Versuchstiere

Für die In-vivo-Versuche wurden weibliche BALB/c- (BALB/cAnNCrl), NMRI- (Clr:NMRI (Han)) und CD-1-Mäuse (Crl:CD-1) (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Deutschland) sowie weibliche und männliche C57BL/6J-Mäuse (The Jackson Laboratory; Bar Harbor, Me, USA) bezogen. Weiterhin wurden weibliche und männliche TRPV1-Knockout-Mäuse (B6.129X1-Trpv1^tm1Jul/J), auch als TRPV1^-/- bezeichnet, und TRPA1-Knockout-Mäuse (B6;129P-Trpa1^tm1Kykw/J), auch als TRPA1^-/- bezeichnet, von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Me, USA) bezogen. Deren Nachkommen wurden nach Genotypisierung für die Juckreizversuche genutzt. Ein Doppel-Knockout-Stamm für einen gleichzeitigen Knockout des TRPV1- und TRPA1-Kanals (TRPV1^-/-/TRPA1^-/-) wurde vom Labor von Dr. Santosh Mishra am College of Veterinary Medicine der North Carolina State University (Raleigh, NC, USA) selbst aus den oben genannten Stämmen gezüchtet und ebenfalls genotypisiert. Die Tiere waren zu Beginn der Untersuchungen sechs bis acht Wochen alt, klinisch gesund und

Material und Methoden

40

wogen je nach Mausstamm 20 - 30 g. Die Mäuse wurden in Gruppen zu viert oder sechst pro Käfig in einem 12-Stunden-Hell/Dunkelzyklus bei 22 °C Raumtemperatur gehalten.

Pelletfutter (Altromin 1824 und LabDiet 5001) und Wasser standen ad libitum zur Verfügung.

Die Mäuse wurden in Makrolonkäfigen Typ III (6er Gruppen) oder Typ II (4er Gruppen, Allentown IVC cages) gehalten. Diese waren mit Einstreu aus Weichholzgranulat (Altromin und Anderson Bed-o' Cobs 1/4") und Nistmaterial (Ancare Nestlets) oder Mäusehäusern (Mouse House, Tecniplast, Italien) ausgestattet. Für die Isolierung der Spinalganglienneurone für intrazelluläre Ca²⁺-Messungen wurden weibliche BALB/cAnNCrl- und C57BL/6NCrl- (Charles River Laboratories, Raleigh, NC, USA) im Alter von vier bis acht Wochen verwendet. Die CD-1-Mäuse für die Ca²⁺-Messungen wurden selbst gezüchtet, um sicherzustellen, dass zu jedem Zeitpunkt Tiere im gleichen Alter vorhanden waren. Die Versuche wurden von der Bezirksregierung Hannover (Aktenzeichen AZ 33.19-42502-04-16/2213) und vom North Carolina State University Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol No. 16-038-B (1) und IACUC Protocol No. 16-038-B (1)) genehmigt.*

*Ein Teil der Versuche wurde im Rahmen eines Auslandsaufenthaltes in der Arbeitsgruppe von Herrn Prof.

Wolfgang Bäumer an der North Carolina State University in Raleigh, NC, USA durchgeführt.

Material und Methoden

41 3.2. Versuchsübersicht

Ziel der vorliegenden Studie war es, Erkenntnisse zu dem intrazellulären Signalweg des über den H4R induzierten Juckreizes zu gewinnen. Hierfür sollte zunächst in Anlehnung an INAGAKI et al. (2001) ermittelt werden, ob es durch die Injektion eines H4R-Agonisten bei verschiedenen Mausstämmen zu Unterschieden in der Ausprägung des Kratzverhaltens kommt. Hierzu wurde das Kratzverhalten von vier verschiedenen Mausstämmen (CD-1, BALB/c, C57BL/6, NMRI) nach intradermaler Injektion von 4-Methylhistamin untersucht.

Die CD-1-Mäuse zeigten sich hier am sensitivsten und wurden ausschließlich für die weiteren Untersuchungen verwendet. Zunächst wurden Dosis-Wirkungs-Untersuchungen mit Histamin, H1R-, H2R- und H4R-Agonisten an CD-1-Mäusen und mit den dort ermittelten Dosierungen alle weiteren Versuche durchgeführt. Im weiteren Verlauf der Studie sollte zunächst festgestellt werden, ob eine zentrale Wirksamkeit von H4R-Antagonisten zur Inhibition des über den H4R induzierten Juckreizes notwendig ist oder ob eine periphere Wirkung ausreicht. Hierzu wurde die antipruritische Wirkung des ZNS-gängigen H4R-Antagonisten JNJ7777120 mit der des nicht-ZNS-gängigen JNJ39594906 auf durch Histamin und über den H4R induzierten Juckreiz untersucht. Im Hauptteil der Studie wurde zur Untersuchung des intrazellulären H4R-Signalweges zunächst die Beteiligung der TRP-Kanäle TRPV1 und TRPA1 am durch Histamin ausgelösten Juckreiz ermittelt. Hierbei und bei allen weiteren Untersuchungen lag der Fokus auf dem über den H4R induzierten Juckreiz. Daher wurde die Wirkung der TRPV1- und TRPA1-Inhibitoren auf den intradermal induzierten Juckreiz untersucht. Zum gleichen Zweck wurde bei TRPV1^-/--, TRPA1^-/-- und TRPV1^-/-/TRPA1^-/--Mäusen mit C57BL/6-Hintergrund das Kratzverhalten bei histamininduziertem Juckreiz beurteilt. Zur Ermittlung der an den nachgeschalteten Signalwegen der TRP-Kanäle beteiligten intrazellulären Signalmoleküle wurde, in Anlehnung an den für den histamininduzierten Juckreiz beschriebenen Transmissionsweg, der Einfluss von Phospholipasen, Proteinkinasen und Adenylylzyklasen auf den histamininduzierten Juckreiz untersucht (KREMER et al. 2014).

Im letzten Teil der Studie wurde versucht, in vitro die Beteiligung von TRP-Kanälen am intrazellulären H4R-Signalweg sensorischer Neurone zu zeigen. Hierzu wurden Spinalganglienneuronen mittels Ca²⁺-Influx-Messungen nach Stimulation mit Histamin, H1R- und H4R-Agonisten analysiert. Weiterhin wurde eruiert, ob die Reaktionen durch eine

Material und Methoden

42

Behandlung mit einem generellen TRP-Kanal-Inhibitor, einem TRPA1- oder einem TRPV1-Kanal-Inhibitor gehemmt werden konnten. Zur weiteren Untersuchung der in vivo gefundenen Unterschiede im Kratzverhalten wurde vergleichend der Histamineinfluss auf die Reaktivität der Neurone verschiedener Mausstämme untersucht.

3.3. In-vivo-Versuche

Als Parameter für Juckreiz wurde das Kratzverhalten der Mäuse nach intradermaler Injektion von Histamin, H1R-, H2R-, H4R-Agonisten oder dem dazugehörigen Vehikel (Lösemittel der Substanzen) analysiert. Zur Untersuchung des Einflusses von Histaminrezeptor-Antagonisten oder spezifischer Inhibitoren der intrazellulären Signalwege (Tab. 7), wurden die Mäuse mit den einzelnen Testsubstanzen oder Vehikel vorbehandelt und nach 30 Min. Juckreiz durch intradermale Injektion von Histamin, H1R-, H2R- oder H4R-Agonisten ausgelöst. Die Versuche fanden meist an Gruppen von sechs bis neun Mäusen statt. Jede Maus wurde bis zu viermal für Juckreizversuche verwendet. Zwischen den einzelnen Versuchen lagen mindestens zwei Wochen, wodurch sichergestellt werden sollte, dass sich keine Rückstände der verwendeten Substanzen mehr in den Versuchstieren befanden, ebenso um diese nicht unnötig hohem Stress auszusetzen. Die Mäuse wurden 24 h vor Versuchsbeginn mit einer Schermaschine im Nacken rasiert. Unmittelbar nach der Juckreizinduktion wurden die Tiere in durchsichtige Plastikkäfige (13 x 20 x 12 cm; Höhe x Breite x Tiefe) gesetzt. Die Mäuse wurden über 30 Minuten mit einer Kamera gefilmt und die Juckreizantwort anschließend am Computer visuell ausgewertet. Damit eine ungestörte Ausprägung des normalen Kratzverhaltens beobachtet werden konnte, befand sich zum Zeitraum der Aufnahme der Tiere kein Personal im Versuchsraum.

Material und Methoden

43

Tabelle 7: Substanzen, deren Einfluss auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden überprüft werden sollte

TRPV1-Inhibitor Capsazepin, SB366791 SHIM et al. (2007);

TERADA et al. (2013)

TRPA1-Inhibitor HC-030031 LIU et al. (2013)

Phospholipase A2-Inhibitor Quinacrin KIM et al. (2004) Phospholipase C-Inhibitor U73122 LIANG et al. (2010) Proteinkinase A-Inhibitor H89 LIANG et al. (2010) Proteinkinase-C-Inhibitor Bisindolylmaleimid I LIANG et al. (2010) Adenylylzyklase-Inhibitor SQ22536 LIANG et al. (2010) H4R-Antagonist JNJ7777120, JNJ39594906 THURMOND et al. (2004);

FUNKE et al. (2015)

3.3.1. Bewertung des Kratzverhaltens

Als Kratzattacke gewertet wurde in Anlehnung an KURAISHI et al. (1995), wenn sich die Maus mit ihrer Hinterpfote im Applikationsbereich kratzte. Als eine Kratzattacke galt eine Serie von Kratzbewegungen mit der Hinterpfote an der Applikationsstelle bis zum Absetzen oder Beknabbern der Pfote. Eine solche Attacke kann mehrere Sekunden andauern (SHIMADA u. LAMOTTE 2008). Nicht berücksichtigt wurden bei der Auswertung Kratzbewegungen, die zu anderen Körperstellen hin gerichtet waren, wie z. B. zum Gesicht oder zur seitlichen Bauchwand. Weiterhin nicht mit einbezogen wurden Beknabbern und Belecken der Applikationsstelle. Die Beobachtung erfolgte per Videoanalyse. Die Videos wurden für eine spätere Auswertung und zu Archivierungszwecken gespeichert.

3.3.2. Versuche zum Kratzverhalten nach 4-Methylhistamin-Injektion bei verschiedenen Mausstämmen

Den Mäusen der Stämme BALB/c, CD1, NMRI und C57BL/6 wurde am Versuchstag 4-Methylhistamin in verschiedenen Konzentrationen (5/50/100/250/500 nmol/50 µl NaCl) intradermal in die Nackenhaut appliziert. Als Vehikelkontrolle wurden 50 µl sterile Natriumchloridlösung (NaCl) i.d. appliziert.

Material und Methoden

44

3.3.3. In-vivo-Untersuchungen zur Transmission des histamininduzierten Juckreizsignals

3.3.3.1. Dosis-Wirkungs-Untersuchungen

Zunächst wurden Dosis-Wirkungs-Untersuchungen durch intradermale Applikation der zu untersuchenden Histaminrezeptor-Agonisten durchgeführt, um die für die Versuche beste Dosierung zu ermitteln. Die in Tabelle 8 genannten Dosierungen wurden immer mit einer Vehikelinjektion (NaCl) verglichen. Als optimale Dosierung wurde die geringste Dosierung angesehen, die einen statistisch signifikanten Unterschied zur Vehikelkontrolle zeigte.

Tabelle 8: Für die In-vivo-Versuche verwendete Histaminrezeptor-Agonisten und ihre durch lokale Applikation untersuchten Mengen

Substanz Angesprochene Rezeptoren Applizierte Menge (nmol/50 µl) Histamin H1R, H2R, H3R, H4R 5, 10, 25, 50, 75, 100

2-Pyridylethylamin H1R 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 1000

HTMT H1R, H2R 50, 100, 250, 500

Amthamin H2R 10, 50, 100, 250, 500

Pitolisant H3R (inverser Agonist) 50

4-Methylhistamin H2R, H4R 5, 10, 25, 50, 75, 100

ST-1006 H4R 5, 10, 25, 50, 75, 100

Vehikelkontrolle 50 µl NaCl

3.3.3.2. Einfluss von TRP-Kanal-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz

Zur Untersuchung einer möglichen Beteiligung der TRP-Kanäle wurden die Mäuse intraperitoneal mit einem der TRPV1-Kanal-Inhibitoren, einem TRPA1-Kanal-Inhibitor oder Vehikel vorbehandelt. Nach 30 Min. wurde der Juckreiz durch intradermale Injektion von Histamin (25 nmol/50 µl), 2-Pyridylethylamin (1 µMol/50 µl), HTMT (100 nmol/50 µl), Pitolisant (50 nmol/50 µl), 4-Mehtylhistamin (50 nmol/50 µl) oder ST-1006 (50 nmol/50 µl) ausgelöst. Die verwendeten Dosierungen der TRPV1- und TRPA1-Inhibitoren sind in Tabelle 9 zu finden. Am Beispiel vom durch Histamin ausgelösten Juckreiz wurde eine Dosis-Wirkungs-Kurve zum TRPA1-Inhibitor HC-030031 (20,40,60 mg/kg) durchgeführt.

Material und Methoden

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Tabelle 9: Verwendete TRP-Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden und ihre jeweiligen untersuchten Dosierungen Substanz Inhibierter Kanal Dosierung (in 200 µl)

Capsazepin TRPV1 6 mg/kg i.p.

SB366791 TRPV1 0,5 mg/kg i.p.

HC-030031 TRPA1 20, 40, 60 mg/kg i.p.

Vehikelkontrolle 10 % DMSO (in PBS) i.p.

i.p. = intraperitoneal; Die verwendeten Dosierungen wurden aus der Literatur übernommen und z. T. anhand früherer Versuche angepasst (SHIM et al. 2007; NGUYEN et al. 2010; FERNANDES et al. 2013; LIU et al.

2013; TERADA et al. 2013).

3.3.3.3. Einfluss von Phospholipase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz

Zur Untersuchung einer möglichen Beteiligung der Phospholipasen A2 (PLA2) und C (PLC) wurden die Tiere mit einem PLA2-Inhibitor intraperitoneal oder mit einem PLC-Inhibitor intradermal vorbehandelt. Nach 30 Min. wurde der Juckreiz durch intradermale Injektion von Histamin (25 nmol/50 µl), HTMT (100 nmol/50 µl), 4-Methylhistamin (50 nmol/50 µl) oder ST-1006 (50 nmol/50 µl) ausgelöst. Die Dosierungen der PLA2- und PLC-Inhibitoren sind in Tabelle 10 zu finden.

Tabelle 10: Verwendete Phospholipase (PL)-Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden und ihre jeweiligen untersuchten Dosierungen

Substanz Inhibiertes Enzym Dosierung Applikationsroute und -volumen

Quinacrin PLA2 20 mg/kg i.p., 200 µl

U73122 PLC 50 pmol/50 µl i.d., 50 µl

Vehikel zu Quinacrin

Aqua ad injectionem i.p., 200 µl

Vehikel zu U73122 2 % DSMO (in NaCl) i.d., 50 µl

PLA2 = Phospholipase A2; PLC = Phospholipase C; i.p. = intraperitoneal; i.d. = intradermal; Die verwendeten Dosierungen wurden aus der Literatur übernommen (SHIM et al. 2007; LIANG et al. 2010).

Material und Methoden

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3.3.3.4. Einfluss von Proteinkinase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz

Zur Untersuchung einer möglichen Beteiligung der Proteinkinasen A (PKA) und C (PKC) wurden die Mäuse mit einem PKA-Inhibitor oder einem PKC-Inhibitor vorbehandelt. Nach 30 Min. wurde der Juckreiz durch intradermale Injektion von Histamin (25 nmol/50 µl), HTMT (100 nmol/50 µl), 4-Methylhistamin (50 nmol/50 µl) oder ST-1006 (50 nmol/50 µl) ausgelöst. Die Dosierungen der PLA2- und PLC-Inhibitoren sind in Tabelle 11 zu finden.

Tabelle 11: Verwendete Proteinkinase (PK)-Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden und ihre jeweiligen untersuchten Dosierungen

Substanz Inhibiertes Enzym Dosierung Applikationsroute und -volumen

H89 PKA 10 mg/kg i.p., 200 µl

Bisindolylmaleimid I (BIM)

PKC 2 µg

5 µg

i.d., 50 µl

Vehikelkontrolle zu H89

10 % DMSO i.p., 200 µl

Vehikelkontrolle zu BIM

5 % DMSO (in NaCl) i.d. 50 µl

PKA = Proteinkinase A; PKC = Proteinkinase C; i.p. = intraperitoneal; i.d. = intradermal; Die verwendeten Dosierungen wurden aus der Literatur übernommen (LIANG et al. 2010; REBER et al. 2012).

3.3.3.5. Einfluss eines Adenylylzyklase-Inhibitors auf histamininduzierten Juckreiz Zur Untersuchung einer möglichen Beteiligung von Adenylzyklasen wurden die Mäuse mit einem Adenylylzyklase-Inhibitor vorbehandelt. Nach 30 Min. wurde der Juckreiz durch intradermale Injektion von Histamin (25 nmol/ 50 µl), HTMT (100 nmol/50 µl), 4-Methylhistamin (50 nmol/50 µl) oder ST-1006 (50 nmol/50 µl) ausgelöst. Die Dosierungen der PLA2- und PLC-Inhibitoren sind in Tabelle 12 zu finden.

Material und Methoden

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Tabelle 12: Verwendeter Adenylylzyklase-Inhibitor und seine untersuchte Dosierung Substanz Inhibiertes Enzym Applikationsmenge SQ22536 Adenylylzyklasen 500 nmol/50 µl i.d.

Vehikelkontrolle 2 % DSMO (in NaCl) i.d.

i.d. = intradermal; Die verwendeten Dosierungen wurden aus der Literatur übernommen (LIANG et al. 2010).

3.3.3.6. Untersuchungen an TRPV1- und TRPA1-Knockout-Mäuse

An den TRPV1^-/-- und TRPA1^-/--Mäusen wurde das Kratzverhalten nach Gabe von Histamin (800 nmol/ 50 µl), HTMT (100 nmol/ 50 µl), 4-Methylhistamin (100/500 nmol/ 50 µl) oder ST-1006 (100 nmol/ 50 µl) im Vergleich zum Wildtyp untersucht. Zusätzlich erfolgte eine vergleichende Untersuchung nach 4-Methylhistamin- oder ST-1006-Gabe bei drei TRPV1^-/-/TRPA1^-/--Mäusen in oben genannten Konzentrationen.

3.3.3.6.1. Genotypisierung der TRPV1- und TRPA1-Knockout-Mäusen

Für die Genotypisierung wurde genomische DNA aus der Schwanzspitze verwendet. Hierzu wurde den Mäusen beim Absetzen von dem Muttertier mit Scherenschlag ein Stück der Schwanzspitze entfernt und anschließend die Schnittwunde mit Gewebekleber verschlossen.

Die Schwanzspitzen wurden jeweils in 400 µl Tail Lysis Buffer über Nacht bei 60 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Proben in 600 µl Neutralisationspuffer gegeben, gemischt und 3 Min. bei 1200 x g zentrifugiert. Die Überstände wurden in den angegebenen Mengen (Tab. 14 und 16) für die PCR verwendet. Die Mengen für die Ansätze und die Programmeinstellungen für den Cycler sind den Tabellen 14 bis 17 zu entnehmen.

Nach erfolgter PCR wurden die Proben auf ein 1,5 %iges Agarosegel aufgetragen. Hierfür wurden 10 µl der Probe mit 1 µl EZ-Vision^® DNA Dye as Loading Buffer versetzt und davon 10 µl auf das Gel aufgetragen. Ein DNA-Standard wurde auf jedem Gel mitaufgetragen. Die Detektion der Banden fand unter UV-Licht statt. Die zu erwartenden Größen der PCR-Produkte sind in Tabelle 13 aufgeführt.

Material und Methoden

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Tabelle 13: Die bei der Genotypisierung der TRPV1^-/-- und TRPA1^-/--Mäuse zu erwartenden PCR Produktgrößen in Basenpaaren (base pairs; bp)

TRPV1 TRPA1

Wildtyp 289 bp 317 bp

Mutante/Knockout 176 bp 184 bd

Heterozygote 176 bp und 289 bp 184 bp und 317 bp

Tabelle 14: Zusammensetzung der Ansätze für die Genotypisierung der TRPA1^-/--Mäuse nach Herstellerangaben

Reagenz Menge pro Probe in µl Finale Konzentration RNAse freies Wasser 2,76

10 x AB PCR Buffer II 1,2 1 x

25 mM MgCl2 0,96 2 mM

2,5 mM dNTP 0,96 0,2 mM

20 µM oIMR8645 0,6 1 µM

20 µM oIMR8646 0,6 1 µM

20 µM oIMR9179 0,6 1 µM

20 µM oIMR9180 0,6 1 µM

5 µM DNA Loading Dye 1,66 0,69 mM

5 U/µl Taq DNA Polymerase 0,06 0,03 U/µl

DNA 2,0*

*eine Probe als Negativkontrolle mit RNAse freiem Wasser statt DNA.

Tabelle 15: Cyclereinstellungen für die Genotypisierung der TRPA1^-/--Mäuse nach Herstellerangaben Schritt Temperatur °C Zeit Notiz

1 94 3 Min.

2 94 30 s Schritt 2-4

35x wiederholen

3 68 30 s

4 72 30 s

5 72 2 Min.

6 10 ∞

Material und Methoden

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Tabelle 16: Zusammensetzung der Ansätze für die Genotypisierung der TRPV1^-/--Mäuse nach Herstellerangaben

Reagenz Menge pro Probe in µl Finale Konzentration RNAse freies Wasser 4,25

10 x AB PCR Buffer II 2,4 1 x

25 mM MgCl2 0,96 2 mM

10 mM dNTP 0,24 0,2 mM

20 µM oIMR1627 0,3 0,5 µM

20 µM 19922 0,3 0,5 µM

20 µM 19923 0,3 0,5 µM

5 µM DNA Loading Dye 1,2 0,5 mM

2,5 U/µl Taq DNA Polymerase 0,05 0,01 U/µl

DNA 2,0*

*eine Probe wird als Negativkontrolle mit RNAse freiem Wasser statt DNA angesetzt.

Tabelle 17: Cyclereinstellungen für die Genotypisierung der TRPV1^-/--Mäuse nach Herstellerangaben Schritt Temperatur °C Zeit Notiz

1 94 2 Min.

2 94 20 s

3 65 15 s - 0,5 °C pro Zyklus

senken

4 68 10 s

5 Schritt 2 – 4

10 x wiederholen

6 94 15 s

7 60 15 s

8 72 10 s

9 Schritt 6 – 8

28 x wiederholen

10 72 2 Min.

11 10 ∞

Material und Methoden

50

3.3.3.7. Einfluss von ZNS- und nicht-ZNS-gängigen Histamin-4-Rezeptor-Antagonisten auf histamininduzierten Juckreiz

Zur Untersuchung der juckreizhemmenden Wirkung von einem ZNS- im Vergleich mit einem nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten wurden die Mäuse mit einem von diesen vorbehandelt und nach 30 Min. wurde der Juckreiz durch intradermale Injektion von 4-Methylhistamin (50 nmol/50 µl) ausgelöst. Die Dosierungen der H4R-Antagonisten sind in Tabelle 18 zu finden.

Tabelle 18: Verwendete Histamin-4-Rezeptor-Antagonisten zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von 4-Methylhistamin und ihre untersuchten Dosierungen

Substanz ZNS-gängig Dosierung (in 200 µl)

JNJ7777120 Ja 20 mg/kg i.p.

JNJ39594906 Nein 20 mg/kg i.p.

Vehikelkontrolle Aqua ad injectionem i.p.

Die verwendeten Dosierungen wurden aus der Literatur übernommen (DUNFORD et al. 2006).

3.4. In-vitro-Untersuchungen

3.4.1. Funktionelle Untersuchungen an Spinalganglienneuronen zur Transmission des Juckreizsignals mittels Ca²⁺-Influx-Messungen

3.4.1.1 Isolierung und Kultivierung von murinen Spinalganglienneuronen

Um Spinalganglienneurone (dorsal root ganglion; DRG) für In-vitro-Versuche zu gewinnen, wurden entlang der gesamten Wirbelsäule die entsprechenden Ganglien herauspräpariert (15 – 20 pro Maus). Die Mäuse wurden hierzu mittels CO2-Begasung getötet und ausgeblutet.

Auf dem Bauch liegend, wurde zunächst die Haut entfernt und mit einer Einmalrasierklinge die Muskulatur von der darunter liegenden Wirbelsäule entfernt. Zwischen dem Os occipitale und dem ersten Halswirbel wurde mit einer Schere die Wirbelsäule bzw. das Rückenmark durchtrennt und der Kopf unter den Thorax geklappt. In dieser Position wurde die Maus auf einer festen Unterlage fixiert und die Wirbelsäule möglichst langgestreckt. Mit einer feinen Schere wurde die Wirbelsäule auf voller Länge beidseitig dorsolateral über den Processus transversus eröffnet. Dies geschah möglichst unter Schonung der Dura mater. Durch zur

Material und Methoden

51

Seite Schieben des Rückenmarkes wurden die Ganglien zwischen den Wirbelkörpern sichtbar. Mit einer sehr feinen Präzisionspinzette und einer sehr feinen Schere wurden die Ganglien herauspräpariert und in einem Enzymmix (Collagenase 2,5 mg/ml und Dispase I 2,5 U/ml HBSS) auf Eis gesammelt und anschließend im Wasserbad bei 37 °C für 30 Min.

inkubiert. Danach wurden die Zellen mit einer sterilen Pasteurpipette vereinzelt und für weitere 30 Min. im Wasserbad inkubiert. Hiernach wiederholte sich der Pipettiervorgang.

Anschließend wurde die Einzelzellsuspension in ein 15 ml Polypropylen-Röhrchen überführt und die Reaktion mit ca. 5 ml Medium (DMEM, 10 % FKS, 10 % Penicillin/Streptomycin) abgestoppt. Anschließend erfolgten zwei Waschschritte, bei denen die in Medium resuspendierte Einzelzellsuspension zweimal bei 290 x g für 3 Min. zentrifugiert wurde. Die Überstände wurden dekantiert. Nach dem zweiten Waschschritt wurden die Zellen in Medium resuspendiert und als 20 µl-Tropfen auf die beschichtete Mitte der Deckgläschen gegeben und im Brutschrank zwei Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂-Gehalt inkubiert. Anschließend wurden 500 µl Medium auf die Zellen gegeben und über Nacht im Brutschrank inkubiert. Die Deckgläschen wurden im Vorfeld in einer 12 Well-Platte über Nacht mit einem 25 µl Laminin- (0,1 mg/ml) und Poly-L-Lysin- (0,1 mg/ml) Tropfen beschichtet und am nächsten Morgen mehrfach mit sterilem Wasser gewaschen, durch Lufttrocknung getrocknet und bis zur Nutzung bei Raumtemperatur gelagert.

3.4.1.2. Ca²⁺-Influx-Messungen an Spinalganglienneuronen

Die Fura-2-ratiometrischen Ca²⁺-Messungen wurden in Anlehnung an Rossbach et al. (2011) durchgeführt. Nach einer 30 - 40 minütigen Inkubation der Zellen mit 2 µmol/l des Fluorophors Fura-2-Acetylmethylester (Fura-2-AM; C44H47N3O24) wurden die Deckgläschen mit den darauf befindlichen Zellen in die Messkammer gelegt und während des gesamten Versuches mit Lockes-Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min perfundiert.

Fura-2-AM gelangt durch passive Diffusion in die Zelle. In der Zelle werden die AM-Gruppen durch Esterasen abgespalten und so Fura-2 aktiviert. Diese Messkammer wurde auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop platziert und die Fluoreszenz mit alternierendem UV-Licht von 340 und 380 nm angeregt. Das bei 510 nm emittierte UV-Licht wurde alle 500 ms durch eine an die UV-Lampe angeschlossene Kamera aufgenommen. Vor jeder Messung wurden die regions of interest (ROIs) festgelegt, indem mit einem Markierungstool die einzelnen

Material und Methoden

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Zellen markiert wurden. Die Software misst spezifisch in diesen Bereichen die Fluoreszenzänderungen des durch das Fluorophor nach Anregung emittierten Lichtes und stellt diese als Kurve dar. In ungebundenem Zustand wird Fura-2 durch Licht der Wellenlänge 380 nm angeregt. Sobald es in der Zelle an Ca²⁺ bindet, verändert es seine Konformität (Abb. 7) und wird von Licht der Wellenlänge 340 nm erregt. Reagiert eine Zelle auf eine der applizierten Testsubstanzen, gelangt Ca²⁺ in die Zelle und wird vom Fluorophor gebunden.

Daraufhin verändert sich das Verhältnis von ungebundenem zu gebundenem Fura-2, was sich in der Verhältnisänderung des emittierten Lichtes von 340/380 nm widerspiegelt. Um mechanische Reaktionen der Zellen während der Substanzapplikation auszuschließen, wurden zu Beginn jeder Messung 50 µl des Lockes-Puffers oder entsprechender Vehikel (0,05 % Ethanol oder DMSO) zu den verwendeten Substanzen mit einer Pipette auf die Zellen gegeben. Zellen, die hier eine Reaktion über dem Schwellenwert von 10 % über der Basallinie zeigten, fanden in der Auswertung keine Berücksichtigung. Die Neurone wurden mit verschiedenen Agonisten (Tab. 19) stimuliert, nach einer Waschphase von 2 Minuten mit einem TRP-Antagonisten (Tab. 20) behandelt und 10 – 30 Sekunden später erneut mit dem zuvor eingesetzten Agonisten stimuliert. Zur Kontrolle der Spezifität der durch die Histaminrezeptorliganden ausgelösten Reaktionen wurden einige aktivierte Zellen mit einem H1R- oder einem H4R-Antagonisten behandelt (Tab. 20). Nur Zellen, die am Ende mit einem Ca²⁺-Influx auf eine Capsaicin (1 µmol/l) oder KCl-Gabe (150 mmol/l) reagierten, wurden in die Auswertung mit einbezogen.

Abbildung 7: Fura-2 Bindung an Ca²⁺ nach Abspaltung der AM-Gruppen durch Esterasen http://www.dojindo.com/Images/Product%20Photo/F014_fig1.jpg (abgerufen: 17.08.2017)

Material und Methoden

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Tabelle 19: Zur Neuronenstimulation verwendete Agonisten und ihre Konzentrationen Stimulanz Zielstruktur Konzentration

HTMT H1R, H2R 0,1 mmol/l

4-Methylhistamin H2R, H4R 0,1 mmol/l

ST-1006 H4R 0,1 mmol/l

Histamin H1R, H2R,

H3R, H4R

1 mmol/l

Die Konzentrationen wurden nach Angaben in der Literatur verwendet oder aus früheren Versuchen abgeleitet (ROSSBACH et al. 2011; FUKUYAMA et al. 2017).

Tabelle 20: Verwendete Antagonisten/Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf den intrazellulären Ca²⁺-Influx in Spinalganglienneurone nach Agonistenstimulation

Antagonist/Inhibitor Zielstruktur Konzentration

Diphenhydramin H1R 10 µmol/l

JNJ7777120 H4R 10 µmol/l

Ruthenium Red TRP-Kanäle 1 µmol/l, 10 µmol/l HC-030031 TRPA1 1 µmol/l, 10 µmol/l

SB366791 TRPV1 1 µmol/l, 10 µmol/l

Die Konzentrationen wurden nach Angaben in der Literatur ausgewählt oder aus früheren Versuchen abgeleitet (JIAN et al. 2016).

3.4.1.2.1. Auswertung der Ca²⁺-Influx-Messungen

Änderungen in dem Verhältnis von 340 zu 380 nm (R/R0; R0 = initiale Ratio) von > 10 % wurden als positive Reaktion auf eine Substanz interpretiert. Eine Inhibition wurde dementsprechend als erfolgreich gewertet, wenn die untersuchte Zelle nach erneuter Stimulation den Schwellenwert von 10 % nicht mehr erreichte. Die positiv auf einen Stimulus reagierenden Neuronen werden als Prozent der totalen Neuronen ausgedrückt.

Material und Methoden

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3.4.2. In-vitro-Versuche zum Vergleich der Rezeptorexpression auf Spinalganglien bei verschiedenen Mausstämmen

3.4.2.1. Funktionelle Rezeptoruntersuchungen an murinen Spinalganglienneuronen

3.4.2.1. Funktionelle Rezeptoruntersuchungen an murinen Spinalganglienneuronen

Im Dokument Untersuchungen zur Transmission des über den Histamin-4-Rezeptor induzierten Juckreizsignals (Seite 55-0)