Funktionelle Untersuchungen an Spinalganglienneuronen zur Transmission des

3.4.1.1 Isolierung und Kultivierung von murinen Spinalganglienneuronen

Um Spinalganglienneurone (dorsal root ganglion; DRG) für In-vitro-Versuche zu gewinnen, wurden entlang der gesamten Wirbelsäule die entsprechenden Ganglien herauspräpariert (15 – 20 pro Maus). Die Mäuse wurden hierzu mittels CO2-Begasung getötet und ausgeblutet.

Auf dem Bauch liegend, wurde zunächst die Haut entfernt und mit einer Einmalrasierklinge die Muskulatur von der darunter liegenden Wirbelsäule entfernt. Zwischen dem Os occipitale und dem ersten Halswirbel wurde mit einer Schere die Wirbelsäule bzw. das Rückenmark durchtrennt und der Kopf unter den Thorax geklappt. In dieser Position wurde die Maus auf einer festen Unterlage fixiert und die Wirbelsäule möglichst langgestreckt. Mit einer feinen Schere wurde die Wirbelsäule auf voller Länge beidseitig dorsolateral über den Processus transversus eröffnet. Dies geschah möglichst unter Schonung der Dura mater. Durch zur

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Seite Schieben des Rückenmarkes wurden die Ganglien zwischen den Wirbelkörpern sichtbar. Mit einer sehr feinen Präzisionspinzette und einer sehr feinen Schere wurden die Ganglien herauspräpariert und in einem Enzymmix (Collagenase 2,5 mg/ml und Dispase I 2,5 U/ml HBSS) auf Eis gesammelt und anschließend im Wasserbad bei 37 °C für 30 Min.

inkubiert. Danach wurden die Zellen mit einer sterilen Pasteurpipette vereinzelt und für weitere 30 Min. im Wasserbad inkubiert. Hiernach wiederholte sich der Pipettiervorgang.

Anschließend wurde die Einzelzellsuspension in ein 15 ml Polypropylen-Röhrchen überführt und die Reaktion mit ca. 5 ml Medium (DMEM, 10 % FKS, 10 % Penicillin/Streptomycin) abgestoppt. Anschließend erfolgten zwei Waschschritte, bei denen die in Medium resuspendierte Einzelzellsuspension zweimal bei 290 x g für 3 Min. zentrifugiert wurde. Die Überstände wurden dekantiert. Nach dem zweiten Waschschritt wurden die Zellen in Medium resuspendiert und als 20 µl-Tropfen auf die beschichtete Mitte der Deckgläschen gegeben und im Brutschrank zwei Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂-Gehalt inkubiert. Anschließend wurden 500 µl Medium auf die Zellen gegeben und über Nacht im Brutschrank inkubiert. Die Deckgläschen wurden im Vorfeld in einer 12 Well-Platte über Nacht mit einem 25 µl Laminin- (0,1 mg/ml) und Poly-L-Lysin- (0,1 mg/ml) Tropfen beschichtet und am nächsten Morgen mehrfach mit sterilem Wasser gewaschen, durch Lufttrocknung getrocknet und bis zur Nutzung bei Raumtemperatur gelagert.

3.4.1.2. Ca²⁺-Influx-Messungen an Spinalganglienneuronen

Die Fura-2-ratiometrischen Ca²⁺-Messungen wurden in Anlehnung an Rossbach et al. (2011) durchgeführt. Nach einer 30 - 40 minütigen Inkubation der Zellen mit 2 µmol/l des Fluorophors Fura-2-Acetylmethylester (Fura-2-AM; C44H47N3O24) wurden die Deckgläschen mit den darauf befindlichen Zellen in die Messkammer gelegt und während des gesamten Versuches mit Lockes-Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min perfundiert.

Fura-2-AM gelangt durch passive Diffusion in die Zelle. In der Zelle werden die AM-Gruppen durch Esterasen abgespalten und so Fura-2 aktiviert. Diese Messkammer wurde auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop platziert und die Fluoreszenz mit alternierendem UV-Licht von 340 und 380 nm angeregt. Das bei 510 nm emittierte UV-Licht wurde alle 500 ms durch eine an die UV-Lampe angeschlossene Kamera aufgenommen. Vor jeder Messung wurden die regions of interest (ROIs) festgelegt, indem mit einem Markierungstool die einzelnen

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Zellen markiert wurden. Die Software misst spezifisch in diesen Bereichen die Fluoreszenzänderungen des durch das Fluorophor nach Anregung emittierten Lichtes und stellt diese als Kurve dar. In ungebundenem Zustand wird Fura-2 durch Licht der Wellenlänge 380 nm angeregt. Sobald es in der Zelle an Ca²⁺ bindet, verändert es seine Konformität (Abb. 7) und wird von Licht der Wellenlänge 340 nm erregt. Reagiert eine Zelle auf eine der applizierten Testsubstanzen, gelangt Ca²⁺ in die Zelle und wird vom Fluorophor gebunden.

Daraufhin verändert sich das Verhältnis von ungebundenem zu gebundenem Fura-2, was sich in der Verhältnisänderung des emittierten Lichtes von 340/380 nm widerspiegelt. Um mechanische Reaktionen der Zellen während der Substanzapplikation auszuschließen, wurden zu Beginn jeder Messung 50 µl des Lockes-Puffers oder entsprechender Vehikel (0,05 % Ethanol oder DMSO) zu den verwendeten Substanzen mit einer Pipette auf die Zellen gegeben. Zellen, die hier eine Reaktion über dem Schwellenwert von 10 % über der Basallinie zeigten, fanden in der Auswertung keine Berücksichtigung. Die Neurone wurden mit verschiedenen Agonisten (Tab. 19) stimuliert, nach einer Waschphase von 2 Minuten mit einem TRP-Antagonisten (Tab. 20) behandelt und 10 – 30 Sekunden später erneut mit dem zuvor eingesetzten Agonisten stimuliert. Zur Kontrolle der Spezifität der durch die Histaminrezeptorliganden ausgelösten Reaktionen wurden einige aktivierte Zellen mit einem H1R- oder einem H4R-Antagonisten behandelt (Tab. 20). Nur Zellen, die am Ende mit einem Ca²⁺-Influx auf eine Capsaicin (1 µmol/l) oder KCl-Gabe (150 mmol/l) reagierten, wurden in die Auswertung mit einbezogen.

Abbildung 7: Fura-2 Bindung an Ca²⁺ nach Abspaltung der AM-Gruppen durch Esterasen http://www.dojindo.com/Images/Product%20Photo/F014_fig1.jpg (abgerufen: 17.08.2017)

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Tabelle 19: Zur Neuronenstimulation verwendete Agonisten und ihre Konzentrationen Stimulanz Zielstruktur Konzentration

HTMT H1R, H2R 0,1 mmol/l

4-Methylhistamin H2R, H4R 0,1 mmol/l

ST-1006 H4R 0,1 mmol/l

Histamin H1R, H2R,

H3R, H4R

1 mmol/l

Die Konzentrationen wurden nach Angaben in der Literatur verwendet oder aus früheren Versuchen abgeleitet (ROSSBACH et al. 2011; FUKUYAMA et al. 2017).

Tabelle 20: Verwendete Antagonisten/Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf den intrazellulären Ca²⁺-Influx in Spinalganglienneurone nach Agonistenstimulation

Antagonist/Inhibitor Zielstruktur Konzentration

Diphenhydramin H1R 10 µmol/l

JNJ7777120 H4R 10 µmol/l

Ruthenium Red TRP-Kanäle 1 µmol/l, 10 µmol/l HC-030031 TRPA1 1 µmol/l, 10 µmol/l

SB366791 TRPV1 1 µmol/l, 10 µmol/l

Die Konzentrationen wurden nach Angaben in der Literatur ausgewählt oder aus früheren Versuchen abgeleitet (JIAN et al. 2016).

3.4.1.2.1. Auswertung der Ca²⁺-Influx-Messungen

Änderungen in dem Verhältnis von 340 zu 380 nm (R/R0; R0 = initiale Ratio) von > 10 % wurden als positive Reaktion auf eine Substanz interpretiert. Eine Inhibition wurde dementsprechend als erfolgreich gewertet, wenn die untersuchte Zelle nach erneuter Stimulation den Schwellenwert von 10 % nicht mehr erreichte. Die positiv auf einen Stimulus reagierenden Neuronen werden als Prozent der totalen Neuronen ausgedrückt.

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3.4.2. In-vitro-Versuche zum Vergleich der Rezeptorexpression auf Spinalganglien bei