Untersuchungen zur Transmission des über den Histamin-4-Rezeptor induzierten Juckreizsignals

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zur Transmission des über den Histamin-4-Rezeptor induzierten Juckreizsignals

INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von Jenny Wilzopolski

Brunsbüttel

Hannover 2017

I

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Reinhard Mischke

Tag der mündlichen Prüfung: 06.11.2017

Die Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft.

II

"Leicht ist das Leben für keinen von uns. Doch was nützt das, man muß Ausdauer haben und Zutrauen zu sich selbst. Man muß daran glauben, für eine bestimmte Sache begabt zu sein,

und diese Sache muß man erreichen, koste es was es wolle."

-Marie Curie-

Für meine Familie

III

Inhaltsverzeichnis

IV Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ... iv

Abbildungsverzeichnis ... viii

Tabellenverzeichnis ... x

Abkürzungsverzeichnis ... xii

1. Einleitung ... 1

2. Literaturübersicht ... 4

2.1. Juckreiz ... 4

2.1.1. Ursachen ... 4

2.1.1.1. Botenstoffe ... 5

2.1.2. Mechanismen und Neurophysiologie ... 7

2.2. Histamin ... 11

2.3. Histaminrezeptoren ... 12

2.3.1. Intrazellulärer Signalweg des histamininduzierten Juckreizes in sensorischen Neuronen ... 13

2.4. Histamin-4-Rezeptor ... 16

2.4.1. Vorkommen und Funktion ... 16

2.5. TRP-Ionenkanäle ... 18

2.5.1. Vorkommen, Funktion und Wirkmechanismen ... 20

2.5.1.1. Beteiligung am Juckreizgeschehen ... 21

2.5.2. TRPV1-Kanal ... 24

2.5.3. TRPA1-Kanal ... 25

2.6. Juckreizmodelle in der Tiermedizin ... 27

2.6.1. Einflüsse auf die Juckreizantwort im Mausmodell ... 29

2.6.1.1. Mausstämme ... 29

2.6.1.2. Geschlecht ... 30

2.6.1.3. Alter ... 31

2.6.1.4. Äußere Einflüsse ... 31

3. Material und Methoden ... 33

3.1. Material, Geräte und Tiere ... 33

Inhaltsverzeichnis

V

3.1.1. Material für In-vivo-Versuche ... 33

3.1.1.1 Agonisten ... 33

3.1.1.2. Antagonisten/Inhibitoren ... 34

3.1.2. RT-PCR Genotypisierung ... 34

3.1.3. Material für die Zellkultur ... 35

3.1.4. Material für Ca²⁺-Influx-Messungen ... 36

3.1.5. Allgemeine Materialien/Verbrauchsmaterialien ... 36

3.1.6. Puffer und Lösungen ... 38

3.1.7. Versuchstiere ... 39

3.2. Versuchsübersicht ... 41

3.3. In-vivo-Versuche ... 42

3.3.1. Bewertung des Kratzverhaltens ... 43

3.3.2. Versuche zum Kratzverhalten nach 4-Methylhistamin-Injektion bei verschiedenen Mausstämmen ... 43

3.3.3. In-vivo-Untersuchungen zur Transmission des histamininduzierten Juckreizsignals .... 44

3.3.3.1. Dosis-Wirkungs-Untersuchungen ... 44

3.3.3.2. Einfluss von TRP-Kanal-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz ... 44

3.3.3.3. Einfluss von Phospholipase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz ... 45

3.3.3.4. Einfluss von Proteinkinase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz ... 46

3.3.3.5. Einfluss eines Adenylylzyklase-Inhibitors auf histamininduzierten Juckreiz ... 46

3.3.3.6. Untersuchungen an TRPV1- und TRPA1-Knockout-Mäuse ... 47

3.3.3.6.1. Genotypisierung der TRPV1- und TRPA1-Knockout-Mäusen ... 47

3.3.3.7. Einfluss von ZNS- und nicht-ZNS-gängigen Histamin-4-Rezeptor-Antagonisten auf histamininduzierten Juckreiz ... 50

3.4. In-vitro-Untersuchungen ... 50

3.4.1. Funktionelle Untersuchungen an Spinalganglienneuronen zur Transmission des Juckreizsignals mittels Ca²⁺-Influx-Messungen ... 50

3.4.1.1 Isolierung und Kultivierung von murinen Spinalganglienneuronen ... 50

3.4.1.2. Ca²⁺-Influx-Messungen an Spinalganglienneuronen ... 51

3.4.1.2.1. Auswertung der Ca²⁺-Influx-Messungen ... 53

3.4.2. In-vitro-Versuche zum Vergleich der Rezeptorexpression auf Spinalganglien bei verschiedenen Mausstämmen ... 54

Inhaltsverzeichnis

VI

3.4.2.1. Funktionelle Rezeptoruntersuchungen an murinen Spinalganglienneuronen

verschiedener Mausstämme mittels Ca²⁺-Influx Messungen ... 54

3.5. Statistische Auswertung ... 55

4. Ergebnisse ... 56

4.1. In-vivo-Versuche ... 56

4.1.1. Kratzverhalten nach intradermaler 4-Methylhistamin-Injektion bei vier unterschiedlichen Mausstämmen ... 56

4.1.2. Dosis-Wirkungsbeziehung verschiedener Histaminrezeptor-Agonisten bei CD-1- Mäusen ... 58

4.1.3. In-vivo-Untersuchungen zur Transmission des über den H4R induzierten Juckreizsignals im Mausmodell ... 60

4.1.3.1. Einfluss von TRP-Kanal-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz ... 60

4.1.3.1.1. Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 auf histamininduzierten Juckreiz ... 60

4.1.3.1.2. Einfluss des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf histamininduzierten Juckreiz ... 61

4.1.3.1.3. Einfluss von TRPA1- und TRPV1-Kanal-Inhibitoren auf über den H4R induzierten Juckreiz ... 62

4.1.3.2. Einfluss von Phospholipase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz ... 64

4.1.3.2.1. Einfluss des Phospholipase A2-Inhibitors Quinacrin auf histamininduzierten Juckreiz ... 64

4.1.3.2.2. Einfluss des Phospholipase C-Inhibitors U73122 auf histamininduzierten Juckreiz ... 66

4.1.3.3. Einfluss von Proteinkinase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz ... 68

4.1.3.3.1 Einfluss des Proteinkinase A-Inhibitors H89 auf histamininduzierten Juckreiz ... 68

4.1.3.3.2 Einfluss des Proteinkinase C-Inhibitors Bisindolylmaleimid I auf histamininduzierten Juckreiz ... 70

4.1.3.4. Einfluss des Adenylylzyklase-Inhibitors SQ22536 auf histamininduzierten Juckreiz 72 4.1.4. Untersuchungen am Knockout-Modell ... 73

4.1.4.1. Histamininduzierter Juckreiz bei TRPV1^-/-- und TRPA1^-/--Mäusen ... 73

4.1.4.1.1. Genotypisierung ... 73

4.1.5. Einfluss von ZNS- und nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten auf über den H4R induzierten Juckreiz ... 76

4.1.6. Vergleichbarkeit des Kratzverhaltens zwischen den einzelnen Versuchstagen ... 77

4.1.6.1. Vergleichbarkeit des histamininduzierten Kratzverhaltens ... 77

Inhaltsverzeichnis

VII

4.1.6.2. Vergleichbarkeit des HTMT-induzierten Kratzverhaltens ... 78

4.1.6.3. Vergleichbarkeit des 4-methylhistamininduzierten Kratzverhaltens ... 78

4.1.6.4. Vergleichbarkeit des ST-1006-induzierten Kratzverhaltens ... 79

4.2. In-vitro-Untersuchungen zur Transmission des Juckreizsignals mittels Ca²⁺-Influx Messungen ... 80

4.2.1. Einfluss des spezifischen H4R-Antagonisten JNJ7777120 auf den über den H4R induzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstieg in Spinalganglienneuronen ... 80

4.2.2. Einfluss des spezifischen H1R-Antagonisten Diphenhydramin auf den über den H1R induzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstieg in Spinalganglienneuronen ... 82

4.2.3. Einfluss des TRP-Kanal-Inhibitors Ruthenium Red auf den histamininduzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstieg in Spinalganglienneuronen ... 84

4.2.4. Einfluss des TRPA1-Kanal-Inhibitors HC-030031 auf den histamininduzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstieg in Spinalganglienneuronen ... 86

4.2.5. Einfluss des TRPV1-Kanal-Inhibitors SB366791 auf den histamininduzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstieg in Spinalganglienneuronen ... 88

4.3. Vergleichende Untersuchungen des histamininduzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneurone bei verschiedenen Mausstämmen ... 90

5. Diskussion ... 93

5.1. Einfluss des Mausstammes auf die über den H4R induzierte Juckreizantwort ... 94

5.2. Histaminrezeptor-Liganden im Juckreizgeschehen ... 97

5.3. Effekt von TRP-Kanälen auf den über den H4R induzierten Juckreiz ... 97

5.3.1. Wechselseitige Regulation des TRPV1- und TRPA1-Kanals ... 99

5.4. Einfluss verschiedener Effektormoleküle auf den histamininduzierten Juckreiz ... 101

5.5. Einfluss der ZNS-Gängigkeit von H4R-Antagonisten auf über den H4R induzierten Juckreiz ... 105

5.6. Schlussfolgerung und Ausblick ... 106

6. Zusammenfassung ... 109

7. Summary ... 112

8. Literaturverzeichnis ... 114

9. Anhang ... 151

9.1. Tabellen ... 151

9.2. Danksagung ... 163

Abbildungsverzeichnis

VIII Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: In der Haut von Effektorzellen freigesetzte pruritogene Botenstoffe ... 6

Abbildung 2: Zentrale Juckreizverarbeitung, modifiziert...10

Abbildung 3: Strukturformel Histamin...13

Abbildung 4: Putativer Signalweg des über den H1R induzierten Juckreizes...14

Abbildung 5: Phylogenetischer Stamm humaner TRP-Kanäle...19

Abbildung 6: Verhaltensantworten von Mäusen nach Substanzinjektion in die Wange...29

Abbildung 7: Fura-2 Bindung an Ca²⁺ nach Abspaltung der AM-Gruppen durch Esterasen...52

Abbildung 8: Dosis-Wirkungsbeziehung des 4-methylhistamininduzierten Juckreizes vergleichend bei BALB/c-, C57BL/6-, NMRI- und CD-1-Mäusen...57

Abbildung 9: Untersuchungen zum Kratzverhalten nach intradermaler Gabe verschiedener Histaminrezeptor-Liganden in unterschiedlichen Konzentrationen bei CD-1-Mäusen...59

Abbildung 10: Einfluss verschiedener Dosierungen des TRPA1-Inhibitors HC-030031 auf den histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...60

Abbildung 11: Einfluss verschiedener Dosierungen des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...61

Abbildung 12: Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 und des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen... 63

Abbildung 13: Einfluss des TRPV1-Inhibitors SB366791 auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen ...64

Abbildung 14: Einfluss des Phospholipase A2-Inhibitors Quinacrin auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...65

Abbildung 15: Einfluss des Phospholipase C-Inhibitors U73122 auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen... 67

Abbildung 16: Einfluss des Proteinkinase A Inhibitors H89 auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...69

Abbildung 17: Einfluss des intradermal applizierten Proteinkinase C-Inhibitors Bisindolylmaleimid auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...71

Abbildung 18: Einfluss des Adenylylzyklase-Inhibitors SQ22536 auf histamininduzierten Juckreiz...72

Abbildung 19: Untersuchungen zum histamininduzierten Juckreiz bei TRPV1^-/--, TRPA1^-/-- und TRPV1^-/-TRPA1^-/--Mäusen im Vergleich zum Wildtyp (C57BL/6-Mäuse)...74

Abbildung 20: Genotypisierung der TRPA1^-/-- und Wildtyp-Mäuse exemplarisch dargestellt...75

Abbildung 21: Genotypisierung der TRPV1^-/-- und Wildtyp-Mäuse exemplarisch dargestellt...75

Abbildung 22: Einfluss des ZNS-gängigen (JNJ7777120) und des nicht-ZNS-gängigen (JNJ39594906) H4R-Antagonisten auf 4-MH-induzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...76 Abbildung 23: Vergleichende Darstellung des histamininduzierten Juckreizes verschiedener

Abbildungsverzeichnis

IX

Versuchstage bei CD-1-Mäusen...77 Abbildung 24: Vergleichende Darstellung des HTMT-induzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen...78 Abbildung 25: Vergleichende Darstellung des 4-MH-induzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen...78 Abbildung 26: Vergleichende Darstellung des ST-1006-induzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen...79 Abbildung 27: Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ7777120 auf den über den H4R induzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen...80 Abbildung 28: Veränderung des über den H4R induzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen nach JNJ7777120-Applikation...81 Abbildung 29: Einfluss des H1R-Antagonisten Diphenhydramin auf den über den H1R induzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen...82 Abbildung 30: Veränderung des über den H1R induzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen nach Diphenhydramin-Applikation...83 Abbildung 31: Einfluss des TRP-Kanal-Inhibitors Ruthenium Red auf den histamininduzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1- Mäusen...84 Abbildung 32: Veränderung des histamininduzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen nach Ruthenium Red-Applikation...85 Abbildung 33: Einfluss des TRPA1-Kanal-Inhibitors HC-030031 auf den histamininduzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen...86 Abbildung 34: Veränderung des histamininduzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen nach HC-030031-Applikation...87 Abbildung 35: Einfluss des TRPV1-Kanal-Inhibitors auf den histamininduzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen...88 Abbildung 36: Veränderung des histamininduzierten intrazellulären Ca²⁺-Anstiegs in Spinalganglienneurone von CD-1-Mäusen nach SB366791-Applikation...89 Abbildung 37: Vergleichende Untersuchung des stimulusinduzierten intrazellulären Ca²⁺- Anstiegs in Spinalganglienneuronen bei verschiedenen Mausstämmen...91 Abbildung 38: Vergleichende Darstellung der auf Histamin- oder 4-Methylhistamin- Stimulation mit einem Ca²⁺-Influx reagierenden Zellen...92

Tabellenverzeichnis

X

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Übersicht über die Histaminrezeptoren und ihre Funktionen...15

Tabelle 2: Ausgewählte Histamin-4-Rezeptor-Liganden...18

Tabelle 3: Pruritogene, ihre Rezeptoren und ihre im nachgeschalteten intrazellulären Signalweg wirksamen TRP-Kanäle auf sensorischen Neuronen...23

Tabelle 4: Ausgewählte TRPV1-Kanal-Liganden...25

Tabelle 5: Ausgewählte TRPA1-Kanal-Liganden...27

Tabelle 6: Zur Genotypisierung der TRPV1^-/-- und TRPA1^-/--Mäuse verwendete Primer...35

Tabelle 7: Substanzen, deren Einfluss auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden überprüft werden sollte...43

Tabelle 8: Für die In-vivo-Versuche verwendete Histaminrezeptor-Agonisten und ihre durch lokale Applikation untersuchten Mengen...44

Tabelle 9: Verwendete TRP-Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden und ihre jeweiligen untersuchten Dosierungen...45

Tabelle 10: Verwendete Phospholipase (PL)-Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden und ihre jeweiligen untersuchten Dosierungen...45

Tabelle 11: Verwendete Proteinkinase (PK)-Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden und ihre jeweiligen untersuchten Dosierungen...46

Tabelle 12: Verwendeter Adenylylzyklase-Inhibitor und seine untersuchte Dosierung...47

Tabelle 13: Die bei der Genotypisierung der TRPV1^-/-- und TRPA1^-/--Mäuse zu erwartenden PCR Produktgrößen in Basenpaaren...48

Tabelle 14: Zusammensetzung der Ansätze für die Genotypisierung der TRPA1^-/--Mäuse nach Herstellerangaben...48

Tabelle 15: Cyclereinstellungen für die Genotypisierung der TRPA1^-/--Mäuse nach Herstellerangaben...48

Tabelle 16: Zusammensetzung der Ansätze für die Genotypisierung der TRPV1^-/--Mäuse nach Herstellerangaben...49

Tabelle 17: Cyclereinstellungen für die Genotypisierung der TRPV1^-/--Mäuse nach Herstellerangaben...49

Tabelle 18: Verwendete Histamin-4-Rezeptor-Antagonisten zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von 4-Methylhistamin und ihre untersuchten Dosierungen...50

Tabelle 19: Zur Neuronenstimulation verwendete Agonisten und ihre Konzentrationen...53

Tabelle 20: Verwendete Antagonisten/Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf den intrazellulären Ca²⁺-Influx in Spinalganglienneurone nach Agonistenstimulation...53

Tabelle 21: Stimuli für die Ca²⁺-Influx-Messungen und ihre eingesetzten Konzentrationen..54 Tabelle 22: Ermittelte Dosierungen der Histaminrezeptor-Agonisten für die weitere

Tabellenverzeichnis

XI

Verwendung...58 Tabelle 23: Anzahl der Kratzattacken nach intradermaler 4-Methylhistamin-Injektion vergleichend bei BALB/c-, C57BL/6-, NMRI- und CD-1- Mäusen in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...151 Tabelle 24: Dosis-Wirkungsbeziehung verschiedener Histaminrezeptor-Agonisten bei CD-1- Mäusen: Anzahl der Kratzattacken in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...152 Tabelle 25: Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...153 Tabelle 26: Einfluss des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...153 Tabelle 27: Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 und des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...154 Tabelle 28: Einfluss des TRPV1-Inhibitors SB366791 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...155 Tabelle 29: Einfluss des Phospholipase A2-Inhibitors Quinacrin auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...155 Tabelle 30: Einfluss des Phospholipase C-Inhibitors U73122 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...156 Tabelle 31: Einfluss des Proteinkinase A-Inhibitors H89 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...157 Tabelle 32: Einfluss des Proteinkinase C-Inhibitors Bisindolylmaleimid I auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...158 Tabelle 33: Einfluss des Adenylylzyklase-Inhibitors SQ22536 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...159 Tabelle 34: Histamininduzierter Juckreiz bei TRPV1^-/--und TRPA1^-/--Mäusen: Anzahl der Kratzattacken in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...160 Tabelle 35: Einfluss ZNS- und nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten auf die Anzahl der Kratzattacken bei über den H4R induziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...160 Tabelle 36: Vergleichbarkeit des Kratzverhaltens zwischen den einzelnen Versuchstagen:

Anzahl der Kratzattacken in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...161

Abkürzungsverzeichnis

XII Abkürzungsverzeichnis

® Registered Trademark

TM Unregistered Trademark

% Prozent

± Plus/Minus

°C Grad Celsius

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µmol Mikromol

12-HETE 12-hydroxyeicosatetraenoic acid

4-MH 4-Methylhistamin

Abb. Abbildung

AD atopische Dermatitis

AITC Allylisothiocyanat

ATP Adenosintriphosphat

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

ca. circa

Ca²⁺ Calcium

cAMP cyklisches Adenosinmonophosphat

cDNA komplementäre DNA

cm Centimeter

CO2 Kohlendioxid

DAG Diacylglycerol

DC Dendritische Zelle(n)

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

DRG dorsal root ganglia (Spinalganglien)

et al. et alii, und andere

FKS Fetales Kälberserum

Abkürzungsverzeichnis

XIII

g Gramm

g Erdbeschleunigung

GPCR g-coupled protein receptor (G-Protein gekoppelter Rezeptor)

h hora/Stunde

H1R Histamin-1-Rezeptor(en)

H2R Histamin-2-Rezeptor(en)

H3R Histamin-3-Rezeptor(en)

H4R Histamin-4-Rezeptor(en)

HTMT Histamin-Trifluoromethyl-Toluidin Dimaleat

i.d. intradermal

IL Interleukin(e)

i.p. intraperitoneal

IP3 Inositoltriphosphat

Kbp Kilobasenpaare

KCl Kaliumchlorid

kDa Kilodalton

l Liter

lat. Latein

mg Milligramm

min. Minuten

ml Millgramm

mmol Millimol

MW Mittelwert

n Anzahl der Proben/Tiere

NaCl Natriumchlorid

NGF Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor)

nmol nanomol

PBS phosphate-buffered saline (Phosphatgepufferte

Salzlösung)

PCR Polymerase Kettenreaktion

Abkürzungsverzeichnis

XIV

PGE2 Prostaglandin E2

PIP2 Phosphatidylinositol-4.5-Bisphosphat

PIRT phosphoinositide-interacting regulator of transient receptor potential channels

PKA Proteinkinase A

PKC Proteinkinase C

PKCε Proteinkinase Cε

PLA Phospholipase A

PLC Phospholipase C

PLCß3 Phoshpholipase Cß3

Real-time RT-PCR Echtzeit Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion

TNFα Tumor Nekrose Faktor α

TRP transient receptor potential

TRPA transient receptor potential ankyrin#

TRPC transient receptor potential canonical

TRPM transient receptor potential melastin

TRPML transient receptor potentialmucolipin

TRPN transient receptor NO-mechano potential

TRPP transient receptor potentialpolycistic

TRPV transient receptor potentialvanilloid

u. a. unter anderem

v. a. vor allem

z. B. Zum Beispiel

ZNS Zentrales Nervensystem

z. T. zum Teil

XV

Einleitung

1

1. Einleitung

Juckreiz (Pruritus, lat. von prurire) ist eine unangenehme Sinneswahrnehmung, unter der sowohl Menschen als auch Tiere leiden. Diese führt zu Abwehrverhalten in Form von Kratzen, Reiben und Scheuern (NUTTALL u. MCEWAN 2006).

Im Laufe der Jahre gab es diverse Theorien über die Entstehung und Weiterleitung des Juckreizes. Zunächst nahm man an, dass Juckreiz nur eine unterschwellige Form des Schmerzes sei (VON FREY 1922). Jüngere Forschung weist darauf hin, dass es für Juckreiz spezifische Nervenfasern in der Haut gibt (SCHMELZ et al. 1997). Ebenso scheinen die Signalwege für Juckreiz und Schmerz voneinander getrennt zu sein (SCHMELZ et al. 1997;

ANDREW u. CRAIG 2001; TOTH et al. 2015). Dennoch beeinflussen sich diese beiden unangenehmen Sinneswahrnehmungen gegenseitig (MURRAY u. WEAVER 1975; WARD et al. 1996; YOSIPOVITCH et al. 2007).

Obwohl viele Mechanismen, die am Juckreizgeschehen beteiligt sind, noch nicht aufgedeckt sind, ist mittlerweile eine Vielzahl von beteiligten Botenstoffen bekannt (KREMER et al.

2014; STORAN et al. 2015; MOLLANAZAR et al. 2016). Der wohl am besten charakterisierte Mediator ist das ubiquitär im Körper vorkommende biogene Amin Histamin (SIMONE et al. 1987; SIMONE et al. 1991; KREMER et al. 2014). Es übernimmt neben der Juckreizauslösung viele weitere physiologische und pathophysiologische Funktionen im Körper (BÄUMER u. ROSSBACH 2010). Physiologisch ist es u. a. beteiligt an der Magensäuresekretion, der Regulation des Schlaf-Wachzyklus, dem Appetit und der Gedächtnisbildung (BÄUMER u. ROSSBACH 2010). Juckreizentstehung und Beteiligung an allergischen und entzündlichen Reaktionen gehören zu den pathophysiologischen Geschehnissen, bei denen Histamin eine bedeutende Rolle spielt (BÄUMER u. ROSSBACH 2010). Hierbei wirkt es über vier verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (Histaminrezeptoren; GANTZ et al. 1991a, b; YAMASHITA et al. 1991; LOVENBERG et al.

1999; LIU et al. 2001a). Diese wurden nach der Reihenfolge ihrer Entdeckung benannt (Histamin-1-Rezeptor bis Histamin-H4-Rezeptor; H1R – H4R), wobei hauptsächlich der H1R und der H4R am Juckreizgeschehen beteiligt sind. Dem H3R wird auch eine Rolle im Juckreizgeschehen zugeschrieben, diese ist aber eher inhibierender Natur (ROSSBACH et al.

2011).

Einleitung

2

Die Weiterleitung des Juckreizsignals wird insbesondere über die Transient Receptor Potential-Ionenkanäle (TRP-Kanäle) vermittelt (KITTAKA u. TOMINAGA 2017). Sechs Unterfamilien gehören der Familie der TRP-Kanäle an (NILIUS u. OWSIANIK 2011).

Insbesondere der Transient Receptor Potential Vanilloid 1-Kanal (TRPV1-Kanal) ist nachweislich am Mechanismus der Weiterleitung des histamininduzierten Juckreizsignals beteiligt (SHIM et al. 2007), aber auch bei anderen Juckreizmediatoren spielt er eine Rolle (z. B. IL-31; CEVIKBAS et al. 2014). Ob weitere TRP-Kanäle am histaminassoziierten Juckreiz beteiligt sind, ist noch nicht hinreichend bekannt. Zudem ist bislang nicht untersucht, ob Unterschiede in der Signalweiterleitung zwischen über den H1R und H4R induzierten Juckreiz vorliegen. Ein häufig im Zusammenhang mit sowohl akutem als auch chronischem Juckreiz auftauchender TRP-Kanal ist der Transient Receptor Potential Ankyrin 1-Kanal (TRPA1-Kanal; ZHANG 2015). Dieser stellt somit ein mögliches Ziel zur Behandlung pruritischer Erkrankungen dar.

Juckreiz kann sehr vielfältige Ursachen haben. Hierbei sind nicht nur Haut-, sondern auch eine Vielzahl anderer Erkrankungen, von inneren bis hin zu psychisch bedingten, zu beachten.

Eine meist mit starkem Juckreiz einhergehende, allergisch entzündliche Erkrankung ist die atopische Dermatitis (AD). Beim Hund ist dieses Krankheitsbild die am meisten mit Juckreiz assoziierte Hauterkrankung. Sie stellt außerdem bei Säuglingen und Kleinkindern eine der am häufigsten vorkommenden chronischen Hauterkrankungen dar (bis zu 20 % der Kinder betroffen). Sie tritt jedoch auch noch im Erwachsenenalter auf (WILLIAMS et al. 1999;

SILVERBERG u. HANIFIN 2013; WALLACH u. TAIEB 2014).

In atopischer Haut konnten erhöhte Histaminspiegel nachgewiesen werden (RUZICKA u.

GLUCK 1983). Dennoch haben die vielfach therapeutisch eingesetzten H1R-Antagonisten hier keine anti-pruritische Wirkung (YOSIPOVITCH et al. 2003). Der Einsatz von H4R- Antagonisten, v. a. in Kombination mit H1R-Antagonisten, hat im Mausmodell eine sowohl anti-inflammatorische als auch anti-pruritische Wirkung (KÖCHLING et al. 2017). Der H4R scheint eine vielversprechende Zielstruktur zur Behandlung pruritogener Erkrankungen zu sein (THURMOND 2015).

Trotz vieler Studien zur anti-pruritischen Wirkung des H4R ist der Signalweg des über den H4R induzierten Juckreizes weiterhin unbekannt. Ebenso ist unbekannt, welche der TRP-

Einleitung

3

Kanäle und anderen Moleküle oder Enzyme an der Weiterleitung des über den H4R ausgelösten Signals beteiligt sind. Diese Studie soll dazu beitragen, Teile des Signalwegs der über den H4R induzierten Juckreizweiterleitung aufzudecken und somit neue Therapieansätze für allergische Erkrankungen, die mit Juckreiz einhergehen, aufzudecken. Hierzu werden sowohl in In-vivo- als auch in In-vitro-Modellen verschiedene TRP-Kanal-Inhibitoren nach Stimulation mit H4R-Agonisten getestet. Weiterhin werden im In-vivo-Modell diverse Proteinkinase-, Phospholipase- und Adenylyzyklase-Inhibitoren untersucht, für welche teilweise bereits eine Beteiligung an der histamininduzierten Juckreizweiterleitung gezeigt wurde (KREMER et al- 2014).

Literatur

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2. Literaturübersicht

2.1. Juckreiz

Im siebzehnten Jahrhundert definierte der aus Tübingen stammende Arzt Samuel Hafenreffer Juckreiz als eine unangenehme Empfindung, die Kratzen mit den Fingernägeln oder anderen Gegenständen hervorruft (HAFENREFFER 1660). Juckreiz und die damit einhergehende Kratzantwort dienen vor allem zum Schutz des Körpers vor potentiell gefährlichen Organismen und schädlichen Substanzen, welche in Kontakt mit der Haut gekommen sind (PAUS et al. 2006). Die Juckreizempfindung und verschiedene Formen des Kratzverhaltens finden sich in einer Vielzahl von Spezies von Nagern über Vögel bis hin zum Menschen. Der Mensch zeigt Juckreiz vorwiegend in Form von Kratzen mit den Händen, Scheuern und Reiben. Im Gegensatz dazu zeigen z. B. Hunde neben Scheuern der betroffenen Stelle ein Kratzen mit der Hinterpfote und ein Belecken oder Beknabbern (NUTTALL u. MCEWAN 2006). Ähnlich verhält es sich auch bei den vielfach in der Forschung verwendeten Mäusen und Ratten (SHIMADA u. LAMOTTE 2008).

Chronischer Pruritus geht in den meisten Fällen mit Sekundärläsionen einher. Durch die Traumatisierung der Haut werden Entzündungsmediatoren, wie z. B. Interleukine (IL-2, IL-4, IL-13, IL31), Tumornekrose Faktor α (TNFα), Leukotriene und Prostaglandine (PGE1/2) ausgeschüttet. Dies wiederum verstärkt den Juckreiz (TOTH et al. 2015). Dieser als „Juck- Kratz-Zyklus“ (itch-scratch cycle) bezeichnete Kreislauf ist häufig resistent gegenüber topischen oder systemischen Therapien (KLEIN u. CLARK 1999). Chronischer Juckreiz bedeutet für die Betroffenen erheblichen Stress und kann u. a. zu Leistungs- und Konzentrationsschwäche, Schlafstörungen, Veränderungen der Essgewohnheiten, Depressionen und sogar Angststörungen führen (SHEEHAN-DARE et al. 1990; LEADER et al. 2015; MOLLANAZAR et al. 2016; REICH et al. 2016). Somit ist bei diesen Patienten die Lebensqualität, je nach Intensität des Juckreizes, z. T. sehr stark vermindert.

2.1.1. Ursachen

Pruritus ist ein bei sehr vielen Hauterkrankungen vorkommendes Symptom, z. B. bei allergischen Reaktionen, bakteriellen oder fungalen Infektionen, cutanem T-Zellymphom, Psoriasis (Schuppenflechte), atopischer Dermatitis (Neurodermitis, AD) oder

Literatur

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Ektoparasitenbefall (LEADER et al. 2015). In der caninen Dermatologie ist dieser mit einem Vorkommen von über 30 Prozent das am häufigsten vorkommende klinische Symptom (OLIVRY u. BÄUMER 2015), aber auch eine große Bandbreite an nicht mit der Haut assoziierten Erkrankungen kann zu Juckreiz führen. Hierzu zählen viele innere Erkrankungen, welche beim Hund eine untergeordnete Rolle spielen, (neurogener Juckreiz) wie z. B.

Entzündungen und Infektionen, Hyperthyroidismus, chronische Lebererkrankungen, Nierenversagen, metabolische Erkrankungen (z. B. Eisenmangel) und sogar einige Krebserkrankungen, wie das Hogkin’s Lymphom (LEADER et al. 2015). Ebenso können neurologische und psychosomatische (z. B. Akrenbelecken beim Hund, Parasitenwahn beim Menschen) Erkrankungen ursächlich für Juckreiz sein. Zu den neurologischen Erkrankungen, die mit Pruritus einhergehen können, zählt die beim Cavalier King Charles Spaniel sehr häufig auftretende Syringomyelie (Chiara-ähnliche Malformation). Beim Menschen sind hier die postherpetische Neuralgie nach einer überstandenen Gürtelrose, einige Hirntumoren, multiple Sklerose oder auch Nervenkompressionen und -irritationen (Brachioradialer Juckreiz) zu nennen (OAKLANDER et al. 2003; TOTH et al. 2015). Pruritus kann auch nach Medikamentenapplikation entstehen, entweder in Form einer allergischen Reaktion auf die applizierte Substanz (z. B. Penicilline) oder durch Aktivierung oder Hemmung von bestimmten Rezeptoren, z. B. von Opioidrezeptoren (UMEUCHI et al. 2003; GANESH u.

MAXWELL 2007).

2.1.1.1. Botenstoffe

So wie es verschiedene Ursachen für Juckreiz gibt, so gibt es auch keinen universellen Botenstoff für diesen. In den letzten zehn bis zwanzig Jahren wurde eine Vielzahl an Botenstoffen entdeckt. Diese lösen entweder direkt durch Bindung an Rezeptoren oder indirekt durch Freisetzung anderer Juckreizmediatoren Juckreiz aus. Zum Großteil sind ihre Wirkmechanismen noch ungeklärt (KREMER et al. 2014). Der wohl am besten untersuchte Juckreizmediator ist das biogene Amin Histamin (SIMONE et al. 1987; SIMONE et al. 1991;

KREMER et al. 2014). Daneben gibt es allerdings noch eine große Bandbreite weiterer Botenstoffe wie z. B. Serotonin, Proteasen und Kinine (Trypsin, Chymotrypsin, Bradykinin, Kallikrein), Zytokine (z. B. IL-4, IL-31, TSLP, TNFα), Prostaglandine (PGE2, PGD2), Opioide, Nervenwachstumsfaktor (NGF) und Neuropeptide (Substanz P, Neurokinin A) (PAUS et al. 2006; STEINHOFF et al. 2006; KREMER et al. 2014; STORAN et al. 2015;

Literatur

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MOLLANAZAR et al. 2016). Die Botenstoffe werden in histaminerg und nicht-histaminerg unterteilt. Abbildung 1 zeigt beispielhaft die Vielfalt der bei der Juckreizentstehung involvierten Botenstoffe und der von ihnen aktivierten Rezeptoren.

Abbildung 1: In der Haut von Effektorzellen freigesetzte pruritogene Botenstoffe nach MOLLANAZAR et al. (2016) Effektorzellen (z. B. Lymphozyten [T-Zellen], Mastzellen, Eosinophile, Neutrophile und Keratinozyten) in der Haut setzen verschiedene pruritogene Mediatoren frei, welche die auf den terminalen Enden der sensorischen Nervenfasern exprimierten Rezeptoren in der Haut aktivieren.

Mastzelle Histamin

Eosinophiler

Neutrophiler Keratinozyten Makrophage T-Zelle Nervenendigung in der Haut

Literatur

7 2.1.2. Mechanismen und Neurophysiologie

Viele Studien zur Aufdeckung der molekularen Juckreizmechanismen zeigen, dass vor allem das periphere Nervensystem kutane sensorische Stimuli in elektrische Signale umwandelt und diese an das zentrale Nervensystem weiterleitet (KITTAKA u. TOMINAGA 2017). Exogene und endogene Stimuli, ausgeschüttet von Immun-, Epithel- oder Endothelzellen, induzieren die Aktivierung von Signalkaskaden von der Peripherie über DRGs und das Rückenmark zum zentralen Nervensystem (ZNS). Über einen direkten Axon-Reflex-Mechanismus setzen Nervenendigungen Neuropeptide frei. Diese verstärken die Juckreizantwort durch die Stimulation der Freisetzung weiterer prurizeptiver Mediatoren aus Mast-, Endothel- und Epithelzellen (STEINHOFF et al. 2006).

Eine der ersten Theorien zur Juckreizweiterleitung ist die „Intensitätstheorie“ (intensity theory of itch). Hierbei gehen Forscher davon aus, dass Juckreiz eine milde Form von Schmerz darstellt und dass die selben Neuronen für die Schmerz- und Juckreizsensation verantwortlich sind (VON FREY 1922). Heute weiß man, dass geringe Mengen schmerzauslösender Mittel (Algogene) keinen Juckreiz auslösen (TOTH et al. 2015).

Ein alternativer Gedanke ist die sogenannte „Spezifitätstheorie“ (labeled-line theory/specificity theory of itch). Hier geht man davon aus, dass es ein autonomes prurizeptives System gibt, das unabhängig von der Schmerzempfindung besteht. Dieses Modell geht davon aus, dass spezielle Rezeptorstrukturen und neuronale Signalwege existieren, die ausschließlich Juckreiz verarbeiten (SCHMELZ et al. 1997; ANDREW u.

CRAIG 2001; TOTH et al. 2015). Dies steht im Widerspruch zur Beobachtung, dass die chemische Ablation sensorischer Neurone mit Capsaicin Defizite, sowohl in der Juckreizempfindung als auch in der Nozizeption, verursachen (TOTH et al. 2015). Weiterhin wurde die Entdeckung gemacht, dass schmerzhafte und mechanische Stimuli die Juckreizempfindung unterdrücken können (MURRAY u. WEAVER 1975; WARD et al.

1996; YOSIPOVITCH et al. 2007). Ein pharmakologisch angewandtes Beispiel ist der Schmerz auslösende TPRV1-Agonist Capsaicin, welcher topisch als antipruritische Substanz eingesetzt wird (SHIM u. OH 2008). Hier wird vermutet, dass dieser eine juckreizlindernde Wirkung durch seine schmerzauslösenden Effekte hervorruft (SHIM u. OH 2008).

Eine Art Kompromiss zwischen den beiden genannten Theorien stellt die sogenannte

„Selektivitätstheorie“ (selectivity theory of itch) dar. Diese besagt, dass juckreizsensitive

Literatur

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Neurone eine spezifische Untergruppe der nozizeptiven Neurone darstellen. Diese Theorie bietet eine Erklärung zu den Mechanismen, warum es durch Capsaicin zu einer gleichzeitigen Verminderung von Schmerz und Juckreiz durch eine Desensibilisierung kommt (TOTH et al.

2015). Bis heute ist nicht eindeutig geklärt, welche der beiden letztgenannten Theorien eine bessere Erklärung zur Juckreizweiterleitung darstellt (TOTH et al. 2015). Es ist weiterhin möglich, dass Schmerz und Juckreiz über zwei anatomisch separate neuronale Wege weitergeleitet werden, obwohl einige Substanzen, wie Capsaicin, beide Wege ansprechen können. Die Vermutung liegt nahe, dass es zwei verschiedene, aber nicht völlig voneinander unabhängige Signalwege gibt, die sich einige molekularen Mechanismen wie z. B. die TRP- Kanäle, teilen (TOTH et al. 2015).

BICKFORD (1939) stellte schon früh die Hypothese auf, dass Juckreiz, ebenso wie Schmerz, über feine C-Fasern vermittelt wird. Die sogenannten polymodalen C-Fasern machen ca. 80

% der C-Fasern aus und können durch verschiedene chemische, mechanische und thermische Reize aktiviert werden (SCHMIDT et al. 1997). Die meisten dieser Fasern reagieren nicht bis sehr schwach auf Histamin (HANDWERKER et al. 1991). Die übrigen 20 % der Fasern sind hauptsächlich mechano-insensitive Nozizeptoren. Sie werden durch chemische Stimuli entweder direkt durch Kontakt mit den Mediatoren, oder indirekt durch die Ausschüttung juckreizübermittelnder Substanzen, z. B. aus Mastzellen, aktiviert (SCHMIDT et al. 1995;

SCHMIDT et al. 1997) und können aufgrund einer Entzündung auf mechanische Reize sensibilisiert werden. In dieser letzten Gruppe befinden sich einige Untereinheiten (ca. 20 %), die sehr stark und langanhaltend auf Histamin, aber nicht auf mechanische Stimuli, reagieren (SCHMELZ et al. 1997). Insgesamt machen diese juckreizvermittelnden C-Fasern nur ca. 5 % der gesamten afferenten C-Fasern beim Menschen aus (SCHMELZ et al. 1997). Diese marklosen Fasern haben ein großes Innervationsgebiet in der Dermis-/Epidermisgrenze (SCHMELZ et al. 1997). Beim Juck-Kratzreflex leiten die aktivierten C-Fasern in den oberen Hautschichten elektrische Signale zu den oberflächlichen Schichten des Dorsalhorns des Rückenmarks weiter (SCHMELZ et al. 1997). Vom Rückenmark wird das Signal über spinothalamische Projektionen an den Thalamus weitergeleitet und von dort in den Inselcortex projiziert (ANDREW u. CRAIG 2001;

SIMONE et al. 2004). Des Weiteren werden von dort motorische Areale aktiviert, die vermutlich für die stattfindende Juckreizantwort in Form von Kratzen verantwortlich sind

Literatur

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(MOCHIZUKI et al. 2003; PAUS et al. 2006). Zu den aktivierten Arealen zählen der primäre und sekundäre somatosensorische Cortex, der prämotorische und supplementäre motorische Cortex, der inferiore parietale Lobus, das Cerebellum, und einige Regionen im Temporallappen (PAUS et al. 2006; TOTH et al. 2015). Abbildung 2 zeigt einige der aktivierten Hirnregionen und ihre Funktionen. Es scheint zudem, dass der durch andere nicht- histaminerge Mediatoren ausgelöste Juckreiz über vom Histamin unabhängige Wege an das ZNS weitergeleitet wird (STEINHOFF et al. 2006). Als Beispiel sei hier der durch die Haare der Juckbohne (mucuna pruriens) ausgelöste Juckreiz genannt, der über den Protease aktivierten Rezeptor 2 (PAR2) vermittelt wird (DAVIDSON et al. 2007; JOHANEK et al.

2007; NAMER et al. 2008). Intradermales Einbringen dieser Haare führte in der Studie von NAMER et al. (2008) zu einer Aktivierung von mechanosensitiven, Histamin-insensitiven C- Fasern. Dies führte zur Annahme, dass es verschiedene Typen von Juckreiz-weiterleitenden Neuronen in der Peripherie gibt. NAKANO et al. (2008) untersuchten diese These durch Auswertung der Fos-Expressionsmuster nach Gabe verschiedener Juckreizstimuli. Die intradermale Gabe von Histamin oder SLIGR-NH₂ zeigte, dass unterschiedliche Neuronenpopulationen in verschiedenen Regionen des Dorsalhorns aktiviert werden.

RINGKAMP et al. (2011) zeigten zusätzlich, dass auch myelinisierte A-Fasern an der Juckreizempfindung, ausgelöst durch die Juckbohne, beteiligt sind. PAPOIU et al. (2012) konnten zudem nachweisen, dass es durch die Juckreizauslösung mit verschiedenen Substanzen (hier Histamin und Juckbohne) zu unterschiedlichen Aktivierungsmustern im Gehirn kommt. Dennoch wird immer eine gemeinsame Menge an Kernstrukturen aktiviert.

Ebenso verhält es sich bei chronischem Juckreiz. Je nach Ursache für diesen (z. B. AD, Psoriasis, Nierenversagen) kommt es zu unterschiedlichen Akivitätsprofilen des ZNS (MOLLANAZAR et al. 2016).

Literatur

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Abbildung 2: Zentrale Juckreizverarbeitung, modifiziert nach PAUS et al. (2006)

Primäre prurizeptive afferente Neurone der Haut aktivieren spinale Neurone der Lamina I des Dorsalhorns des Rückenmarks. Diese projizieren in den Thalamus. Direkte exzitatorische Verbindungen des Thalamus beinhalten den anterioren cingulären Cortex (ACC), den Inselcortex (Insula) und die primären und sekundären somatosensorischen Cortices. Zusammenfassend dargestellt sind die möglichen Funktionen der bei bildgebenden Studien aktivierten Hirnregionen. SMA = supplementärer motorischer Cortex, PMA = prämotorischer Cortex, PF = präfrontaler Cortex, OrbitoF = orbitofrotnaler Cortex, PAG = periaqueduktales Grau,SI/SII = primärer und sekundärer somatosensorischer Cortex

SMA PMA

Motorische Antwort Kratzen

Rückenmark Haut

Prurizeptive afferente Fasern

Prurizeptive Projektionsneurone,

Lamina I

Räumliche, zeitliche und Intensitätsaspekte;

Lokalisierung schädlicher Noxen

Vergnügen/Belohnung, Aversion, Zielsetzung, Entscheidungsfindung;

Zwanghaftes Kratzen

Affektives Verhalten, Aversion,

Leiden Modulation, Interaktion, Schmerz, Inhibition Juckreiz

Literatur

11 2.2. Histamin

Das biogene Amin Histamin, oder auch 2-(4-Imidazolyl)ethylamin (C₅H₉N₃), ist im Körper ubiquitär verbreitet. Es zählt zu den Gewebshormonen und befindet sich u. a. in der Haut, der Lunge, der Schleimhaut des Magen-Darm-Trakts sowie im Hypothalamus (DALE u.

LAIDLAW 1910; BEST et al. 1927; SCHWARTZ et al. 1991). Gespeichert wird es in höheren Mengen in intrazellulären Vesikeln der Mastzellen (RILEY 1953), eosinophilen und basophilen Granulozyten (GRAHAM et al. 1955) sowie enterochromaffin-ähnlichen (ECL) Zellen der Magenschleimhaut (PRINZ et al. 2003).

Nach Entdeckung des ß-Imidazolylethylamins im Mutterkorn (BARGER u. DALE 1910) wurden kurze Zeit später, noch bevor die Rezeptortheorie weitgehend akzeptiert war, die ersten Wirkungen des Histamins entdeckt (BARGER u. DALE 1910; DALE u. LAIDLAW 1910). Unter anderem konnte gezeigt werden, dass es bei einer Histaminapplikation durch eine Vasodilatation zu einer Blutdrucksenkung bis hin zum tödlichen Schock kommen kann.

Die Bezeichnung "Histamin" wurde wenige Jahre später von DALE u. RICHARDS (1918) eingeführt. Eine erste Isolation aus tierischem Gewebe gelang fast 20 Jahre nach der Entdeckung (BEST et al. 1927), wodurch der Beweis erbracht wurde, dass Histamin ein im lebenden Organismus natürlich vorkommender Stoff ist und dort physiologische Funktionen übernimmt. Histamin moduliert die Funktion von antigenpräsentierenden Zellen (dendritischen Zellen, Makrophagen), T-Zellen, B-Zellen, epithelialen und endothelialen Zellen. Weiterhin beeinflusst es die Proliferation von T-Zellen, die Zytokinsekretion von dendritischen Zellen und die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Monozyten (z. B.

ICAM-1; BÄUMER u. ROSSBACH 2010). Hieraus ergibt sich seine Funktion als wichtiger Mediator bei Entzündungsreaktionen. Bei intradermaler Injektion von Histamin kommt es zu der sogenannten „triple response“. Diese setzt sich zusammen aus lokal begrenzter Hautrötung, Erythem (diffuse Rötung) und juckender Quaddelbildung (LEWIS u.

ZOTTERMAN 1927). Eine große Bedeutung kommt Histamin bei der allergischen Reaktion des Soforttyps zu (Typ-I-Allergie; BÄUMER u. ROSSBACH 2010). Schon seit langer Zeit werden in diesem Zusammenhang H1R-Antagonisten zur Therapie von z. B. allergischer Rhinitis oder Urtikaria eingesetzt (ORTONNE 2012; CHURCH 2017).

Über die verschiedenen Histaminrezeptoren übernimmt dieses Amin im Körper vielschichtige physiologische und pathophysiologische Aufgaben (BÄUMER u. ROSSBACH 2010).

Literatur

12 2.3. Histaminrezeptoren

Heute kennt man vier G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die Histamin als Liganden besitzen. Nach der Reihenfolge ihrer Entdeckung, welche eine Zeitspanne von fast 100 Jahren abdeckt, werden sie Histamin-1- bis -4-Rezeptor genannt (H1R-H4R). 1930 bis 1940 wurden die ersten Substanzen entwickelt, die die Histaminwirkung blockierten (H1R-Antagonisten).

Man stellte fest, dass dies über eine kompetitive Bindung an einen Rezeptor passierte, der heute als H1R bekannt ist (WELLS et al. 1945). Diese ersten Antihistaminika bildeten die Basis für sehr erfolgreiche und z. T. bis heute eingesetzte Medikamente. Nichtsdestotrotz wurden durch diese Substanzen, da sie nicht alle durch Histamin ausgelösten Reaktionen hemmen konnten, eine Vielzahl neuer Fragen aufgeworfen. Diese führten zu der Annahme, dass es einen weiteren Histaminrezeptor geben könnte, den H2R (ASH u. SCHILD 1966).

Ähnlich wurde der H3R entdeckt - es fiel auf, dass einige Histaminrezeptor-Liganden, deren Pharmakologie nicht zu der Wirkung vom H1R und H2R passten, Histaminwirkungen im Gehirn beeinflussten (ARRANG et al. 1983). Ab den 1990er Jahren wurden neue Rezeptoren fast nur noch über die Identifizierung ihrer Gensequenz entdeckt und nicht mehr ausschließlich über ihre Pharmakologie. In den frühen 90er Jahren wurde die cDNA des H1R und H2R das erste Mal kloniert (GANTZ et al. 1991a; GANTZ et al. 1991b; DEBACKER et al. 1993). Für den H3R gelang dies erst Ende der 90er-Jahre (LOVENBERG et al. 1999).

Durch die Entdeckung der Gensequenzen wurde ein neues Werkzeug geschaffen, um weitere homologe Sequenzen in bestehenden Datenbanken zu finden. Auf diesem Weg fand man einen Rezeptor, der zu ca. 35 % mit dem H3R übereinstimmte und eine sehr hohe Affinität zu Histamin besaß (LIU et al. 2001a). Dieser Rezeptor ist heute als H4R bekannt und wurde von sechs unabhängig voneinander arbeitenden Forschungsgruppen nahezu gleichzeitig beim Menschen charakterisiert und kloniert (NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000; LIU et al.

2001a; MORSE et al. 2001; NGUYEN et al. 2001; ZHU et al. 2001). Im Gegensatz zum H3R war der H4R eine Neuentdeckung und seine Funktion(en) dadurch vollkommen unbekannt.

Erste Hinweise lieferte die nachgewiesene Expression im Knochenmark (NAKAMURA et al.

2000; LIU et al. 2001a) und auf hämatopoetischen Zellen (NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000), welche bekannt dafür sind, im inflammatorischen Geschehen und bei Immunantworten beteiligt zu sein. Eine Übersicht über die Histaminrezeptoren findet sich in Tabelle 1.

Literatur

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2.3.1. Intrazellulärer Signalweg des histamininduzierten Juckreizes in sensorischen Neuronen

Ein möglicher Signalweg des über den H1R induzierten Juckreizes wurde von KREMER et al. (2014) beschrieben. Der an ein G-Protein gekoppelte H1R wird durch Histamin oder andere H1R-Agonisten stimuliert. Dadurch aktiviert er das membranassoziierte Enzym Phospholipase Cß3 (PLCß3), welches über drei G-Proteinuntereinheiten mit dem H1R verbunden ist (Gαq, G11, Gßγ; KREMER et al. 2014). Dieses Enzym katalysiert die Hydrolysierung des Membranphospholipids Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat (PIP2) in die second messenger Diacylglycerol (DAG) und Inositoltriphosphat (IP3) (HAN et al. 2006).

DAG aktiviert die Proteinkinase Cε (PKCε), welche den TRPV1-Kanal phosphoryliert und somit aktiviert (PRESCOTT u. JULIUS 2003). Die Aktivierung des TRPV1-Kanals führt zu dessen Öffnung und macht das Durchtreten von positiv geladenen Ionen wie Natrium, Kalium und Calcium möglich. Dies wiederum führt zu einer Depolarisation, wodurch spannungsabhängige Natriumkanäle aktiviert werden, die ein Aktionspotential entlang der Nervenfaser generieren und so zur Juckreizempfindung führen (KIM et al. 2004; PAUS et al.

2006; SHIM et al. 2007). Es wurde zudem gezeigt, dass die Entfernung des oben genannten PIP2 den TRPV1 disinhibiert (PRESCOTT et al. 2003). Für die PIP2-abhängige Aktivierung des TRPV1 wird das Membranprotein phosphoinositide-interacting regulator of transient receptor potential channels (PIRT) benötigt (KIM et al. 2008; PATEL et al. 2011). Ein weiterer Weg zur Aktivierung des TRPV1-Kanals nach Aktivierung des H1R führt über die direkte Aktivierung des Enzyms Phospholipase A2 (PLA2). Diese führt zu einem Ca²⁺-

Abbildung 3: Strukturformel Histamin

https://chem.nlm.nih.gov/chemidplus/name/histamine (abgerufen: 22.08.2017)

Literatur

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Anstieg und zur Freisetzung von Arachidonsäure. Welche wiederum durch das Enzym Lipoxygenase (LO), zu diversen Produkten metabolisiert wird, darunter z. B. zur 12-Hydroperoxyeicosatetraenoischen Säure (12-HPETE). 12-HPETE selbst aktiviert nun den TRPV1-Kanal (KIM et al. 2004; SHIM et al. 2007). Histamininduzierter Juckreiz kann neben H1R-Antagonisten auch durch andere Inhibitoren an jeder Stufe dieses Signalweges inhibiert werden (Abb. 4). SHIM et al. (2007) zeigten z. B., dass der intradermal durch Histamin induzierte Juckreiz bei CD-1-Mäusen auch durch PLA2-, 12-LO- und TRPV1-Inhibitoren reduziert werden kann. Zu beachten ist hierbei, dass trotz allem einige der Neurone, die auf Histamin mit einer Erhöhung des intrazellulären Calciums reagieren, nicht auf Capsaicin reagieren (11,4 %) und somit TRPV1 nicht exprimieren (KIM et al. 2004; SHIM et al. 2007).

Dies lässt vermuten, dass noch andere Mechanismen beteiligt sind. Des Weiteren sind die Signalweiterleitungsmechanismen für den H4R, der auch von Histamin aktiviert wird, noch weitestgehend unbekannt. Es ist jedoch bekannt, dass selektives Aktivieren dieses Rezeptors sowohl zu einer Erhöhung des intrazellulären Calciums in sensorischen Neuronen, als auch zu einer Juckreizantwort bei Tieren führt (BELL et al. 2004; ROSSBACH et al. 2011). Die Arbeit von JIAN et al. (2016) zeigte, dass auch beim H4R der TRPV1-Kanal und die Phospholipase C (PLC) eine Rolle spielen. Weitere Mechanismen der nachgeschalteten Signalkaskade wurden noch nicht untersucht.

Abbildung 4: Putativer Signalweg des über den H1R induzierten Juckreizes, modifiziert nach KREMER et al. (2014)

H1-Rezeptor

Histamin

Depolarisation Aktionspotentiale spannungs-

abhängige Na⁺-Kanäle

Literatur

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Tabelle 1: Übersicht über die Histaminrezeptoren und ihre Funktionen, modifiziert nach BÄUMER u.

ROSSBACH (2010)

Rezeptor H1R H2R H3R H4R

Expressions- gewebe

Nervenzellen, glatte Muskulatur in Respirations-, Gastrointestinal-, Urogenitaltrakt und Gefäßen,

Hepatozyten, Endothel- und Epithelzellen, Neutrophile, Eosinophile, Monozyten, DCs, T- und B-Lymphozyten

Nervenzellen, glatte Muskulatur im Respirationstrakt und den Gefäßen, Partietalzellen der Magenschleimhaut, Hepatozyten, Chondrozyten, Endothel- und Epithelzellen, Neutrophile, Eosinophile, Monozyten, DCs, T- und B-Lymphozyten

Histaminerge Neurone, Eosinophile, Monozyten, (DCs)

Mastzellen, Eosinophile, Basophile, DCs, T-Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Nervenzellen, dermale Fibroblasten, endokrine Zelle des Gastrointestinaltrakts

Physiologische Funktion

Kontratkion glatter Muskelzellen, Erhöhung

Gefäßpermeabilität, Schlaf-Wach-Zyklus

Glanduläre Sekretion,

Entspannung glatter Muskulatur

Neurotransmitterfrei- setzung, Steuerung von Schlaf und Nahrungsaufnahme

Chemotaxis, Zytokin-/Chemokin- produktion von Immunzellen

Pathologische Relevanz

Typ-I-Allergie (z. B. Urtikaria, Rhinokonjunktivitis) Juckreiz

Säure-induzierte Gastritis, gastroinestinale Ulzerationen

Kognitive

Störungen, Obesitas

Inflammation, Juckreiz

G-Protein Gq,11 Gαs Gi/o Gi/os

Agonisten N-methylhistapro- difen, HTMT, 2-Pyridylethylamin

Amthamin, Apromodin

Immethridine 4-Methylhistamin, ST-1006

Antagonisten/

Inverse Agonisten

Chlorpheniramin, Diphenhydramin, Loratadin,Cetirizin Deslorotadin, Fexofenandin

Cimetidin, Ranitidin Tripolisant, Pitolisant

JNJ7777120, JNJ39758979, JNJ39594906

DC = dendritische Zelle; HTMT = Histamin-Trifluoromethyl-Toluidin-Dimaleat

Literatur

16 2.4. Histamin-4-Rezeptor

Der H4R wurde von NAKAMURA et al. (2000) aus humaner Leukozyten-DNA kloniert und ist ein 44-kDa Protein mit 390 Aminosäuren. Auch er gehört zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Die Aminosäuresequenz des H4Rs stimmt mit der des H3Rs zu 35 - 43 % überein (NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000; LIU et al. 2001a; MORSE et al. 2001;

NGUYEN et al. 2001; ZHU et al. 2001). NGUYEN et al. (2001) zeigten zudem eine 58 %ige Homologie der Transmembranedomänen des H3Rs und des H4Rs.

Kurz nach der ersten Klonierung beim Menschen folgte die Klonierung des H4R in anderen Spezies wie Ratte, Maus, Meerschweinchen, Schwein, Affe und Hund (LIU et al. 2001b;

ODA et al. 2002; ODA et al. 2005; JIANG et al. 2008). Dabei stellte man fest, dass es zwischen den einzelnen Spezies große Unterschiede in der Homologie dieser Rezeptoren gibt.

Dies spiegelt sich auch in der unterschiedlichen Wirkungspotenz/Bindungsaffinität der einzelnen Agonisten und Antagonisten bei den Spezies wider (LIU et al. 2001b).

2.4.1. Vorkommen und Funktion

Im Zuge der Entdeckung wurde der H4R in einer Vielzahl von Geweben detektiert, u. a. in Herz, Niere, Leber, Lunge, Pankreas, Skelettmuskulatur, Leukozyten, Prostata, Dünndarm, Milz, Hoden, Knochenmark und Lymphknoten (NAKAMURA et al. 2000). Später wurde der H4R auch auf humanen Hautmastzellen (LIPPERT et al. 2004) oder auf Nervenzellen der Spinalganglien und im Rückenmark nachgewiesen (STRAKHOVA et al. 2009). Die Angaben zur Expression im Gehirn variieren je nach Autor. STRAKHOVA et al. (2009) zeigten eine Expression des H4R in Cortex, Cerebellum, Hirnstamm, Amygdala, Thalamus und Striatum.

LIU et al. (2001b) konnten eine Expression im Gehirn dagegen nicht bestätigen.

Neben dem H1R spielt auch der H4R eine große Rolle bei der Juckreizentstehung. Da Antihistaminika (H1R-Antagonisten) zwar wirksam in der Reduktion von Urtikaria und allergischer Rhinitis sind, aber keine Wirkung bei anderen pruritischen Erkrankungen wie der AD zeigen, stellte sich mit der Entdeckung des H4R die Frage, ob dieser für den nicht über den H1R mediierten Juckreiz verantwortlich sei. Mit H4R-Agonisten konnte in verschiedenen Studien im Mausmodell Juckreiz ausgelöst (BELL et al. 2004; DUNFORD et al. 2007;

ROSSBACH et al. 2011) und mit dem spezifischen Antagonisten JNJ7777120 geblockt

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werden (DUNFORD et al. 2007; YAMAURA et al. 2009). Auch für H4R-Antagonisten mit anderer chemischer Struktur konnte dies gezeigt werden (BELL et al. 2004; COWART et al.

2008; LIU et al. 2008; KOENIG et al. 2010; SHIN et al. 2012; SAVALL et al. 2014). Ebenso konnte bei H4R-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtypmäusen kein oder nur wenig Juckreiz durch Histamin oder H4R-Agonisten ausgelöst werden (DUNFORD et al. 2007; YU et al. 2010). Weiterhin hemmten H4R-Antagonisten bei Mäusen den Juckreiz ausgelöst durch Substanz P (YAMAURA et al. 2009), Haptene (ROSSBACH et al. 2009; SUWA et al. 2011) und auch in verschiedenen Dermatitis-Modellen (COWDEN et al. 2010a; OHSAWA u.

HIRASAWA 2012). Diese und weitere präklinische dermatologische Studien zeigten, dass H4R-Antagonisten gegen pruritische Erkrankungen wie die AD wirksam sein könnten. Des Weiteren konnte der H4R Agonist 4-Methylhistamin ebenso wie Histamin eine Degranulation der Mastzellen auslösen. Dieser Effekt konnte durch JNJ7777120 geblockt werden (JEMIMA et al. 2014). Weiterhin kam es wie bei den eosinophilen Granulozyten zu einem intrazellulären Ca²⁺-Anstieg und zu einer histamininduzierten Chemotaxis (REHER et al.

2012), welche in H4R-defizienten Mäusen nicht vorhanden war (HOFSTRA et al. 2003) . Die Effekte auf Mastzellen und Eosinophile deuten ebenfalls auf eine Beteiligung an Erkrankungen wie der AD und Asthma hin. Dies wurde durch verschiedene Arbeiten belegt.

Die Blockade des H4R bewirkte eine Reduktion der Entzündungsreaktion in verschiedenen Asthma- und AD-Modellen (COWDEN et al. 2010a; SEIKE et al. 2010; SUWA et al. 2011;

MATSUSHITA et al. 2012; OHSAWA u. HIRASAWA 2012; THURMOND et al. 2014;

ROSSBACH et al. 2016).

Es gab bereits erste klinische Studien am Menschen, in denen die antipruritische Wirkung von H4R-Antagonisten getestet wurden. Der potente und selektive H4R-Antagonist JNJ39758979 hat hier gezeigt, dass er die histamininduzierte Juckreizantwort beim gesunden Probanden im Vergleich zu der Placebo-Gruppe reduzieren konnte (KOLLMEIER et al. 2014). In einer Phase 2a Studie an Patienten mit moderater AD, konnte mit dieser Substanz ebenfalls eine Verbesserung im Pruritus-Score erzielt werden. Leider musste diese Studie aufgrund zweier Fälle von Agranulozytose abgebrochen werden. Diese Nebenwirkung wurde vermutlich durch reaktive Metaboliten des Antagonisten ausgelöst und nicht durch den Antagonismus am H4R selbst (MURATA et al. 2015). In einer aktuellen Phase-IIa-Studie reduzierte der H4R- Antagonist ZPL-389 die klinischen Symptome, inklusive des Juckreizes, von Patienten mit

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milder oder moderater AD (WERFEL et al. 2016). Weitere H4R-Antagonisten wurden in klinischen Studien getestet. Ihre Ergebnisse wurden bis zum heutigen Zeitpunkt aber nicht publiziert (THURMOND 2015). Weitere präklinische Daten lassen vermuten, dass eine Kombination aus H1R- und H4R-Antagonisten bessere Wirkungen in der Therapie pruritischer Erkrankungen erzielen kann, als die Hemmung des H1R oder H4R alleine (DUNFORD et al. 2007; ROSSBACH et al. 2009; OHSAWA u. HIRASAWA 2012;

KÖCHLING et al. 2017). Neben der Linderung des Juckreizes wurden weitere Parameter dieser Erkrankungen verbessert. Tabelle 2 zeigt eine Übersicht über einige H4R-Liganden.

Aufgrund der großen Homologie des H4R zum H3R sind einige für den H3R entwickelte Substanzen auch am H4R wirksam und werden deshalb ebenfalls in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2: Ausgewählte Histamin-4-Rezeptor-Liganden

H4R-Agonisten H3R/H4R-Agonisten H4R-Antagonisten H3R/H4R-Antagonisten

OUP-16 Immepip JNJ7777120 Thioperamid

4-Methylhistamin Imetit JNJ10191584 (VUF6002)

VUF-8430 (R)-α-Methylhistamin JNJ28307474

Dimaprit VUF5222 JNJ40279486

ST-1006 (Compound32) JNJ39758979

Clobenpropit Clozapin Burimamid

(LIU et al. 2001a; HASHIMOTO et al. 2003; JABLONOWSKI et al. 2003; THURMOND et al. 2004; LIM et al.

2005; VENABLE et al. 2005; LIM et al. 2006; SANDER et al. 2009; COWDEN et al. 2010b; ISTYASTONO et al. 2011; ROSETHORNE u. CHARLTON 2011; SAVALL et al. 2011; THURMOND et al. 2014)

2.5. TRP-Ionenkanäle

In den letzten drei Jahrzehnten haben sich die TRP-Kanäle in der biomedizinischen Forschung immer mehr in den Vordergrund gedrängt. Die TRP-Kanäle sind wenig spannungssensitive und nicht-selektive Calcium-durchlässige Kanäle. Sie bilden die TRP- Ionenkanal Superfamilie und wurden zuerst in Drosophila beschrieben (COSENS u.

MANNING 1969; MONTELL u. RUBIN 1989). In verschiedenen Spezies wurden über 100

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TRP-Gene identifiziert (NILIUS u. OWSIANIK 2011). In Säugetieren besteht die TRP- Kanal-Familie aus sechs Subfamilien (TRPC [canonical], TRPV [vanilloid], TRPM [melastin], TRPA [ankyrin], TRPML [mucolipin], TRPP [polycystic]; MINKE 2010). In Invertebraten und Fischen findet man eine siebte Unterfamilie, die der TRPN(NO-mechano- potential-/NOMP-C)-Familie (MINKE 2010). Je nach Spezies variiert die Anzahl der Kanäle in den einzelnen Subfamilien (NILIUS u. OWSIANIK 2011). Generell bestehen die TRP- Kanäle aus sechs Transmembrandomänen (S1-S6) mit einer Pore zwischen S5 und S6 (WU et al. 2010).

Abbildung 5: Phylogenetischer Stamm humaner TRP-Kanäle, modifiziert nach NILIUS u. OWSIANIK (2011)

Sequenzhomologieanalysen zeigen, dass alle TRP-Kanäle in sieben Gruppen mit verschiedenen Eigenschaften eingeteilt werden können. Es wurde der TRPC2 von der Maus und der TRPN1 vom Fisch für die Analyse verwendet, da TRPC2 beim Menschen nur ein Pseudogen darstellt und TRPN beim Säugetier nicht vorhanden ist. Hiermit sollen die Relationen zwischen den einzelnen Subfamilien gezeigt werden