsignals im Mausmodell

4.1.3.1. Einfluss von TRP-Kanal-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz

4.1.3.1.1. Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 auf histamininduzierten Juckreiz Die intraperitoneale Vorbehandlung mit dem TRPA1-Inhibitor HC-030031 zeigte bei einer Dosierung von 60 mg/kg einen hemmenden Effekt auf den durch Histamin ausgelösten Juckreiz (Abb. 10).

Abbildung 10: Einfluss verschiedener Dosierungen des TRPA1-Inhibitors HC-030031 auf den histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe (10 % DMSO): *** p < 0,001; ** p < 0,01;

* p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). A.: Kratzverhalten nach Histamin-Applikation (25 nmol/50 µl, i.d.) nach systemischer (i.p.) Vorbehandlung mit verschiedenen Dosierungen des TRPA1-Inhibiors HC-030031; n = 5 – 6 pro Gruppe. B.: Inhibition von histamininduziertem (25 nmol/50 µl, i.d.) Juckreiz durch HC-030031 (60 mg/kg, i.p.); n = 7 pro Gruppe.

Ergebnisse

4.1.3.1.2. Einfluss des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf histamininduzierten Juckreiz Die intraperitoneale Vorbehandlung mit dem TRPV1-Inhibitor Capsazepin zeigte sowohl bei einer Dosierung von 4 mg/kg als auch 6 mg/kg einen signifikant hemmenden Effekt auf den durch Histamin ausgelösten Juckreiz (Abb. 11).

Abbildung 11: Einfluss verschiedener Dosierungen des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe (10 % DMSO): *** p < 0,001; ** p < 0,01;

* p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). A. Inhibition von histamininduziertem (25 nmol/50 µl, i.d.) Juckreiz durch Vorbehandlung mit Capsazepin (4 mg/kg) ; n = 7 – 8 pro Gruppe. B. Inhibition von histamininduziertem (25 nmol/50 µl, i.d.) Juckreiz durch Vorbehandlung mit Capsazepin (6 mg/kg, i.p.); n = 8 – 9 pro Gruppe.

V e h ik e l C a p s a z e p in 4 m g /k g

Ergebnisse

4.1.3.1.3. Einfluss von TRPA1- und TRPV1-Kanal-Inhibitoren auf über den H4R induzierten Juckreiz

Die intraperitoneale Vorbehandlung mit HC-030031 (TRPA1-Inhibitor) oder Capsazepin (TRPV1-Inhibitor) hemmte sowohl den histamin- als auch den 4-MH-induzierten Juckreiz.

Das zusätzlich getestete SB366791 (TRPV1-Inhibitor) zeigte in der verwendeten Dosierung (0,5 mg/kg) jedoch keinen hemmenden Effekt (Abb. 12). ST-1006-induzierter Juckreiz wurde dagegen nur durch den TRPA1-Inhibitor, nicht jedoch durch den TRPV1-Inhibitor Capsazepin gehemmt. SB366791 zeigte dennoch eine signifikante Hemmung des ST-1006-induzierten Kratzverhaltens (Abb. 12). Bei dem durch den H1R/H2R-Agonisten HTMT ausgelösten Juckreiz kam es nur durch die TRPV1-Inhibitioren Capsazepin und SB366791 (p = 0,0650; Mann-Whitney-U-Test) zu einer Reduktion. Sowohl bei dem H1R-Agonisten 2-Pyridylethylamin als auch bei dem inversen H3R-H1R-Agonisten Pitolisant kam es zu keiner signifikanten Reduktion des Kratzverhaltens nach intraperitonealer Injektion der Inhibitoren HC-030031 und Capsazepin (Abb. 13).

Ergebnisse

Abbildung 12: Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 und des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 8 – 9 pro Gruppe (Pitolisant: n = 6). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe *** p < 0,001;

** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Dosierungen je 200 µl i.p. Injektion:

HC-030031: 60 mg/kg, Capsazepin: 6 mg/kg, Vehikel = 10 % DMSO. Applizierte Mengen der Histaminrezeptor-Liganden: Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, 2-Pyridylethylamin:

1 µmol/ 50 µl, Pitolisant: 50 nmol/ 50 µl), 4-MH: 50 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl. KWT =

Ergebnisse

Abbildung 13: Einfluss des TRPV1-Inhibitors SB366791 auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 8 – 10 pro Gruppe. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01;

* p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Dosierungen je 200 µl i.p. Injektion: SB366791: 0,5 mg/kg;

Vehikel = 0,5 % DMSO. Applizierte Mengen der Histaminrezeptor-Liganden: Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT:

100 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl.

4.1.3.2. Einfluss von Phospholipase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz 4.1.3.2.1. Einfluss des Phospholipase A2-Inhibitors Quinacrin auf histamininduzierten Juckreiz

Die intraperitoneale Vorbehandlung mit dem Phospholipase A2-Inhibitor Quinacrin hemmte sowohl den ST-1006- als auch den 4-MH-induzierten Juckreiz signifikant (Abb. 14). Auf den durch HTMT oder Histamin ausgelösten Juckreiz hatte es einen hemmenden, aber nicht

Ergebnisse

Abbildung 14: Einfluss des Phospholipase A2-Inhibitors Quinacrin auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellungen mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); ST-1006/HTMT: n = 10 pro Gruppe, Histamin/4-MH: n = 5 – 6 pro Gruppe). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Dosierungen je 200 µl aqua ad injectionem i.p. Injektion: Quinacrin: 20 mg/kg. Applizierte Mengen der Histaminrezeptor-Liganden:

Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, 4-MH 50 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl.

V e h ik e l Q u in a c r in

Ergebnisse

4.1.3.2.2. Einfluss des Phospholipase C-Inhibitors U73122 auf histamininduzierten Juckreiz

Die lokale, intradermale Vorbehandlung mit dem Phospholipase C-Inhibitor U73122 hemmte einzig den HTMT-induzierten Juckreiz (Abb. 15). Auf den durch Histamin, ST-1006 oder 4-MH ausgelösten Juckreiz hatte es keinen Effekt.

Ergebnisse

Abbildung 15: Einfluss des Phospholipase C-Inhibitors U73122 auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 9 – 10 pro Gruppe. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01;

* p< 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Dosierungen: U73122: 50 pmol/ 50 µl i.d. Applizierte Mengen der Histaminrezeptor-Liganden: Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, 4-MH: 50 nmol/50 µl, ST-1006:

50 nmol/50 µl.

Ergebnisse

4.1.3.3. Einfluss von Proteinkinase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz 4.1.3.3.1 Einfluss des Proteinkinase A-Inhibitors H89 auf histamininduzierten Juckreiz Die intraperitoneale Vorbehandlung mit dem Proteinkinase A-Inhibitor H89 hemmte ausschließlich den 4-MH-induzierten Juckreiz (Abb. 16). Bei dem durch Histamin oder ST-1006 induzierten Juckreiz war eine leichte aber nicht signifikante Reduktion erkennbar.

Auf den HTMT-induzierten Juckreiz zeigte der Inhibitor keinen Effekt im Vergleich zur Vehikelgruppe.

Ergebnisse

Abbildung 16: Einfluss des Proteinkinase A Inhibitors H89 auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 8 – 9 pro Gruppe. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01;

* p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Dosierungen je 200 µl 10 % DMSO i.p. Injektion: H89: 10 mg/kg.

Applizierte Mengen der Histaminrezeptor-Liganden: Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, 4-MH: 50 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl.

V e h ik e l H 8 9

Ergebnisse

4.1.3.3.2 Einfluss des Proteinkinase C-Inhibitors Bisindolylmaleimid I auf histamininduzierten Juckreiz

Durch lokale, intradermale Vorbehandlung mit dem Proteinkinase C-Inhibitor Bisindolylmaleimid I (BIM) kam es nach Histaminapplikation bei allen drei untersuchten Konzentrationen zu einer signifikanten Verstärkung des ausgelösten Juckreizes, wobei hierbei keine dosisabhängige Veränderung zu erkennen war (Abb. 17). Die 10 µg/50 µl Dosierung des BIMs wurde nur bei Histamin getestet, da es zu relativ starken Blutungen aus der Injektionsstelle kam. Bei dem durch den H4R-Agonisten ST-1006-induzierten Juckreiz verhält es sich ähnlich wie bei Histamin, wobei eine klare Dosisabhängigkeit zu erkennen war. Mit steigender Inhibitor-Dosierung verstärkte sich der ausgelöste Juckreiz. Bei dem durch HTMT ausgelösten Juckreiz war eine dosisabhängige Inhibition durch BIM zu erkennen, welche in einer Dosierung von 5 µg/ 50 µl signifikant war. Bei dem 4-MH-induzierten Juckreiz war kein Unterschied zwischen den Gruppen zu erkennen.

Ergebnisse

Abbildung 17: Einfluss des intradermal applizierten Proteinkinase C-Inhibitors Bisindolylmaleimid auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 8 – 12 pro Gruppe (BIM 10 µg/50 µl: n = 4). Die angegebenen Mengen beziehen sich auf ein Injektionsvolumen von 50 µl. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe (5 % DMSO): *** p < 0,001;

** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Intradermal applizierte Mengen der Histaminrezeptor-Liganden: Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, 4-MH: 50 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl.

Ergebnisse

4.1.3.4. Einfluss des Adenylylzyklase-Inhibitors SQ22536 auf histamininduzierten Juckreiz

Die lokale, intradermale Vorbehandlung mit dem Adenylylzyklase-Inhibitor SQ22536 zeigte bei keiner der untersuchten Substanzen einen juckreizhemmenden Effekt (Abb. 18).

Abbildung 18: Einfluss des Adenylylzyklase-Inhibitors SQ22536 auf histamininduzierten Juckreiz Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 9 pro Gruppe. Die angegebenen Mengen beziehen sich auf ein Injektionsvolumen von 50 µl. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Intradermal applizierte Mengen : SQ22536: 50 nmol/50 µl, Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, 4-MH: 50 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl.

V e h ik e l S Q 2 2 5 3 6

Ergebnisse

73 4.1.4. Untersuchungen am Knockout-Modell

4.1.4.1. Histamininduzierter Juckreiz bei TRPV1^-/-- und TRPA1^-/--Mäusen

Es wurde das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion verschiedener Histaminrezeptor-Liganden untersucht. Abbildung 19 zeigt die Anzahl an Kratzattacken nach Applikation von Histamin, 4-MH oder ST-1006. Die Juckreizantwort nach Histamin-Injektion war sowohl bei den TRPA1^-/-- als auch bei den TRPV1^-/--Mäusen im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen reduziert. Nach 4-MH-Injektion ist die Juckreizantwort in den TRPV1^-/--Mäusen ebenfalls reduziert. Bei den TRPA1^-/--Mäusen scheint die Reaktion unverändert. Bei den TRPV1^-/-/TRPA1^-/--Mäusen gab es ebenfalls eine signifikante Reduktion der Juckreizantwort.

Diese ist im Vergleich zu der TRPV1^-/--Gruppe stärker reduziert. Nach ST-1006-Applikation ist eine leichte Reduktion ohne Signifikanz bei den TRPV1^-/--Mäusen zu erkennen. Eine statistisch signifikante und etwa gleich starke Reduktion in der Juckreizantwort gab es bei den TRPA1^-/-- und bei den TRPV1^-/-/ TRPA1^-/--Mäusen.

4.1.4.1.1. Genotypisierung

Bei den homozygoten TRPA1^-/--Mäusen entsteht ein PCR-Produkt durch die Anlagerung der Primer oIMR8645 und oIMR8646 von 184 bp, bei den Wildtypen durch die Anlagerung von oIMR9179 und oIMR9180 ein Produkt von 289 bp (Abb. 20). Bei den Heterozygoten entstehen durch die Anlagerung beider Primer zwei Produkte von 184 und 289 bp Größe. Bei den TRPV1^-/--Mäusen entsteht ein PCR-Produkt von 176 bp durch Anlagerung der beiden Primer oIMR1627 und 19923. Bei den Wildtypen entsteht durch die Anlagerung der Primer 19922 und 19923 ein Produkt von 289 bp (Abb. 21). Bei den Heterozygoten entstehen durch die zusätzliche Anlagerung von oIMR1627 und 19993 zwei Produkte mit einer Größe von 176 bzw. 289 bp. Für die Genotypisierung der TRPV1^-/-/TRPA1^-/--Mäuse gilt das oben Beschriebene gleichermaßen. Für jedes Tier wurden zwei separate Durchgänge für TRPV1 und TRPA1 durchgeführt.

Zur Kontaminationskontrolle diente eine Wasserprobe. Diese blieb negativ (nicht abgebildet).

Ergebnisse

Abbildung 19: Untersuchungen zum histamininduzierten Juckreiz bei TRPV1^-/--, TRPA1^-/-- und TRPV1 -/-TRPA1^-/--Mäusen im Vergleich zum Wildtyp (C57BL/6-Mäuse)

Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von 50 µl NaCl, Histamin (800 nmol/50 µl), 4-MH (500 nmol/ 50 µl) und ST-1006 (100 nmol/ 50 µl). Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 6 pro Gruppe (TRPV1^-/-TRPA1^-/-: n = 3). Angegebene Signifikanzen beziehen sich, außer anders angegeben, auf die Wildtypgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Wt = Wildtyp-Mäuse; KWT = Kruskal-Wallis-Test.

Ergebnisse

Wildtyp TRPA1

-/-300 bp 200 bp 100 bp

Abbildung 20: Genotypisierung der TRPA1^-/-- und Wildtyp-Mäuse exemplarisch dargestellt Die Mäuse wurden mittels RT-PCR genotypisiert. Die TRPA1^-/--Mäuse wiesen eine spezifische Bande von 187 bp und die Wildtyp-Mäuse von 317 bp auf.

Abbildung 21: Genotypisierung der TRPV1^-/-- und Wildtyp-Mäuse exemplarisch dargestellt Die Mäuse wurden mittels RT-PCR genotypisiert. Die TRPV1^-/--Mäuse wiesen eine spezifische Bande von 176 bp und die Wildtyp-Mäuse von 289 bp auf.

Wildtyp TRPV1

-/-300 bp

bp 200 bp

100 bp

Ergebnisse

4.1.5. Einfluss von ZNS- und nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten auf über den H4R induzierten Juckreiz

Nach intraperitonealer Vorbehandlung mit dem ZNS-gängigen H4R-Antagonisten JNJ7777120 konnte der durch 4-MH-induzierte Juckreiz signifikant gehemmt werden. Im Gegensatz dazu konnte ein solcher Effekt durch eine intraperitoneale Vorbehandlung mit dem nicht ZNS-gängigen H4R-Antagonisten JNJ39594906 nicht erzielt werden. Abb. 22 zeigt beide Antagonisten im Vergleich.

Abbildung 22: Einfluss des ZNS-gängigen (JNJ7777120) und des nicht-ZNS-gängigen (JNJ39594906) H4R-Antagonisten auf 4-MH-induzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Dosierungen je 200 µl i.p. Injektion: JNJ7777120: 20 mg/kg (n = 6), JNJ39594906: 20 mg/kg (n = 9), Vehikel = Aqua ad injectionem. Dosierung 4-MH: 50 nmol/ 50 µl.

V e h i k e l J N J 7 7 7 7 1 2 0 0

5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0

Kratzattacken/ 30 Min

V e h i k e l J N J 3 9 5 9 4 9 0 6 0

5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0

Kratzattacken/ 30 Min

Ergebnisse

4.1.6. Vergleichbarkeit des Kratzverhaltens zwischen den einzelnen Versuchstagen Um die Reproduzierbarkeit des durch die Histaminrezeptor-Agonisten Histamin, HTMT, 4-MH und ST-1006 ausgelösten Juckreizes beurteilen zu können, wurden die Vehikelgruppen aus den oben aufgeführten Versuchen miteinander verglichen.

4.1.6.1. Vergleichbarkeit des histamininduzierten Kratzverhaltens

Bei dem Vergleich des histamininduzierten Juckreizes zwischen den einzelnen Versuchstagen zeigten sich bis zum siebten Versuchstag keine signifikanten Unterschiede im Kratzverhalten der Mäuse nach intradermaler Applikation von Histamin (25 nmol/ 50 µl. Die Werte an Tag acht und neun weichen vermutlich aufgrund des Alters der verwendeten Substanz signifikant von denen der übrigen Versuchstage ab (p = 0,0001 – 0,0040; Mann-Whitney-U-Test)

Abbildung 23: Vergleichende Darstellung des histamininduzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 6 – 12 pro Gruppe.

Intradermal applizierte Menge: Histamin: 25 nmol/50 µl, i.d.. KWT = Kruskal-Wallis-Test.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0

H is t a m in

Kratzattacken/ 30 Min

KWT: p = 0,0002

Ergebnisse

4.1.6.2. Vergleichbarkeit des HTMT-induzierten Kratzverhaltens

Bei dem Vergleich des durch intradermale Gabe von HTMT induzierten Juckreizes zwischen den einzelnen Versuchstagen waren außer bei Tag fünf im Vergleich zu Tag vier und sechs (p = 0,0056; Mann-Whitney-U-Test) keine signifikanten Unterschiede erkennbar.

Abbildung 24: Vergleichende Darstellung des HTMT-induzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastegraphiken (siehe Abb.8); n = 6 – 10 pro Gruppe.

Intradermal applizierte Menge: HTMT: 100 nmol/50 µl. KWT = Kruskal-Wallis-Test.

4.1.6.3. Vergleichbarkeit des 4-methylhistamininduzierten Kratzverhaltens

Bei dem Vergleich des 4-MH-induzierten Juckreizes zwischen den einzelnen Versuchstagen war die Juckreizantwort der Mäuse an den Tagen eins bis drei signifikant niedriger (p = 0,0004 – 0,0260; Mann-Whitney-U-Test) als die Antwort nach Anbruch einer neuer Charge 4-MH ab Versuchstag vier.

Abbildung 25: Vergleichende Darstellung des 4-MH-induzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8) n = 6-10 pro Gruppe.

Intradermal applizierte Menge: 4-MH: 50 nmol/50 µl. KWT = Kruskal-Wallis-Test.

1 2 3 4 5 6 7

Ergebnisse

4.1.6.4. Vergleichbarkeit des ST-1006-induzierten Kratzverhaltens

Bei dem Vergleich des intradermal durch ST-1006 induzierten Juckreizes waren zwischen den einzelnen Versuchstagen keine statistisch signifikanten Unterschiede erkennbar.

Abbildung 26: Vergleichende Darstellung des ST-1006-induzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen

Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken; n = 6 – 10 pro Gruppe. Intradermal applizierte Menge: ST-1006: 50 nmol/50 µl. KWT = Kruskal-Wallis-Test.

1 2 3 4 5 6 7

0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0

S T - 1 0 0 6

Kratzattacken/ 30 Min

KWT: p = 0,6505

Ergebnisse

4.2. In-vitro-Untersuchungen zur Transmission des Juckreizsignals mittels Ca²⁺-Influx Messungen

Von den untersuchten DRG-Neuronen reagierten 13 % auf Histamin (1 mmol/l), 4 % auf HTMT (100 µmol/l), 5 % auf 4-MH (100 µmol/l) und 5 % auf ST-1006 (100 µmol/l).

4.2.1. Einfluss des spezifischen H4R-Antagonisten JNJ7777120 auf den über den H4R induzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstieg in Spinalganglienneuronen

Nach einem ersten Stimulus mit den H4R-Agonisten ST-1006 oder 4-MH (100 µmol/l) wurde nach einer ca. zweiminütigen Waschphase der spezifische H4R-Antagonist JNJ7777120 (10 µmol/l) appliziert und direkt nachfolgend wieder der vorherig verwendete Agonist (Abb.28 A/B). JNJ7777120 konnte sowohl den 4-MH- als auch den ST-1006-induzierten Ca²⁺-Influx in die getesteten Neurone inhibieren (Abb. 27 ).

Abbildung 27: Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ7777120 auf den über den H4R induzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen

Inhibitorischer Effekt von JNJ7777120 (10 µmol/l) auf den intrazellulären Ca²⁺-Anstieg nach Stimulation mit 4-MH (100 µmol/l) oder ST-1006 (100 µmol/l) dargestellt als Prozent der gesamt getesteten Neurone. Die Anzahl der positiv auf einen der H4R-Agonisten reagierenden Neurone, im Verhältnis zu den gesamt getesteten, sind in der dazugehörigen Tabelle zu finden. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Kontrollgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Exakter Test nach Fisher); DRG-Neurone von n = 3 von CD-1-Mäusen.

4-Methylhistamin ST-1006

Kontrolle 9/196 (5 %) 9/166 (5 %)

JNJ7777120 10 µmol/l 1/196 (0,5 %) 0/166 (0 %)

4 - M H S T - 1 0 0 6

0 5 1 0 1 5 2 0

% der Gesamtneurone K o n t r o l l e

J N J 7 7 7 7 1 2 0 1 0 µ m o l / l

* *

Ergebnisse

Abbildung28: Veränderungdesüberden H4R induzierten intrazellulären Ca2+ -Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusennach JNJ7777120-Applikation A.:InhibitorischerEffekt vonJNJ7777120(10 µmol/l) auf den4-MH-induzierten(100 µmol/l)Ca2+ -InfluxinDRG-Neuronen. B.: Inhibitorischer Effekt von JNJ7777120 (10 µmol/l) auf den ST-1006-induzierten (100 µmol/l) Ca2+ -Influx in DRG-Neurone. Die Abbildungen zeigen in 500 ms Intervallen aufgezeichnete Beispielaufnahmen des zytosolischen Ca2+ -Anstiegs (Veränderung des 340/380 nm Fluoreszenzintensitätsverhältnisses) jeweils eines einzelnes Neurons.

060120180240300360

KCl (150 mmol/l) JNJ7777120 (10 µmol/l) 060120180240300360

0.5 KCl (150 mmol/l) JNJ7777120 (10 µmol/l)

A. B.

Ergebnisse

4.2.2. Einfluss des spezifischen H1R-Antagonisten Diphenhydramin auf den über den H1R induzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstieg in Spinalganglienneuronen

Nach einem ersten Stimulus mit dem H1R-Agonisten HTMT (100 µmol/l) wurde nach einer zweiminütigen Waschphase der spezifische H1R-Antagonist Diphenhydramin (10 µmol/l) appliziert und direkt nachfolgend wieder der vorherig verwendete Agonist (Abb. 30).

Diphenhydramin konnte den HTMT-induzierten Ca²⁺-Influx in die getesteten Neurone inhibieren (p = 0,0605; Exakter Test nach Fisher, Abb. 29 ).

Abbildung 29: Einfluss des H1R-Antagonisten Diphenhydramin auf den über den H1R induzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen

Inhibitorischer Effekt von Diphenhydramin (10 µmol/l) auf den intrazellulären Ca²⁺-Anstieg nach Stimulation mit HTMT (100 µmol/l), dargestellt als Prozent der gesamt getesteten Neurone. Die Anzahl der positiv auf den H1R-Agonisten reagierenden Neurone, im Verhältnis zu den gesamt getesteten, sind in der dazugehörigen Tabelle zu finden. DRG-Neurone von n = 3 CD-1-Mäusen.

K o n t r o l l e D i p h e n h y d r a m i n 0

5 1 0 1 5 2 0

% der Gesamtneurone

HTMT

Kontrolle 7/113 (6%)

Diphenhydramin 10 µmol/l 1/113 (1%)

Ergebnisse

Abbildung 30: Veränderung des über den H1R induzierten intrazellulären Ca2+ -Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen nach Diphenhydramin-Applikation Inhibitorischer Effekt von Diphenhydramin (10 µmol/l) auf den HTMT-induzierten (100 µmol/l) Ca2+ -Influx in DRG-Neuronen. Die Abbildung zeigt eine in500 ms Intervallenaufgezeichnete Beispielaufnahme des zytosolischenCa2+ -Anstiegs (Veränderungdes 340/380 nm Fluoreszenzintensitätsverhältnisses) eines einzelnen Neurons.

060120180240300360420

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 Zeit (s)

no rm al is ie rt e Ra ti o 34 0/

38 0 nm

HTMT (100 µmol/l) Kontrolle

HTMT (100 µmol/l)

KCl (150 mmol/l) Diphenhydramin (10 µmol/l)

Ergebnisse

4.2.3. Einfluss des TRP-Kanal-Inhibitors Ruthenium Red auf den histamininduzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstieg in Spinalganglienneuronen

Nach einem initialen Stimulus mit dem Kontrollpuffer erfolgte eine erste Stimulation mit einem der verwendeten Histaminrezeptor-Liganden. Darauffolgend wurde nach einer ca.

zweiminütigen Waschphase der TRP-Kanal-Inhibitor Ruthenium Red (1 oder 10 µmol/l) appliziert und direkt nachfolgend wieder der vorherig verwendete Agonist (Abb. 32 A/B).

Ruthenium Red konnte sowohl den durch Histamin als auch den durch HTMT induzierten Ca²⁺-Influx in die getesteten Neurone dosisabhängig inhibieren (Abb. 31). Ruthenium Red konnte in einer Dosierung von 10 µmol/l sowohl den ST-1006 (p = 0,0509)- als auch den 4-MH (p = 0,0532)-induzierten Ca²⁺-Influx leicht, aber nicht statistisch signifikant reduzieren.

Abbildung 31: Einfluss des TRP-Kanal-Inhibitors Ruthenium Red auf den histamininduzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen

Inhibitorischer Effekt von Ruthenium Red (1 oder 10 µmol/l) auf den intrazellulären Ca²⁺-Anstieg nach Stimulation mit Histamin (1 mmol/l), 4-MH (100 µmol/l), ST-1006 (100 µmol/l) oder HTMT (100 µmol/l) dargestellt als Prozent der gesamt getesteten Neurone. Die Anzahl der positiv auf einen der Histaminrezeptor-Liganden reagierenden Neurone, im Verhältnis zu den gesamt getesteten, sind in der dazugehörigen Tabelle zu finden. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Kontrollgruppe: *** p < 0,001;

Im Dokument Untersuchungen zur Transmission des über den Histamin-4-Rezeptor induzierten Juckreizsignals (Seite 70-0)