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Phänotypische Charakterisierung von Epithelzellpopulationen im Thymus von BALB/c- und CCR7-defizienten Mäusen

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Academic year: 2022

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(1)

Aus der Abteilung der Grundlagenimmunologie der Medizinischen Hochschule Hannover

Angefertigt im Rahmen der Strukturierten Doktorandenausbildung StrucMed

Phänotypische Charakterisierung von Epithelzellpopulationen im

Thymus von BALB/c-

und CCR7-defizienten Mäusen

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Maren Schwämmle aus Hannover

2009

(2)

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am:

06.10.2010

Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover.

Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer: Prof. Dr. med. vet. Reinhold Förster/

Dr. rer. nat. Ana Misslitz

Kobetreuer: Prof. Dr. Reinhard Pabst

Referent: Prof. Dr. rer. nat. Ulrich Kalinke

Koreferent: Prof. Dr. med. Georg Behrens

Tag der mündlichen Prüfung: 06.10.2010

Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Hans Dieter Tröger Prof. Dr. Klaus Resch

Prof. Dr. Reinhard Schwinzer

(3)

Für meine Familie

(4)

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

………I

Abkürzungsverzeichnis

……….IV

1. Einführung

... 1

1.1 T- Lymphozyten - Untergruppen und deren Funktionen ... 1

1.2 Die Entwicklung und Reifung der T-Zellen im Thymus ... 6

1.3 Thymusepithelzellen - Untergruppen, Funktionen und Besonderheiten ... 12

1.4 Der Chemokinrezeptors 7 (CCR7) und seine Relevanz für die T-Zell-Entwicklung ... 17

1.5 Ziel der Arbeit ... 21

2. Ergebnisse

... 22

2.1 In situ Charakterisierung des thymischen Stromas in Wildtyp- und CCR7-/--Mäusen – histologische Analysen - ... 22

2.1.1 Die angefärbten Zellpopulationen ... 22

2.1.2 Kortex und Medulla - K8+ und K5+ ... 22

2.1.3 Medulläre Epithelzell-Subpopulation - K8+K5+ ... 25

2.1.4 Medulläre Epithelzell-Subpopulationen - K8-G8.8+ und K8+G8.8+ ... 26

2.1.5 Medulläre Epithelzell-Subpopulationen - K5+Ep-CAM+ und K8+K5+Ep-CAM+ .. 28

2.1.6 Negativ selektierende medulläre Epithelzellen - UEA-1+Ep-CAM+ ... 29

2.1.7 MHC-Klasse-II-Moleküle in Kortex und Medulla ... 31

2.1.8 Kostimulatorisches Molekül CD86 in Kortex und Medulla ... 33

2.1.9 Medullären antigenpräsentierende Epithelzellen - UEA-1+CD86+ ... 35

2.1.10 CD86+-dendritische Zellen in Kortex und Medulla ... 37

(5)

Inhaltsverzeichnis II

2.2 Durchflusszytometrische Analysen der Thymusepithelzellen ... 38

2.2.1 Expression von MHCII-Molekülen auf kortikalen und medullären Epithelzellen .38 2.2.1.1 Expression von MHCII-Molekülen auf kortikalen Epithelzellen ... 38

2.2.1.2. Expression von MHCII-Molekülen auf medullären Epithelzellen ... 40

2.2.2. Expression von MHCII-Molekülen auf thymischen dendritischen Zellen ... 40

3. Diskussion

... 42

3. 1 Phänotyp des CCR7-/--Thymus ... 42

3. 2 Einfluss des Verlusts von CCR7 auf Epithelzell-Progenitoren und ihre Differenzierung ... 43

3. 3 Gestörte Antigenpräsentation auf Grund von veränderten AIRE+mTEC in CCR7-/-- Mäusen? ... 44

3.4 Fehlerhafte Antigenpräsentation durch MHCII-Komplexe, kostimulatorische Moleküle und DC in CCR7-/--Mäusen als Ursache von Autoimmunität? ... 47

3.5 Fazit ... 50

4. Materialien und Methoden

... 51

4.1 Mäuse ... 51

4.2 Materialien ... 51

4.2.1 Antikörper ... 51

4.2.2 Enzyme ... 53

4.2.3 Medium und Serum ... 53

4.2.4 Reagentien ………....53

4.2.5 Chemikalien ... 53

4.2.6 Puffer und Lösungen ... 54

4.2.7 Laborinstrumente ... 54

4.2.8 Verbrauchsmaterialien ... 55

(6)

Inhaltsverzeichnis III

4.3 Methoden ... 56

4.3.1 Immunfluoreszenz-Mikroskopie ... 56

4.3.2 Herstellung und Färbung der Kryoschnitte ... 56

4.3.3 Epithelzellisolierung ... 57

4.3.4 Neubauer-Zählkammer ... 58

4.3.5 Durchflusszytometrie ... 59

4.3.6 FACS (fluorescent-activated-cell-scanner)-Färbung ... 60

5. Zusammenfassung

... 61

6. Literaturverzeichnis

... 64

7. Lebenslauf

... 81

8. Eidesstattliche Erklärung

... 82

9. Danksagungen

………...83

(7)

Abkürzungsverzeichnis IV

Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius

μl Mikroliter

μm Mikrometer

Abb. Abbildung

Abs. Absatz

AIRE Autoimmune regulator

aly Alymphoplastic

AMP Adenosine monophosphate

APECED Autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy ATP Adenosine triphosphate

CCL CC-chemokine ligand

CCR CC-chemokine receptor

CD Cluster of differentiation cDC Conventional dendritic cell

c-Kit Transmembran-Rezeptor-Tyrosin-Kinase CMJ Cortico medullary junction

CO2 Kohlenstoffdioxid

CSF Colony-stimulating factor cTEC Cortical thymic epithelial cell

CTL Cytotoxic T-cell

CTLA Cytotoxic T-lymphocyte antigen

CXCR CXC-chemokine receptor

cy Cyanine

DAPI 4’,6-Diamidin-2’-phenylindol

DC Dendritic cell

DN Double negative

DNA Deoxyribonucleic acid

DO11.10 Transgene T-Zelle, die nur auf das OVA323–339 Epitope reagiert

DP Double positive

E Embryonaltag

EAE Experimentelle autoimmun-Enzephalomyelitis EDTA Ethylene-diamine-tetraacetic acid

(8)

Abkürzungsverzeichnis V

Ep-CAM Epithelial cell adhesion molecule et al. Et alii

FACS Fluorescence-activated cell sorting FCS Fetal calf serum

FITC Fluorescein-Isothiocyanat

Flt3 Fms-like tyrosine kinase receptor-3 Foxp3 Forkhead-Box-Protein P3

FSC Forward scatter

g Gramm

G8.8 Antikörper gegen Ep-CAM

GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor

Gr Granulozyten

H2O Wasser

HBSS Hanks' balanced salt solution

HCL Salzsäure

HE Hämatoxylin-Eosin

HEV High endothelial venule HSC Hematopoietic stem cell

Ig Immunglobulin

ICAM Intercellular adhesion molecule ICOS Inducible t-cell costimulator

IFN Interferon

IL Interleukin

K Keratin

kD Kilo Dalton

LAG Lymphocyte-activation gene

LFA Lymphocyte function-associated antigen

LPS Lipopolysaccharid

LSK Lineage-negative Sca-1 Kit LTβR Lymphotoxin β-Rezeptor

Ly51 Type II homodimeric transmembrane glycoprotein MHC Major histocompatibility complex

ml Milliliter

(9)

Abkürzungsverzeichnis VI

MPP Multipotential progenitor mRNA Messenger ribonucleic acid mTEC Medullary thymic epithelial cell

NaCl Natriumchlorid

NF Nuclear factor

NIK Nuclear factor-κB-inducing kinase

NK Neutrale Killerzellen

nm Nanometer

OVA Ovalbumin

PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase chain reaction pDC Plasmatic dendritic cell

PE Phycoerythrin

PerCP Peridinin chlorphyll protein

pgp Phagozyten Glykoprotein

pH Potentia Hydrogenii

pKS Negativer dekadischer Logarithmus der Gleichgewichtskonstante Plt Paucity of lymph node T cells

PP Peyer's patch

PSGL P-Selektin-Glykoproteinligand RAG Recombination activating gene RelB Protein, kodiert vvom RELB-Gen

rpm Revolutions per minute

RPMI Roswell Park Memorial Institute

SA Streptavidin

Sca Stem cell antigene

SCF Stem cell factor

SCID Severe combined immunodefinciency defect Scya19 Gen, kodiert CCL19

SDF Stromal cell-derived factor

SP Single positive

spp Species pluralis

SSC Side scatter

TCR T-cell receptor

(10)

Abkürzungsverzeichnis VII

Tcrb T-cell receptor β-chain Tcrd T-cell receptor δ-chain Tcrg T-cell receptor γ-chain TDC Thymic dendritic cell TEC Thymic epithelial cell

Ter119 Antikörper gegen Glycophorin-A assoziiertes Antigen

TH T-Helferzellen

TNF Tumor necrosis factor

TNFR Tumor necrosis factor receptor TR T-Zelle, regulatorischer Typ

TRITC Rhodamin

TSA Tissue specific antigen UEA Ulex europaeus agglutinin VDJ Variable, diversity, joining

VLA Very late antigen

vs. Versus

XPED X-linked polyendocrinopathy immunodeficiency and diarrhea VCAM Vascular cell adhesion molecule

(11)

1. Einführung 1

1. Einführung

1.1 T- Lymphozyten - Untergruppen und deren Funktionen

T-Zellen sind Teil des Immunsystems des menschlichen und höheren tierischen Organismus. Sie werden zusammen mit den B-Zellen als Lymphozyten, eine Untergruppe der Leukozyten, bezeichnet. Lymphozyten gehören zur adaptiven Immunabwehr. Sie erlangen auf ihrem Reifungsweg, im Gegensatz zu Zellen des unspezifischen angeborenen Immunsystems (wie Phagozyten, polymorph-kernige neutrophile Granulozyten und dem Komplementsystem) die Fähigkeit, spezifisch auf nur ein Antigen reagieren zu können.

T-Zellen reifen aus derselben Vorläuferzelle wie die B-Zellen im Knochenmark heran und verlassen es als T-Vorläufer-Zellen, im Gegensatz zu den B-Zellen, jedoch früh durch die Blutbahn Richtung Thymus. Dort findet die vollendete Entwicklung und Differenzierung zu funktionstüchtigen T-Zellen statt. Nach der Reifung im Thymus verlassen sie diesen und zirkulieren in sekundäre lymphatische Organe, wie die Lymphknoten. Alle ausgereiften T- Zellen, die den Thymus verlassen, kennzeichnet die Expression des T-Zell-Rezeptors (t-cell receptor, TCR) auf ihrer Oberfläche. Je nach Phänotyp, Funktion und Signalmolekül- Ausschüttung werden die T-Zellen weiter in verschiedenen Untergruppen eingeteilt: In T- Helferzellen und ihre Subpopulationen, regulatorische T-Zellen und ihre Untergruppen, zytotoxische T-Zellen und NK-T-Zellen. Zusätzlich werden die T-Zellen in unterschiedliche Aktivierungszustände eingeteilt. Man unterscheidet hierbei naive, Effektor- und Gedächtnis- T-Zellen. Die T-Zellen, die den Thymus nach ihrer Reifung verlassen haben, werden als naive T-Zellen bezeichnet, da sie bisher noch nicht aktiviert wurden. Nach dem Eintreten in einen Lymphknoten kommt es durch Kontakt mit antigenpräsentierenden Zellen, wie beispielsweise dendritischen Zellen (DC), zur Aktivierung, Proliferation und Weiterdifferenzierung der T- Zellen. Sind die T-Zellen ausdifferenziert und haben ihre jeweiligen Funktionen aufgenommen, werden sie als Effektor-Zellen bezeichnet. Einige der T-Zellen schlagen nach ihrer Aktivierung den Weg zu Gedächtnis-T-Zellen (memory t-cell) ein. Sie verweilen in einer inaktiven Form, bis sie reaktiviert werden.

Im Folgenden wird kurz auf die einzelnen T-Zell-Subpopulationen eingegangen.

Die T-Helferzellen (TH-Zellen) exprimieren zusätzlich zum TCR den Rezeptor CD4.

Sie werden noch weiter in TH1, TH2, TFH- und TH17-Zellen unterteilt. Die

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1. Einführung 2

Weiterdifferenzierung einer CD4+-T-Zelle in eine der vier Subpopulationen hängt von der Präsenz des jeweiligen Zytokinmilieus ab, das von Zellen des angeborenen Immunsystems und DC je nach Konfrontation mit mikrobiellen oder parasitären Antigenen erstellt wird.

Zytokine sind Glykopeptide, die regulatorisch auf Zellen einwirken können. Man kann im wesentlichen fünf Hauptgruppen von Zytokinen unterscheiden: Interferone, Interleukine, koloniestimulierende Faktoren (Colony-Stimulating Factor, CSF), Tumornekrosefaktoren (TNF) und Chemokine.

IFN-γ und IL-12 initiieren die Differenzierung der CD4+-T-Zellen zu TH1-Zellen (Szabo et al., 1997). TH1-Zellen schütten wiederum auch enorme Mengen an IFN-γ aus und erhalten dadurch einerseits ihren Differenzierungsweg per feed-back-Mechanismus aufrecht und wirken anderseits aktivierend auf Makrophagen (Murphy et al., 2002). IFN-γ fördert in den Makrophagen die Verschmelzung von Phagosomen mit Lysosomen, sowie die Produktion des bakteriziden Stickstoffmonoxids und reaktiver Sauerstoffradikale. Die Verschmelzung von Phagosom mit Lysosom verbessert die Peptidpräsentation der aufgenommenen Antigene.

Peptidpräsentation wird durch zwei Molekülkomplexe, Haupthistokompatibilitätskomplexe I und II (major histocompatibility complex, MHCI und MHCII) genannt, vollführt. Nur antigenpräsentierende Zellen exprimieren MHC-II, welcher wiederum auch nur von den CD4+-T-Zellen erkannt werden. Die TH1-Zellen sind somit unabdingbar für die Bekämpfung von einigen intrazellulären Bakterien und Virusinfektionen. Durch ihre IFN-γ und IL-12- Produktion besitzen selbst-reaktive TH1-Zellen jedoch auch die Fähigkeit, Organ-spezifische Autoimmunerkrankungen, wie z. B. systemischen Lupus Erythematodes, Multiple Sklerose, Diabetes mellitus Typ I und Krankheiten aus dem rheumatischen Formenkreis zu initiieren (Izui 1997; Schulze-Koorps et al., 2001; Suarez-Pinzon und Rabinovitch., 2001; Kang et al., 2006).

TH2-Zellen differenzieren sich aus den CD4+-T-Zellen durch verstärkte IL-2 und IL-4- Produktion in ihrem Umfeld (Le Gros et al., 2008). Sie sind der Schlüssel für die Aktivierung der humoralen Abwehr. Als humorale Immunantwort wird die Antikörperproduktion der B- Zellen bezeichnet. Bis vor einigen Jahren war es den TH2-Zellen vorbehalten, dass nur sie die B-Zellen zur Hochregulation der kostimulatorischen Moleküle CD40 und MHCII, sowie zur Proliferation und Differenzierung in Plasmazellen anregen. Plasmazellen produzieren als humorale Immunantwort die neutralisierenden Antikörper gegen den jeweiligen Angreifer (Abbas et al., 1990). Um diese Fähigkeit zu erlangen, müssen die B-Zellen einen Klassenwechsel ihrer Antikörpermoleküle (isotype switch) von IgM zu IgA, IgG oder IgE vollziehen. Die mit TH2-Zell-Hilfe produzierten löslichen Antikörper sind somit für die

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1. Einführung 3

jeweilige Bekämpfung von extrazellulären Pathogenen, insbesondere gegen Würmer, notwendig. Des Weiteren aktivieren die TH2-Zellen durch die Ausschüttung von IL-5, IL-10 und IL-13 Mastzellen, eosinophile und basophile Granulozyten (Romagnani, 1991). Bei Dysregulation in Richtung TH2-Zellen kommt es zu Störungen wie Allergien und Asthma (Hashimoto et al., 1992).

Es wurde in den letzten Jahren jedoch präzisiert, dass es sich hauptsächlich um follikuläre T-Helfer-Zellen (TFH-Zellen) handelt, die B-Zellen Hilfe zur Antikörperproduktion geben. TH1- und TH2-Zellen leiten die B-Zell-Antworten nur in eine bestimmte Richtung, da beispielsweise die TH2-Zellen durch IL-4 Stimulation B-Zellen alleinig zum isotype switch zu IgE, gegen Parasiten, anregen. TFH-Zellen charakterisieren sich durch die Expression des Chemokinrezeptors CXCR5, dem kostimulatorischen Molekül ICOS und CD40L. Sie differenzieren sich aus naiven T-Zellen durch IL-21-Stimulation aus dem Umfeld. Mit Hilfe von CXCR5 können sie in das Keimzentrum der Lymphknoten eintreten und dort durch ihre Produktion von Zytokinen, wie IL-4, IL-10, IL-21 und IFN-γ, die B-Zellen zur jeweils benötigten Antikörperproduktion anregen (King et al., 2008).

In den letzten Jahren wurde eine weitere T-Helfer-Zell-Subpopulation entdeckt (Harrington et al., 2005; Park et al., 2005). Sie wird auf Grund ihrer Fähigkeit zur hohen IL- 17-Produktion als TH17-Zellen bezeichnet. TH17-Zellen werden durch die massive IL-17- Ausschüttung besonders zur Abwehr und Bekämpfung von einigen extrazellulär vorkommenden Bakterien, wie Propionibacterium acnes, Klebsiella pneumoniae, Bacteroides, Boerrelia spp., und pilzähnlichen Erregern wie Pneumocystis carinii und Candida albicans benötigt (Infante-Duarte et al., 2000; Ye et al., 2001; Huang et al., 2004;

Khader et al., 2007; Rudner et al., 2007). Durch ihre starke IL-17 Produktion sind TH17- Zellen maßgeblich an der Verursachung der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), ein Mausmodell für die Multiple Sklerose, beteiligt (Aranami et al., 2008). Die Differenzierung der TH17-Zellen aus den CD4+-T-Zellen erfordert den Transformierenden Wachstumsfaktor (Transforming Growth Factor, TGF) und gleichzeitige Stimulation mit IL-6 oder IL-21.

Je nachdem, durch welche Zytokine die Triggerung des TH-Zellen-Differenzierung bestimmt wird, werden die anderen Differenzierungswege blockiert und der jeweils eigeschlagene Weg unterstützt und gefördert (Szabo et al., 2003; Kaplan et al., 1996).

Der Differenzierungsweg der TH17-Zellen ist reziprok zu dem Entwicklungsgang einer regulatorischen T-Zellen (TREG)-Subpopulation. Diese TREG-Untergruppe differenziert sich aus CD4+-T-Zellen unter Stimulation von TGF in Verbindung mit IL-2 (Burchill et al., 2x

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1. Einführung 4

2007), IL-7 und IL-15 (Vang et al., 2008). TGF induziert hierbei die Expression des Transkriptionsfaktors Forkhead-Box-Protein P3 (Foxp3), ein für diese TREG-Subpopulation unabdingbares Zellkern-Protein, welche wiederum von IL-6 und IL-21 gehemmt wird. TREG

werden auf Grund ihrer Funktion deshalb regulatorische T-Zellen genannt, da sie in der Peripherie Toleranz regulieren. Dies vollführen sie, indem sie die gegen Selbst-Antigen- gerichteten T-Zellen unterdrücken und/oder zerstören (Takahashi et al., 1998), die Antigenpräsentation und Kostimulation der Antigen-präsentierende Zellen vermindern (Cederbom et al., 2000), sowie die Antikörper-Produktion durch B-Zellen unterdrücken (Ludwig-Portugall et al., 2008). TREG lassen sich an Hand ihres Phänotyps, der Zytokinproduktion und Funktion weiter unterteilen in CD4+CD25+FoxP3+ TREG, TR1-Zellen, Typ3-T-Helferzellen (TH3-Lymphozyten) und neutrale Killer-T-Zellen (NK-T-Zellen).

CD4+CD25+FoxP3+ TREG entstehen im Thymus. Auf welchen verschiedenen Wegen die TREGs ihre regulatorische Funktionen gegenüber FoxP3--Zellen ausüben, ist bis heute Teil reger Diskussion. Mehrere Theorien zeigen sich aus in vitro-Versuchen als erwiesen, wobei deren Bestätigung in vivo teilweise noch ausstehen. Einige Theorien seien hier erwähnt.

Gemäß Thornton und Stevach (1998) und Oberle (2007) induzieren die TREG Apoptose, indem sie durch ihre starke IL-2 Auszährung die Produktion der mRNA von IL-2 und weiteren Effektor-Zytokinen in den Ziel-Zellen verhindern. Dies führt zum Proliferations-Stillstand der Zellen und weiter zur Apoptose durch den proapoptotischen Faktor Bim (Pandiyan et al., 2007).

Eine weitere Theorie über die Wirkungsweise der TREG beschäftigt sich mit der Sekretion von Suppressor-Zytokinen. Diesbezüglich entdeckten Collison et al. (2007) das neues Zytokin, IL- 35, das in Zellen einen Zell-Zyklus-Stillstand indizieren kann.

Ein weiteres Molekül, das bei den Zell-Zell-Interaktionen eine Rolle zu spielen vermag, ist das Galektin-1, zugehörig zu der β-Galaktosidase-bindende-Protein-Familie. Von TREG

sekretiertes Galaktin-1 bindet an verschiedene Glykoproteine wie CD45, CD43, CD7, und führt mitunter zum Zell-Zyklus-Stillstand sowie zur Apoptose. Des Weiteren inhibiert es die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen (Garín et al., 2007). Der letzte hier beschriebene Vorgang der TREG beschreibt die Zellzytolyse. Grossman et al. (2004) beschreibt, dass die Zytolyse durch den Perforin/Granzym-Weg, unabhängig des Fas-FasL- Weges, erfolgt. Dem gegenüber demonstriert Gondek et al. (2005) eine durch Granzym B herbeigeführte Apoptose, die unabhängig von Perforin initiiert wird.

Einheitlicher beschrieben sind die Funktionswege der TREG bezüglich der APC. Es seien im Folgenden einige beschrieben. TREG binden mit ihrem Oberflächenprotein LFA-1 an das

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1. Einführung 5

ICAM-1 auf den APC und anschließend mit ihrem CTLA-4 an die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 seitens der APC. Durch die daraus resultierenden Signale kommt es zu einer Herunterregulation von CD80/86 und folgend zur verminderten Kostimulationsfähigkeit seitens der APC auf naive CD4+-T-Zellen. Dieser Prozess erfolgt auch in Anwesenheit von stark DC aktivierenden Stimuli, wie LPS, Zymosan und IFN-γ (Onishi et al., 2008). Ein weiteres Oberflächenprotein der TREG, LAG-3 (CD223), bindet mit höherer Affinität als CD4 an MHCII-Moleküle. Bei unreifen DC übermittelt diese Bindung Signale, die zur Unterdrückung der DC-Reifung und verminderter Stimulations-Fähigkeit führen (Liang et al., 2008). Des Weiteren exprimieren TREG das Protein CD39, welches ATP und AMP hydrolysiert. ATP wird z.B. durch zerstörte Zellen freigesetzt. TREG spalten das ATP mit Hilfe von CD39 und reduzieren dadurch proinflammatorische DC-Stimulation (Deaglio et al., 2007). Mutationen im FoxP3 führen im Menschen zum XPED-Syndrom (X- linked polyendocrinopathy, immunodeficiency and diarrhea syndrome) (Wildin et al., 2001), welches sich durch Diabetes Typ I und Diarrhoen bereits im Neugeborenen-Alter, sowie Autoimmunreaktionen gegen viele Organe des Körpers äußert.

TR1-Zellen kennzeichnen sich dadurch aus, dass sie enorme Mengen an IL-10 und TGF-β ausschütten. TR1-Zellen sind für die Immunregulation bedeutend, da sie die TH1- und TH2-vermittelte Immunantwort auf Pathogene, Tumore und Selbst-Antigene durch IL-10 und TGF-β supprimieren (Groux, 2003).

Typ3-T-Helferzellen sezernieren größere Mengen an TGF-β und vermitteln insbesondere nach oraler Antigen-Stimulation die IgA-Produktion. Sie haben wie die TR1- Zellen supprimierende Eigenschaften gegenüber TH1- and TH2-Zellen. (Weiner, 2001).

NK-T-Zellen exprimieren das Molekül NK1.1 und sind eine besondere TREG- Unterpopulation. Sie besitzen zwar den T-Zell-Rezeptor (TCR) und gehören deshalb der T- Zell-Familie an, binden aber statt an MHC-Moleküle auf antigenpräsentierenden Zellen an das CD1d-Molekül. CD1d-Moleküle sind MHC-Komplexen ähnlich, präsentieren im Gegensatz zu Peptiden jedoch Glykolipide. Sind NK-T-Zellen aktiviert, haben sie durch starke Ausschüttung von IL-4, IFN-β und -γ, IL-10 und GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor) große aktivierende Stimulationskraft gegenüber dendritische Zellen, T-, B- und weiteren NK-T-Zellen (Biron et al., 1999).

Zytotoxische T-Zellen (cytotoxic t-cells, CTL) erkennen mit ihrem Ko-Rezeptor CD8 alle Peptide, die ihnen durch MHC-I-Moleküle präsentiert werden. MHC-I wird, im Gegensatz zu MHCII, von jeder kernhaltigen Zelle exprimiert. Dadurch erkennen CTL viral

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1. Einführung 6

infizierte Zellen und sind in der Lage, durch verschiedene Wege, wie Fas- oder Perforin- induzierten Signalwege, die Apoptose dieser Zelle einzuleiten (Andersen et al., 2006).

T-Gedächtniszellen gibt es sowohl mit dem CD4+- als auch mit dem CD8+-Phänotyp.

Sie differenzieren sich nach ihrer ersten Aktivierung durch Antigene weiter in einen inaktiven Zustand. In diesem Status können sie für Jahre überleben, bis sie demselben Antigen wieder begegnen und von ihm reaktiviert werden. Dabei schütten sie in kurzer Zeit enorme Mengen an Zytokinen aus und steigern die Vermehrung von antigenspezifischen T-Zellen um das 10- bis 100-fache.

1.2 Die Entwicklung und Reifung der T-Zellen im Thymus

In der hier vorliegenden Arbeit wurde der Thymus untersucht und analysiert. In ihm spielt sich die vollständige T-Zell-Reifung unter Einwirkungen verschiedenster Einflüsse auf molekularer und zellulärer Ebene ab. Der Thymus ist ein primäres lymphatisches, zwei- gelapptes Organ und befindet sich im Mediastinum unter dem Brustbein, kaudal der Schilddrüse und kranial des Perikards. Der Thymus hat bei neugeborenen Menschen das ungefähre Volumen von 2 x 5 ml pro Lappen und wiegt insgesamt 10 – 15 g. Er wächst bis zum Kleinkindalter und hält bis zur Pubertät sein Volumen von 30 – 40 g. Nach der Pubertät beginnt der Prozess der Involution (Verfettung). Im Alter von 20 Jahren ist die Hälfte des Thymusgewebes mit Fett durchwachsen, im Verlauf der Jahre schreitet dieser Vorgang weiter voran. Jeder Thymus-Lappen wird durch Bindegewebsstränge in einzelne Läppchen aufgeteilt. In jedem Läppchen trennt der kortiko-medulläre Übergang (cortico medullary junction, CMJ) das Thymusmark (Medulla) von der Thymusrinde (Kortex) ab.

Normalerweise befindet sich die Medulla in der Mitte der einzelnen Thymusläppchen und ist vom Kortex umgeben.

Es ist momentan noch Teil reger Diskussionen, welche verschiedenen molekularen Mechanismen die T-Vorläuferzellen auf dem Weg vom Knochenmark in den Thymus benötigen, welcher Stammzelle sie wirklich entstammen und welcher Phänotyp sie kennzeichnet. Einer Theorie folgend, befinden sich im Knochenmark selbst-erneuerbare hämatopoietische Stammzellen (hematopoietic stem cells, HSC), die die Oberflächenmoleküle CD117 (cKit) und Sca-1 exprimieren und negativ für ausdifferenzierte Zelllinien-Marker, wie Gr1, CD19, CD11c, Ter119, NK1.1, CD8, TCRβ, sind (lineage-negative Sca-1 Kithi, LSK) (Sprangrude et al., 1988; Ikuta et al., 1992). Diese LSK-Zellen differenzieren sich unter

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1. Einführung 7

anderem in nicht selbst-erneuerbare multipotente Progenitoren (multipotential progenitor, MPP), die zu einem Anteil CD135hi (Flt3hi) sind (Adolfsson et al., 2001). Diese Subpopulation initiiert die Transkription von RAG-1- und RAG-2-(recombination activating gene)-Genen und wird deshalb als frühe lymphopoietische Progenitoren bezeichnet (early lymphoid progenitor, ELP) (Igarashi et al., 2002). Aus den ELP entwickeln sich unter anderem lymphoid-restricted common lymphoid progenitor (CLP), aus denen sich weiter CLP-2 bilden, die T- und B-Zelllinien-Potenzial besitzen (Gounari et al., 2002; Martin et al., 2003).

Der überwiegende Teil dieser verschiedenen Vorläuferzellen tritt vom Knochenmark ins Blut über und ein bestimmter Teil davon hat die Fähigkeit, in den Thymus einzutreten.

Diese T-Vorläufer-Zellen besitzen nach Suniara et al., (1999) den Phänotyp CD45+CD34+ CD44+CD25-CD117+ und benötigen, um aus der Blutbahn in den Thymus eintreten zu können, unter anderem die Bindung ihres Liganden P-Selektin-Glykoproteinligand-1 (PSGL- 1) an das P-Selectin (ein Carbohydrat-Bindungsprotein), welches auf dem thymischen Endothel ansässig ist, damit sie durch die kleinen venösen Kapillaren in das Thymusgewebe in die CMJ gelangen können (Rossi et al., 2005). Des Weiteren benötigen sie den Oberflächen-Rezeptor CD44 zur Zielsuche und zur Zell-Adhäsion (Wu et al., 1993). Nach dem Eintreten in die CMJ werden die Thymozyten-Progenitoren als doppelt negative Thymozyten (DN-Thymozyten) bezeichnet. Die Bezeichnung „doppelt negativ“ bezieht sich auf die fehlende Expression der Oberflächenmarker (Ko-Rezeptoren) CD4 und CD8. Die Ko- Rezeptoren weisen die Zugehörigkeit der reifen T-Zellen entweder der T-Helfer- (CD4) oder der zytotoxischen T-Zellreihe (CD8) zu (s. Abs. 1.1). Diese Oberflächenrezeptoren werden erst zum Ende der Entwicklungsreihe der T-Zellen hin exprimiert. Der Reife- und Entwicklungsstatus der DN-Thymozyten wird bis dahin mittels Expression der Oberflächenmoleküle CD25 (Interleukin-2-Rezeptor α-Kette, IL-2R α-Kette) und CD44 (Phagozyten Glykoprotein-1, pgp-1) definiert (Godfey et al., 1993; Ceredig, 2002). Diese werden je nach Entwicklungsstadium von den DN-Zellen herauf- oder herunterreguliert. Die Progenitoren durchlaufen auf ihrem Differenzierungsweg im Thymus mehrere Stadien, bis sie sich letztendlich zu einfach-positive (single positive, SP) CD4+- oder CD8+-T-Zellen, entwickeln. Während ihres Differenzierungsvorgangs wandern die sich entwickelnden Thymozyten durch unterschiedliche Thymus-Mikrokompartiment, wo sie von den dort ansässigen Stromazellen, insbesondere von den den Thymus auskleidenden Epithelzellen, Differenzierungssignale erhalten.

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1. Einführung 8

Die anfangs durch den Blutstrom in die CMJ des Thymus eintretenden T-Zell- Progenitoren sind, wie bereits erwähnt, CD25-CD44+CD117+CD4-CD8- und werden abkürzend DN1 genannt. In diesem Stadium besitzen diese Progenitorzellen noch die Fähigkeit, sich in weitere Zelllinien, wie B-Zellen, NK- oder DC, entwickeln zu können (Lian et al., 1997). Die erste Veränderung ihrer Oberflächenmoleküle, die Induktion des CD25, unterlaufen die DN1 nach dem Eintreten in die CMJ. Für diese Vorgänge werden spezielle Signaltransduktionswege diskutiert, die die Proliferation und die jeweiligen Stadienänderungen induzieren und vorantreiben. Für die Differenzierung von DN1 zu DN2 ist laut Godfrey et al. (1992) die Signalkaskade durch die Transmembran-Rezeptor-Tyrosin- Kinase (c-Kit) und ihres Liganden Stamm-Zell-Faktor (stem cell factor, SCF) unabdingbar.

Radtke et al. (1999), Schmitt et al. (2002 und 2004) und Tan et al. (2006) beschrieben zusätzlich die Signalkaskade via des Transmembran-Rezeptors Notch-1 und seines Liganden Delta-like-1 als unerlässlich für die T-Zellentwicklung und Unterdrückung des B-Zell- Potentials während der ersten zwei Stadien. Zusätzlich sorgen Signale via Notch für vermehrte Expression von cKit (Massa et al., 2006). Des Weiteren stellt nach Wang et al.

(2006) Interleukin IL-7 einen ebenfalls benötigten Induktor für die Proliferation und das Überleben der Thymozyten dar. Wang et al. verdeutlichten zudem, wie wichtig die Balance zwischen Notch, IL-7 und cKit für eine erfolgreiche T-Zell-Differenzierung ist. Als ein essentieller Mediator für die Aufrechterhaltung der gerade in die CMJ eingetretenen T-Zell- Progenitoren und auch für das folgende Stadium wird nach El Andaloussi et al. (2006) der Wachstumsfaktor Hedgehog angesehen, der durch den Lymphozyten-Rezeptor Smoothened die erforderlichen Differenzierungssignale auslöst.

Nach dem ersten Differenzierungsvorgang werden die Thymozyten als DN2 bezeichnet, weil ihr Phänotyp CD25+CD44+CD117+CD4-CD8- lautet. Während dieses Differenzierungsvorgangs von DN1 zu DN2 (kurz: DN1-2) exprimieren die Progenitoren stark die Chemokinrezeptoren CCR7 und CXCR4. Diese helfen ihnen, die CMJ zu verlassen.

Angelockt werden die DN1-2 durch Chemokine, Liganden für die jeweiligen Rezeptoren.

Chemokine stellen eine der Hauptgruppen der Zytokine dar (s. Abs. 1.1). Sie sind kleine, basische und als Mediatoren agierende Polypeptide, die durch Bindung an Chemokinrezeptoren auf den T-Zell-Progenitoren eine G-Protein-gekoppelte Signalkaskade anstoßen und dadurch Zellmigration stimulieren können (Kelvin et al., 1993). Bei den an CCR7 bindenden Chemokinen handelt es sich um CCL19 und CCL21. An CXCR4 bindet das Chemokin CXCL12 (stromal cell-derived factor, SDF). Die Chemokine werden von den kortikalen Epithelzellen sezerniert und exprimiert. Dadurch wird die Richtung der DN1-2 und

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1. Einführung 9

DN2 in den Kortex polarisiert (Pelletier et al., 2000). Die DN1 verweilen im Mittel um die 10 Tage an ihrem Eintrittsort und expandieren dort ihre Zellanzahl um das 1000-fache, bevor sie sich durch die oben erwähnten Vorgänge in den äußeren Kortex begeben (Shortman et al., 1990; Porritt et al., 2003).

Die Wanderung der DN2-Zellen korreliert mit ihrer weiteren Differenzierung. Hierbei spielen polarisierend Richtung-weisend die Chemokine CXCL12 und CCL25, auf Seiten der Epithelzellen, mit den Rezeptoren CXCR4 und CCR9 seitens der DN2 eine große Rolle.

Direkte Zellmigration benötigt jedoch nicht nur Polarisierungssignale, wie die Chemokine, um sich in eine bestimmte Richtung bewegen zu können, sondern auch Moleküle, die Adhäsion der Thymozyten an die den Thymus auskleidenden Stroma- und Epithelzellen gewähren. Hierbei sei das Molekül VCAM-1+ auf den Epithelzellen erwähnt, an welches die DN2 mit Hilfe des VLA-4 Integrins (α4β1) auf ihrer Oberfläche binden und somit des Weges geleitet werden (St-Pierre et al., 1996).

Ungefähr in der Kortexmitte erreichen die sich entwickelnden DN2-Thymozyten das Stadium DN3. Auch hier sind einige Moleküle und Signale bekannt, die die Zellveränderungen bedingen. CCL25 auf den TEC dirigiert die DN3 Richtung Kortex (Uehara et al., 2006). VCAM-1 ermöglicht weiterhin, zusammen mit den Molekülen Fibronektin und Laminin, die Adhäsion der Thymozyten-Progenitoren an die Stromazellen (Prockop et al., 2002). Für die Proliferation und Differenzierung der DN3-Zellen sind auch hier weiterhin Signale durch Notch-Liganden notwendig (Balciunaite et al., 2005; Ciofani et al., 2005).

Die DN3 kennzeichnen sich jetzt durch den Phänotyp CD44-CD25+CD4-CD8-. Sie beginnen außerdem, das prä-TCR-Molekül zu exprimieren, indem sie mit der Umordnung der ersten Kette des TCR, die β-(γ-δ-)-Kette, starten. Der TCR ist ein aus einer α- und β-Kette (oder γ- und δ-Kette) bestehendes Transmembranprotein, das auf seiner extrazellulären Seite (N-terminal), wie die Immunglobuline, eine variable Region aufweist. Die dafür benötigten Proteine entstehen ähnlich wie die Immunglobuline (Ig) der B-Zellen durch zufällig genetische Rekombination aus einer großen Anzahl von V-, D- und J-Genen (variable, diversity, joining) was zu einer sehr hohen Vielfalt der entstandenen Rezeptorphänotypen führt. Mit dieser Rezeptordiversität lässt sich die große Anzahl von spezifischen Peptidantigenen erkennen, die dem TCR reifer T-Zellen später von antigenpräsentierenden Zellen, z. B. von DC, in Verbindung mit einem MHC-Komplex angeboten werden. Für diesen ersten Prozess der β-Kette-Genumlagerung werden die RAG-1-(recombinase-activating gene- 1) und RAG-2-Proteine exprimiert, welche die VDJ-Neuanordnung an dem Tcrb- (T-cell

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1. Einführung 10

receptor β-chain), Tcrg-, und/oder Tcrd-Lokus initiieren. Als bekannter und bedeutender Induktor für die Tcrb-Lokus wird IL-7 angesehen (Muegge et al., 1993; Crompton et al., 1997). Weitere unabdingbare Induktionsprozesse und Differenzierungssignale werden auch hier via Notch-Liganden vermittelt (Ciofani et al., 2004). Die T-Zellen, die eine komplett funktionierende Tcrb-Umordnung vollzogen haben, können die Proteine der β-Kette des TCR exprimieren, die danach auf der Zelloberfläche als precursor-TCR-(prä-TCR)Komplex erscheinen. Der Prozess zeigt endgültig das Stadium DN3 an (Livák et al., 1999). Dieser Schritt führt auch zum unwiderruflichen Einschlagen der DN3-Zellen in die T-Zell-Linie (Moore et al., 1995; Bhandoola et al., 2006). Nach Erreichen der subkapsulären Zone exprimieren die DN3-Thymozyten weiterhin CXCR4 und CCR9 (Misslitz et al., 2006).

Der Übergang in das DN4 Stadium (auch prä-DP genannt) findet in der subkapsulären Region statt. Als Adhäsionsprotein wird hier nicht mehr VCAM-1, sondern Laminin-5 angesehen, das über den Liganden α6β4 auf Seiten der prä-DP nicht nur Adhäsion vermittelt, sondern durch den MAP-(mitogen-activated protein)Kinase-Weg auch Proliferation und Überleben induzieren kann (Giancotti et al., 1996). Stadium DN4 ist weiterhin durch den Verlust von CD25 gekennzeichnet, sowie durch das Heraufregulieren des prä-TCR/CD3- Komplexes. Der prä-TCR besteht aus der schon fertig umgeordnete ß-Kette, die nach ihrem Erscheinen die Signale gibt, den Umlagerungsprozess für die ß-Kette einzustellen, die Moleküle CD4 und CD8 hochzuregulieren und die Umlagerung der Gene für die α-Kette zu beginnen (Irving et al., 1998; Yamasaki et al., 2006). Diese Vorgänge führen zu einer doppelt positiven T-Zelle (DP, doppelt positiv für CD4 und CD8) (Borgulya et al., 1992).

Mit dem vollständigen TCR-Komplex ist die T-Zelle anschließend fähig, Selbst- Antigene, die an MHC-Komplexe gebunden sind, auf den kortikalen Epithelzellen zu erkennen und dadurch positive Selektion zu durchlaufen. Unter positiver Selektion versteht man den ersten Prozess, durch den herausgefunden wird, ob die sich entwickelnde T-Zelle mit ihrem TCR fähig ist, körpereigene Peptide im Kontext zu MHC-Molekülen zu erkennen und diese mit nur geringer Kraft zu binden. Wenn sie diesen Vorgang vollführt hat, ist der erste Schritt in Richtung erworbener Immunität getan. (Selbst)-Antigene werden durch zwei verschiedene Typen von MHC-Molekülen präsentiert.

MHCI ist ein integrales Membranprotein, das Peptidfragmente aus dem Proteasom präsentiert, welche durch Proteolyse intrazellulär synthetisierter Proteine entstehen. Da viele Viren ihre Erbinformationen im Zytosol replizieren lassen, werden somit auch jene Peptide von den MHCI-Molekülen präsentiert. Diese werden von CTL und ihrem Ko-Rezeptor CD8 erkannt. MHCI-Moleküle sind auf allen kernhaltigen Körperzellen zu finden.

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1. Einführung 11

MHCII wird nur von B-Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen und Langerhanszellen exprimiert. Diese zählen zu den antigenpräsentierenden Zellen, die Antigene durch spezielle Rezeptoren endozytisch aufnehmen, im Lysosom in Peptidgröße spalten und mit Hilfe von MHCII-Molekülen auf ihrer Oberfläche präsentieren. Der MHCII- Komplex mit dem gebundenen Antigenfragment wird von T-Helferzellen und ihrem Ko- Rezeptor CD4 erkannt.

Durch den Vorgang der positiven Selektion wird sichergestellt, dass nur die T-Zellen sich weiterentwickeln, die körpereigene Peptide, an MHC-Molekülen gebunden, erkennen können und mit dem Komplex keine zu starke Bindung eingehen. Dieser Vorgang ist später bei der Erkennung von durch MHC-Moleküle präsentierten, körperfremden Antigenpeptiden während einer Immunabwehr unerlässlich (Ignatowicz et al., 1996).

Während der zufälligen α-Ketten-Umlagerung (nach Erscheinen des prä-TCR/CD3- Komplexes) werden so lange so viele verschiedene Rezeptorsegmente synthetisiert, bis die T- Zelle mit ihrem dann passenden TCR/CD3-Komplex einen MHC/Peptid-Komplex erkennt und binden kann (Petrie et al., 1993). Zwei klassischen Theorien nach entscheidet entweder die Stärke der Bindung zu MHC-I- oder MHC-II-Molekülen und die damit verbundenen Signalkaskaden die Weiterdifferenzierung der zu dem Zeitpunkt noch DP-T-Zelle in die CD4+- bzw. CD8+-SP-T-Zellen. Die jeweils andere Genexpression wird dadurch unterdrückt (Robey et al., 1991; Yasutomo et al., 2000); oder es spielt der Zufall für die folgende Entwicklungsrichtung der DP-Zelle mit, der die weiteren Schritte der TCR- und Ko-Rezeptor- Ausprägung bestimmt (Chan et al., 1993; Davis et al, 1993). Neuere Studien zeigen jedoch, dass selbst an MHCII-Molekülen selektionierte CD4+CD8low-T-Zellen noch die Fähigkeit besitzen, sich durch, insbesondere IL-7-Signale, vollständig in CD8+-T-Zellen zu entwickeln.

Dies wird von den Autoren mit „coreceptor reversal“ betitelt (Yu et al., 2003 und 2006;

Brugnera et al. 2000).

Auf die Zelllinien-Differenzierung folgt die klonale Expansion. Wurde der MHC/Peptid- Komplex nicht erkannt, stirbt die DN-Zelle durch Vernachlässigung (neglect), da sie keine zellerhaltenden Signale bekommt (Petrie et al., 1993). Nach Kontakt mit den MHC- Komplexen auf den kortikalen Epithelzellen, durch die positiv selektioniert wurde, wird die Migrationspolarität der entwickelnden Thymozyten geändert und der Weg wieder in Richtung Thymusmitte, der Medulla, eingeschlagen. Dazu wird CXCR4 herunterreguliert, die erneute Induktion von CCR7 und das erstmalige Hochregulieren von CCR4, sowie das stärkere Exprimieren von CCR9 angeregt. Die Chemokine, Liganden dieser Rezeptoren, werden in

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1. Einführung 12

Kortex und Medulla sezerniert. CCL17 und CCL22, Liganden des CCR4, sind hierbei eine Ausnahme. Sie kommen ausschließlich in der Medulla vor (Misslitz et al., 2006).

Mit Hilfe der Chemokin-Polaritäten erfolgreich in der Medulla angelangt, werden den SP-Zellen von den dort ansässigen dendritischen Zellen, Makrophagen und den medullären Epithelzellen unterschiedlichste Antigene, erneut an MHC-Komplexe gebunden, präsentiert.

Hiermit wird getestet, ob die SP-Zellen mit ihrem TCR fähig sind, körperfremdes von körpereigenem Antigen zu unterscheiden und nur mit körperfremdem Antigen an MHC- Komplexen eine feste Bindung einzugehen, die später zur Erregerelimination benötigt wird.

Bei zu starker Bindung zwischen dem TCR und den körpereigenen präsentierten Antigenen wird in den T-Zellen Apoptose eingeleitet, da sich aus ihnen sonst autoaggressive T-Zellen entwickeln, die später in der Peripherie zu Autoimmunerkrankungen führen können. Dieser zweite Vorgang wird negative Selektion genannt und zusammen mit der vorangegangenen positiven Selektion unter dem Begriff zentrale Toleranzentwicklung zusammengefasst.

Nach erfolgreichem Erlangen der zentralen Toleranz verlassen die reifen CD4+- und CD8+-T-Zellen den Thymus durch Bindung ihres Spingosin-1-Phosphat-Moleküls an den SP- 1-Rezeptor, der in den Kapillarwänden der CMJ ansässig ist, in die Blutbahn. Auf diesem Weg gelangen sie in die sekundären lymphatischen Organe, wie z. B. Lymphknoten, wo sie sowohl Immunität als auch die periphere Toleranz in Form von Immunreaktionen entwickeln können.

1.3 Thymusepithelzellen - Untergruppen, Funktionen und Besonderheiten

Wie in Abs. 1.2 beschrieben, durchlaufen die T-Zell-Progenitoren bis zur reifen T- Zelle mehrere Entwicklungsstadien, die durch Veränderungen ihrer Oberflächenmoleküle gekennzeichnet sind. Einige Signale, sowie Interaktionen und damit verbundenen Transmitter, die für diese Vorgänge notwendig sind, wie Signalkaskaden via Notch/Delta-like-1, IL-7, cKit/SCF, wurden in Abs. 1.2 angesprochen.

Somit ist bekannt, dass ständige Zell-Zell-Kontakte zwischen den ansässigen Thymusepithelzellen und den T-Zell-Progenitoren unabdingbar sind, um eine vollständige und funktionierende Entwicklung der T-Zellreihen, und damit einen wichtigen Teil der adaptiven Immunität, zu ermöglichen. Dass die Zell-Zell-Kontakte und damit entstehenden Signale auch für die Entwicklung der thymischen Epithelzellen unabdingbar sind, wurde durch mehrere Studien qualifiziert, bei denen in verschiedenen Mausstämmen die

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1. Einführung 13

Thymozyten-Entwicklung zu unterschiedlichen Stadien-Zeitpunkten blockiert und die Auswirkungen auf die Epithelzellen bewertet wurde. Es zeigten sich durch diesen Entwicklungsstillstand auf Seiten der T-Zellen deutliche Differenzierungsunvollständigkeiten bei den thymischen Epithelzellen (s. Ende Abs. 1.3). Dieses Abhängigkeitsphänomen zwischen den beiden Zelllinien bezüglich ihre Entwicklung wird als „thymic crosstalk“ bezeichnet (van Ewijk et al., 2000; Anderson et al., 2001) und kennzeichnet klar die Relevanz der jeweiligen Zellreihen für- und zueinander.

Da die im Thymus ansässigen Epithelzellen wie eben erläutert, maßgeblich an der Entwicklung der T-Zellen und der somit adaptierten Immunität beteiligt sind, wird in diesem Abschnitt genauer auf diese Zellen eingegangen.

Sie gehören zu der Familie der Epithelzellen und haben neben ihrer Funktion der Innenschichtauskleidung des gesamten Thymus als einzige Epithelzelllinie des gesamten Körpers die Fähigkeit, durch ihre verzweigte Form ein dreidimensionales Maschennetzwerk auszubilden. Dieses Netzwerk sichert den sich entwickelnden T-Zellen durch ständige Zell- Zell-Kontakte ihren Weg von der CMJ in den Kortex und zurück in die Medulla. Die Epithelzellen des Thymus werden zunächst in zwei anatomische Hauptgruppen unterteilt - in die Epithelzellen, die in der Medulla ansässig sind (medullary thymic epithelial cells, mTEC ) und die des Kortex (cortical thymic epithelial cells, cTEC), wobei ihnen jeweils unterschiedliche Funktionen zugesprochen werden. Die cTEC sind am Vorgang der positiven, die mTEC maßgeblich an dem der negativen Selektion beteiligt (s. Abs. 1.2). Zusammen sichern sie somit einen Großteil der zentralen Toleranz. Die Unterteilung der Thymusepithelzellen in kortikal und medullär erfolgt jedoch nicht allein an Hand ihre Lokalisation im Thymus. Sie werden ferner auf Grund ihrer Expressionsmuster von Keratinmolekülen differenziert. Keratine sind Proteine, die als Intermediärfilamente, zusammen mit den Mikrotubuli und den Mikrofilamenten das Zytoskelett der eukaryotischen epithelialen Zellen bilden. Sie werden nach Größe und pH-Verhalten in zwei Gruppen (Typ I und Typ II) eingeteilt. Die Typ I-Keratine (K9-K19) sind zwischen 40-56.5 kD (kilo Dalton) groß und im sauren Milieu angesiedelt (pKS = 4.5-5.5). Die Typ II-Keratine (K1-K8) sind größer (52-67 kD) und verhalten sich basischer (pKS= 5.5-7.5) (Fuchs et al., 1983; Moll et al., 1982a). Um eine genaue Unterscheidung der Keratine zu ermöglichen, wurden mehrere monoklonale Antikörper entwickelt, die jeweils nur bestimmte, einzelne Keratine anfärben (Woodcock-Mitchell et. al., 1995; Eichner et. al., 1984). Die Keratine konnten des Weiteren durch Immunoblot-Analysen auch ihrer unterschiedlichen Größe und Lokalisation nach aufgeteilt werden (Eichner, et al., 1984). Für einem sinnvollen und gut funktionierendem

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1. Einführung 14

Aufbau epithelialer Strukturen ist immer eine Paarung von einem basischen und einem sauren Keratin notwendig.

Durch die sich verändernden Expressionsmuster der Keratine während der Zelldifferenzierung, z. B. dem Wechsel von kleineren zu größere Keratinen mit zunehmendem Alter der Zelle, können die Keratine auch als Marker für Entwicklungs- und Proliferationsstadien der Epithelzellen, sowie deren verschiedenen Zelltypen, angesehen werden (Franke et al., 1981; Eichner et al., 1984). Diese Erkenntnis haben sich Klug et al. zu Nutzen gemacht. Durch verschiedene Charakterisierungsversuche stellte die Forschergruppe fest, dass auf Grund von unterschiedlichen Keratinexpressionen mehrere (Unter)-Gruppen und Entwicklungsstadien der Thymusepithelzellen differenziert werden können (Klug et al., 1998 und 2002). Bei den im Thymus eine Rolle spielenden Keratinen handelt es sich hierbei um die Keratine 5,8,14 und 18. In einem vollständig entwickelten Thymus kann in fast allen kortikalen Epithelzellen hauptsächlich das Keratin 8 (K8) zusammen mit seinem Partner Keratin 18 (K18) gefunden werden. Diese K8+K18+-doppelt positiven cTEC stellen den dominierenden cTEC-Phänotyp dar und sind im ganzen Kortex verteilt zu finden. Sie haben eine längliche, sternförmige, verzweigte Form, sind netzgitterartig aufgebaut und durchgängig miteinander verbunden. Mit dieser dreidimensionalen Netzwerk-Struktur sichern sie den sich entwickelnden Thymozyten einen kontinuierlichen Weg während ihrer Differenzierung zu reifen T-Zellen durch den Thymus (s. Abs. 1.2). Dem gegenüber ist die vorherrschende medulläre Epithelzellpopulation (mTEC) durch die Expression der Keratine 5 (K5) und 14 (K14) gekennzeichnet (K5+K14+). Ihre Zellstruktur gleicht der der cTEC (Klug et al., 2002).

Des Weiteren sind zusätzlich in beiden Hauptpopulationen der Thymusepithelzellen (Kortex und Medulla) jeweils Untergruppen gefunden worden, die einen abweichenden Phänotyp aufweisen. Die mengenmäßig unterlegene cTEC-Subpopulation ist K8+K18+K5+ und findet sich nicht wie die K8+K18+-Hauptpopulation im ganzen Kortex verteilt, sondern mehr an der CMJ wieder. Vereinzelte Zellen sind ferner im ganzen Kortex anzutreffen. Bei der medullären Untergruppe handelt es sich um K5-K14-K8+K18+ Zellen. Sie haben zwar das gleiche Keratinexpressionsmuster wie die dominierenden cTEC, lassen sich aber gut von ihnen unterschieden, da nur sie zusätzlich das Lektin Ulex europaeus agglutinin-1 (UEA-1) binden.

Lektine sind komplexe (Glyko-) Proteine, die nur spezifische Kohlenhydratstrukturen binden.

Die medulläre Subpopulation befindet sich auch eher am äußeren Medullarand an der CMJ.

UEA-1+-Zellen werden nach Klug et al. (1998) und Hamazaki et al. (2007) als die epitheliale Vorläuferzellen angesehen, welche nach Zellkontakten mit reifen T-Zellen befähigt sind, eine organisierte Medulla auszubilden. Ein weiterer Marker, der neben den Keratinen und der

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1. Einführung 15

Bindung von UEA-1 die Identifizierung von mTEC-Untergruppen ermöglicht, ist das Epithelzell-Adhäsionsmolekül (epithelial cell adhesion molecule, Ep-CAM). Dieses wird von fast allen mTEC exprimiert und lässt sich durch den Antikörper G.8.8 anfärben. Guillemot et al. (2001) vermuteten, dass Ep-CAM Einfluss auf die Organisationskompetenz des Aktins im Zytoskelett nimmt und bei der Bildung des Stromazellnetzwerks im Thymus beteiligt ist.

Derbinski et al. (2001) und Palumbo et al. (2006) entdeckten des Weiteren, dass es sich gerade bei den mTEC, die EpCAM+Ulex+ sind, um die Zellpopulation handelt, die die einzigartige Fähigkeit besitzt, eine Fülle an Antigenen zu exprimieren, die bisher nur in den dazugehörigen eigenen peripheren Organen gefunden wurden (wie z. B. das Insulin). Diese Fähigkeit wird als „promiscuous gene expression“ bezeichnet. Mittels dieser Qualität tragen die mTEC zur Depletion von autoreaktiven T-Zellen bei und haben einen hohen Stellenwert bei der Sicherstellung der zentralen Toleranz. Die Expression der meisten peripheren spezifischen Gewebsantigenen wird hierbei durch AIRE, einen als Autoimmun-Regulator- agierenden Transkriptionsfaktor, reguliert. (Derbinski et al., 2001 und 2005; Liston et al., 2003; Gillard et al., 2007). AIRE wird vor allem im Thymus von den mTEC, sowie im Pankreas und Nebennierenmark exprimiert. Ein Defekt im AIRE-Gen führt bei Menschen und Mäusen zur autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy (APECED), die sich in mehrfachen Störungen des endokrinen Hormonsystems, chronischer mukokutaner Candidiasis und ektodermaler Dystrophie äußert (Björses et al., 1998; Vogel, et al., 2002;

Liston et al., 2003; Kuroda et al., 2005). Neuere Experimente zeigen einen weiteren Weg auf, wie AIRE Einfluss auf die Expressionen der thymusfremden, peripher organspezifischen Antigene nehmen kann. AIRE wird eine zusätzliche Einwirkung auf die Geschwindigkeit und Effizienz der mTEC-Differenzierung zugeschrieben. Da dieser Zeitraum bei den AIRE-/-- Mäusen verkürzt ist, wird die Antigenpräsentation und Prägung der T-Zellen somit auch zeitlich und qualitativ vermindert sein (Gillard et al., 2007; Kont et al., 2008).

Es liegen jedoch nicht nur solche Gendefekte, wie das eben erwähnte AIRE-Gen, schweren System-Erkrankungen zu Grunde. Auch führen Gleichgewichtsstörungen in dem zu Beginn des Abs. 1.3 angesprochenen empfindsamen Abhängigkeitsphänomen, „thymic crosstalk“, zu fehlerhaften und unproduktiven T- und Epithelzellen, die wiederum zu Immundefekten oder Dysfunktionalitäten in der Immunabwehr oder zu Autoimmunität führen. Das voneinander abhängige Differenzierungssystem im Thymus zwischen T- und Epithelzellen wurde, wie kurz zu Beginn Abs. 1.3 angesprochen, anhand von verschiedenen Mausmodellen verdeutlicht. In diesen Modellen wurde die T-Zell-Entwicklung zu jeweils verschiedenen Zeitpunkten gestoppt, um die Auswirkung der fehlenden T-Zell-Signale auf die

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1. Einführung 16

Epithelzellen feststellen zu können. Die früheste Blockierung findet in den CD3ε-Mäusen im Stadium DN1 (CD44+CD25-) statt. Hierfür wurden transgene Mäuse generiert, die DNA- Segmente enthalten, welche entweder für das komplette humane CD3ε-Gen oder nur eine verkürzte Form kodieren. Das CD3ε-Protein interagiert als ein Teil des TCR/CD3-Komplexes und koppelt nach seiner Phosphorylierung durch Tyrosin-Protein-Kinasen den TCR/CD3 Komplex an andere Effektor-Moleküle, die in verschiedenen Signalübertragungswegen zur Zelldifferenzierung beteiligt sind (Sancho et al., 1993). Die Anzahl der Gen-Kopien, sowie die unterschiedlichen Regionen der verkürzten Formen, transmembrane und zytoplasmatische, des CD3ε-Proteins wurden variiert (Wang et al., 1994). Durch die fehlenden Signale kommt es in diesen Mäusen zu einem sehr unvollständigen und sehr winzigen Thymusaufbau. Die cTEC sind zwar schon vorhanden, aber in einer zur Kapsel parallel zweidimensionalen Schicht, an Stelle des gewohnten dreidimensionalen radialen Aufbaus, angeordnet. Es lassen sich nur K8+K5+-Epithelzellen anfärben, die als die Epithelvorläuferzellen angesehen werden (Klug et al., 1998; Hamazaki et al., 2007). Des Weiteren sind großen Zysten im Kortex vorhanden. Eine genauere Inspektion dieser Zysten ergibt, dass diese nur mit „klassischen“ Epithelien wie Becherzellen und Flimmerepithelien, auf einer Basalmembran angeordnet, ausgekleidet sind (Holländer et al., 1995; van Ewijk et al., 1999). Medulläre Epithelzellen fehlen gänzlich.

Ein schon deutlich anderes Bild ist in den Mausstämmen zu sehen, bei denen die Thymozyten-Entwicklung ein Stadium später blockiert wird. Sowohl in RAG-1-/-- und RAG- 2-/--Mäusen, als auch in SCID (severe combined immunodefinciency defect) -Mäusen findet der Block in Stadium DN2 (CD25+CD44-) statt. Diese Mäuse sind durch die genetischen Defekte nicht in der Lage, Ig- und TCR-Antigen-Rezeptoren durch produktives Rearrangement der kodierenden Gene auszubilden. Das Vorhandensein des nächsten Entwicklungsstadiums seitens der T-Zellen wirkt sich auch schon merklich auf den Thymusepithelzellaufbau aus. Die cTEC sind nun dreidimensional, dicht und radiär zur Kapsel angeordnet und es lassen sich sowohl die K8+K5+- als auch K8+K5--Epithelzellen auffinden (Holländer et al., 1995; van Ewijk et al., 2000).

Aus diesen Experimenten wird deutlich, dass es sich bei dem Übergang der T-Zell- Progenitoren vom Stadium DN1 zu DN2 um einen sehr wichtigen Zeitpunkt bezüglicher der Epithelzelldifferenzierung in einen organisierten Kortex handelt. Welche Signale und Moleküle bei diesem Ereignis notwendig sind, ist bisher Teil reger Nachforschung.

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1. Einführung 17

1.4 Der Chemokinrezeptors 7 (CCR7) und seine Relevanz für die T-Zell-Entwicklung

Wie bereits anfangs des Abs. 1.2 erwähnt, sind Chemokine ein unabdingbarer Bestandteil für die Ausbildung und Unterhaltung der eigenen Immunität. Sie stellen eine der fünf Hauptgruppen der Zytokine dar. Ihre Hauptfunktion besteht in der Auslösung von Chemotaxis bei Immunzellen. Die Chemokine werden nach ihren funktionalen Kriterien in zwei Hauptgruppen, inflammatorisch und humoral, unterteilt. Die inflammatorischen Chemokine werden unter anderem von Gewebszellen bei Verletzungen, Infektionen oder Entzündungsprozessen ausgeschüttet und lenken die Zellen, zugehörig zum angeborenen und adaptierten Immunsystem, hin zu Infektionsherden. Die homöostatischen Chemokine wiederum werden kontinuierlich produziert und sind für die funktionelle Organisation der lymphatischen Organe zuständig. Des Weiteren sind sie speziell an der Entwicklung, Migration und Aktivierung der Lymphozyten beteiligt (Zlotnik und Yoshie, 2000; Allen et al., 2007). Während der bereits erläuterten T-Zellentwicklung im Thymus (s. Abs. 1.2) spielen die Chemokine CXCL12, CCL19/CCL21 und CCL25 mit ihren dazugehörigen Rezeptoren CXCR4, CCR7 und CCR9 eine wichtige Rolle.

Im Rahmen dieser Arbeit soll das Augenmerk auf den Chemokinrezeptor CCR7 gerichtet werden. CCR7 ist ein G-Protein-gekoppelter integraler Membranproteinrezeptor mit sieben Membran-durchspannenden Helices. CCR7 wird beispielsweise benötigt, um zirkulierende naive Lymphozyten in sekundär lymphatische Organe, wie z. B. die Lymphknoten, zu rekrutieren (Förster et al., 1999). Im Thymus wird er von sich entwickelnden T-Zellen (DN1-2) nach deren Eintreten in die CMJ zur Migration in den Kortex exprimiert, sowie von einem Teil der positiv selektionierten DP-Thymozyten, die auf dem Weg von der subkapsulären Zone zurück in die Medulla sind (Misslitz et al., 2004; Ueno et al., 2004). Da die Thymozyten-Progenitoren im Stadium DN1-2 beginnen, CCR7 herauf zu regulieren, um die CMJ verlassen zu können und Chemokin-gesteuert in Richtung Kortex, bzw. subkapsuläre Zone, migrieren zu können, ist bei den CCR7-/--Mäusen durch das Fehlen des Rezeptors eine deutliche Anhäufung der Zellen an der CMJ zu finden.

Von Kwan et al. (2004) und Ueno et al. (2004) wurde vorgeschlagen, dass CCR7 von den Thymozyten ebenfalls benötigt und herauf reguliert wird, um nach erfolgter positiver Selektion im Kortex dem Gefälle der von den mTEC produzierten Chemokine CCL19 und CCL21 zurück in die Medulla folgen zu können. Dieser Theorie nachkommend wäre die von

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1. Einführung 18

Ueno et al. (2004) beschriebene Akkumulation der SP-Zellen im Kortex bei CCR7-/--Mäusen durch das Fehlen von CCR7 zu erklären.

Darüber hinaus zeigten Yin et al. (2007), dass CCR7 auch eine Rolle in der Differenzierungsentscheidung der DP-Zellen in CD4+- oder CD8+-SP-Zellen spielt. Er wird von an MHCI-Komplexen positiv selektionierten CD8+-Zellen viel stärker exprimiert als von an MHCII-Komplexen positiv selektionierten CD4+-Zellen. Außerdem können die an MHCII- Komplexen selektierten CD4+-Thymozyten durch transgene Überexpression von CCR7 in Richtung der CD8+-Entwicklung umgekehrt werden. Dies lässt vermuten, dass während des Differenzierungsprozesses der DP-Zellen Transkriptionssignale ausgesendet werden, die das Ausmaß der CCR7-Expression bestimmen, welche wiederum die Richtung der CD4+- zur CD8+-T-Zell-Differenzierung verstärkt.

Es existiert ein weiteres Mausmodell, welches dem Phänotyp der CCR7-/--Maus extrem ähnelt. Plt/plt-Mäuse (plt, paucity of lymph node T cells) haben eine spontane Mutation (Deletion) in zwei von drei Genen, die für die Liganden des CCR7 (CCL19 und CCL21) kodieren. Normale Mäuse besitzen für CCL21 zwei unabhängige Gene, Scya21a und Scya21b. Scya21a kodiert für Serin an Position 65 von CCL21 (CCL21-Ser) und wird in sekundären lymphatischen Organen und Lymphgefäßen exprimiert. Das CCL21b Gen kodiert für Leucin an Position 65 (CCL21-Leu) und wird nur auf lymphatischem Endothel von peripherem Gewebe exprimiert. CCL19, von Scya19 kodiert, wird überwiegend von Stroma- Zellen in der T-Zell-Zone der Lymphknoten, Milz und Peyer-Plaques (PP) in der Darmmukosa exprimiert. Die natürliche Deletion der plt/plt-Mäusen schließt die Gene Scya19 und Scya21a ein. Dies führt dazu, dass plt/plt-Mäuse nachgewiesene Defekte in der Lymphozyten-Lokalisierung aufweisen. T-Zellen können z. B. nicht an HEV (hoch- endotheliale Venolen, high endothelial venules) in Lymphknoten, PP und weißer Pulpa der Milz adhärieren (Scya21a). Außerdem sind die T-Zell-Zonen in Lymphknoten nicht ausgebildet, da die T-Zellen sich in und um die Lymphfollikel ansammeln, welche eigentlich der Ort für B-Zellen sind (Scya19) (Nakano et al., 1998; Gunn et al., 1999; Mori et al., 2001).

Die beiden Mausmodelle, CCR7-/- und plt/plt, besitzen zusätzlich eine erhöhte Suszeptibilität, Multiorgan-Autoimmunität zu entwickeln. Diese geht mit erhöhter Infiltration von Lymphozyten in verschiedene periphere Organe und erhöhten Titern von Autoantikörpern gegen mehrere gewebespezifische Antigene einher, sowie mit erhöhter Suszeptibilität, einen Streptozotocin-induzierten Diabetes oder eine chronische Nierenerkrankung durch IgG-Ablagerungen auf den Glomeruli zu entwickeln (Davalos-

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1. Einführung 19

Misslitz et al, 2007; Kurobe et al., 2006). Die Ursachen für diese starken Ausprägungen werden hauptsächlich im Thymus gesehen, da dieser für die Sicherung der zentralen Toleranz zuständig ist.

Der Weiteren zeigten Davalos-Misslitz et al. (2007), dass der Vorgang der negativen Selektion bei den SP-T-Zellen gestört ist, da die TCR von CCR7-/--Thymozytenein deutliches Defizit in ihrer Stimulierbarkeit aufweisen. Außerdem werden in CCR7-/--Mäusen auch nicht alle Thymozyten klonal deletiert, deren TCR sich reaktiv auf die physiologisch vorkommenden Superantigene in BALB/c-Mäusen zeigen. Dies deutet stark auf eine fehlerhafte Entwicklung seitens der T-Lymphozyten in Abwesenheit von CCR7 hin. Auf Grund der gegenseitigen Beeinflussung könnten die defekten T-Zellen wiederum die Differenzierung der Epithelzellen beeinflussen und somit darüber hinaus zu stromalen, bzw., epithelialen morphologischen Veränderungen und Dysfunktionen führen.

Es ist bekannt, dass die Abwesenheit des CCR7 zu einer veränderten Thymusarchitektur und einer verminderten T-Zell-Anzahl führt (Abb. 1 und Misslitz et al., 2004).

Abb. 1: Unterschiedliche Morphologie von Kortex und Medulla im Thymus von Wildtyp (a) und CCR7-defizienten (b) Mäusen. Hämatoxylin und Eosin gefärbte Kryoschnitte eines Wildtyp- (a) und eines CCR7-defizienten (b) - Mausthymus. Im Gegensatz zum Wildtyp weisen die CCR7-/--Mäuse vermehrte und kleinere Medulla-Areale (rosa) auf, die sich durch den ganzen Kortex (violett) sogar bis unter die Kapsel erstrecken (Pfeile). Zudem ist ein leichter Größenunterschied zwischen Wildtyp- zu knock out-Thymus erkennbar [Abb.

modifiziert aus: Misslitz et al., 2004].

a b

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1. Einführung 20

Die Medulla-Areale (rosa) sind in der CCR7-/--Maus wesentlich kleiner und zahlreicher als im Wildtyp Mäuse. Zusätzlich ist die Medulla viel zerstückelter im ganzen Kortex (violett) verteilt und erstreckt sich sogar bis unter die Kapsel (Pfeile). In der Wildtypmaus ist die Medulla hingegen eine miteinander verbundende, zentral liegende Fläche. Bei der Thymuspräparation wird außerdem deutlich, dass sich die Thymi in ihrer anatomischen Form unterscheiden. Der CCR7-/--Thymus ist insgesamt kleiner und gedrungener.

Veränderte Thymusmorphologien lassen sich auch in anderen Mausmodellen beobachten, in denen eine Blockierung der Thymozyten-Entwicklung vorliegt. Auf Grund der unabdingbaren Interaktionen zwischen T-Zell-Progenitoren und Thymusepithelzellen („thymic crosstalk“) zeigt sich sehr deutlich, dass durch die fehlenden T-Zell-Progenitoren angesichts der T-Zell-Entwicklungsstopps es auch zu Differenzierungsunvollständigkeiten bei den Epithelzellen kommt, was einen anatomisch vollständigen Thymusaufbau unmöglich macht.

CD3ε-Mäusen, bei denen die T-Zell-Entwicklung im Stadium CD25-CD44+ (DN1) gestoppt wird, weisen einen unvollständigen Kortexaufbau und keinerlei Medullastrukturen auf, da die Differenzierungssignale von den nicht vorhandenen T-Zell-Progenitoren fehlen. In RAG-1-/-- und RAG-2-/--Mäusen oder bei Mäusen mit einem SCID, deren T-Zellen in einem Entwicklungsstadium später blockiert worden sind (DN2, CD25+CD44-), ist eine vollständige kortikale Differenzierung sichtbar. Der medulläre Teil fehlt jedoch weiterhin gänzlich.

Bei den CCR7-defizienten Tieren, in deren Thymus alle T-Zellentwicklungsstadien vorhanden sind, wenn auch zeitlich verzögert und mengenmäßig vermindert, sind nun auch medulläre Anteile sichtbar. Der T-Zell-Defekt sowie die veränderte Thymus-Morphologie in CCR7-defizienten Mäusen deuten jedoch daraufhin, dass in der CCR7-/--Maus ein Epithelzelldefekt vorliegt.

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1. Einführung 21

1.5 Ziel der Arbeit

Mit mehreren Studien wurde nachgewiesen, dass der Thymus von CCR7-defizienten Mäusen eine gestörte Thymusarchitektur aufweist, die mit einer Beeinträchtigung der T- Zellentwicklung einhergeht (Ueno et al., 2004; Misslitz et al., 2004).

Wie in Abb.1 dargestellt, sind die Medulla-Bereiche im Thymus von CCR7-defizienten Mäusen viel kleiner und zahlreicher als bei den Wildtyp-Tieren. Zusätzlich sind diese Areale im ganzen Thymus verteilt und erstrecken sich sogar bis unter die Kapsel. Diese morphologischen Auffälligkeiten deuten darauf hin, dass in der Abwesenheit von CCR7 nicht nur die Differenzierung reifer Thymozyten, sondern auch die Entwicklung stromaler Komponenten des Thymus beeinträchtig ist. In bisherigen Studien wurde ausschließlich auf die Entwicklung der Thymozyten in CCR7-/--Mäusen eingegangen. Unbekannt ist aber weitgehend, inwiefern die Entwicklung und Differenzierung der Thymusepithelzellen durch das Fehlen des CCR7 beeinflusst wird.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die vergleichende Analyse der stromalen Komponenten der Thymi zwischen BALB/c-Wildtyp und CCR7-defizienten-Mäusen. Für den phänotypischen Vergleich der Thymi beider Mausstämme wurden Kryoschnitte angefertigt und histologische Immunfluoreszenzfärbungen, sowie durchflusszytometrische Analysen mit isolierten Thymusepithelzellen durchgeführt.

Referenzen

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