Verbesserung der Zelladhäsion durch Beschichtung der Well-Platten

Die Beurteilung der Zelladhäsion in den Well-Platten, die mit Kollagen (frisch und getrocknet), Bovinem Serum Albumin (BSA) und Gelatine beschichtet wurden, erfolgte im Vergleich zur unbeschichteten Well-Platte zunächst durch eine rein visuelle Prüfung. Die Beschichtung der Bodenfläche mit 1 %-iger Gelatine-Lösung entsprach dabei der zu optimierenden Behandlung der Well-Platten. Die mikroskopische Beurteilung des Zellwachstums bzw. der Zellvitalität wurde 24, 48 und 72 h nach Aussaat der Zellen in die unterschiedlich beschichteten Well-Platten durchgeführt.

Die alpha und beta HEK Zellen in der getrockneten kollagenbeschichteten Well-Platte zeigten von Anfang an ein sehr gutes Wachstum mit einem sehr geringen Anteil toter Zellen (siehe Abbildung 4.4). Das Wachstum der Zellen in den übrigen Well-Platten war im Vergleich dazu verzögert und erreichte erst nach zwei bis drei Tagen die Konfluenz (siehe Tabelle 4.3). Innerhalb einer gleichen Behandlung der Well-Platten gab es zwischen alpha und beta HEK Zellen keine Unterschiede im Wachstumsverhalten.

Ergebnisse

Abb. 4.4: Beta HEK Zellen kultiviert in unterschiedlichen Well-Platten (links mit getrocknetem Kollagen beschichtet, rechts ohne Beschichtung) bei mikroskopischer Prüfung 24 h nach Aussaat (100 fache Vergrößerung)

Tab. 4.3: Beurteilung des Wachstumsverhaltens von alpha und beta HEK Zellen in unterschiedlich behandelten Well-Platten 24, 48 und 72 Stunden nach Aussaat

alpha HEK Zellen beta HEK Zellen

Wachstumsverhalten nach Wachstumsverhalten nach Well-Platte

24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h

unbehandelt ^{+ ++ +++ + ++ +++}

Kollagen, frisch ^{++ ++ +++ ++ ++ +++}

Kollagen, trocken ^{+++ +++ +++ +++ +++ +++}

BSA ^{+ ++ +++ + ++ +++}

Gelatine ^{+ ++ +++ + ++ +++}

+ = geringes Wachstum, ++ = mittleres Wachstum, +++ = starkes Wachstum

Die mikroskopische Beurteilung der Effekte einer unbehandelten bzw. beschichteten Oberfläche in den Well-Platten ergab bei der Anwendung von getrocknetem Kollagen eine deutlich verbesserte Zelladhäsion und als Folge dessen vermehrtes Zellwachstum.

Eine objektive Erfassung des Zellwachstums erfolgte über die indirekte Bestimmung der Lebendzellzahl mittels Alamar-Blue-Messung im Laufe eines durchgeführten Luciferaseassays, d. h. nach 48 h Inkubation. Das Ergebnis der mikroskopischen Untersuchungen konnte bestätigt werden. Die jeweils höchsten Extinktionen (proportional zur Lebendzellzahl) im Bereich von 0,41 und 0,44 wurden in den Wells der alpha und beta HEK Zellen gemessen, die mit getrocknetem Kollagen beschichtet waren (siehe Abbildung 4.5).

+ Kollagen trocken unbeschichtet

Ergebnisse

Abb. 4.5: Extinktionswerte der alpha und beta HEK Zellen in der Alamar-Blue-Messung zur Bestimmung der Lebendzellzahl (proportional zur Extinktion), Effekte einer Kollagen-, BSA- und Gelatinebeschichtung im Vergleich zur unbeschichteten Well-Platte nach 48 h Inkubation (Mw ±s, n = 4)

Die ermittelten Extinktionswerte von alpha und beta HEK Zellen der übrigen Well-Platten waren im Vergleich zur getrockneten Kollagen beschichteten Well-Platte niedriger und schwankten im Bereich zwischen 0,28 bis 0,34 (alpha HEK Zellen) und 0,18 bis 0,40 (siehe Tabelle 4.4). Bei den alpha HEK Zellen konnte der Effekt der Kollagenbehandlung (getrocknet) in Form erhöhter Lebendzellzahl gegenüber den anderen Beschichtungen bzw. der unbeschichteten Well-Platten statistisch abgesichert werden.

Bei den beta HEK Zellen zeigte neben der Beschichtung mit Kollagen die Behandlung mit dem BSA signifikant positive Effekte auf die Zelladhäsion und demzufolge auf das Zellwachstum. Die Verwendung von frischem Kollagen in den Well-Platten für beta HEK Zellen erwies sich hingegen als deutlich ungeeignet; hier wurden die niedrigste Extinktion (0,18) und damit eine unerwünscht geringe Zellzahl gemessen.

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

0,60 ohne Beschichtung Kollagen frisch Kollagen trocken BSA Gelatine

alpha HEK Zellen beta HEK Zellen

Extinktionbei 550 nm

Ergebnisse

Tab. 4.4: Extinktionswerte (Mw ±s) und Streuung der Messwerte (Min, Max) im Rahmen der Lebendzellzahlbestimmung (proportional zur Extinktion) von alpha und beta HEK Zellen kultiviert in unterschiedlich beschichteten Well-Platten nach 48 h Inkubation

alpha HEK Zellen beta HEK Zellen

Well-Platte Mw ±s Min Max Mw ±s Min Max

unbehandelt 0,29 ^ac 0,13 0,02 0,48 0,34 ^a 0,10 0,03 0,63 Kollagen, frisch 0,28 ^c 0,10 0,09 0,50 0,18 ^b 0,06 0,07 0,28 Kollagen, trocken 0,41 ^b 0,11 0,10 0,60 0,44 ^c 0,11 0,13 0,62

BSA 0,34 ^a 0,10 0,11 0,50 0,40 ^ac 0,06 0,32 0,50

Gelatine 0,39 ^a 0,07 0,18 0,50 0,37 ^a 0,09 0,17 0,57

Unterschiedliche Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede innerhalb einer Spalte mit p<0,05

Die Messergebnisse der Lebendzellzahlbestimmung zeigten zum Teil hohe Streuungen.

Hervorzuheben sind hierbei die großen Schwankungen um den Mittelwert bei der Untersuchung von unbehandelten bzw. mit Kollagen (frisch) beschichteten Platten (alpha HEK: bis zu 44,8 % bzw. 35,7 % vom Mittelwert; beta HEK: bis zu 29,4 % bzw. 33,3 % vom Mittelwert).

Bei dem abschließend durchgeführten Luciferaseassay wurde der positive Effekt des getrockneten Kollagens in den Well-Platten nochmals deutlich. Hier waren mit steigender Konzentration von E2 (1 pM bis 1000 pM) sowohl in den alpha als auch in den beta HEK Zellen die numerisch höchsten Induktionsraten feststellbar (alpha HEK 100 pM E2: 8,15; beta HEK 1000 pM E2: 13,4). Die Ergebnisse bei der 10.000 pM E2 Konzentration weichen jedoch von den Beobachtungen der niedrigeren E2 Konzentrationen ab. Die höchsten Induktionsraten wurden in den alpha HEK Zellen der unbeschichteten Platte und in den beta HEK Zellen der mit BSA beschichteten Well-Platten beobachtet. Die oben dargestellten geringen Lebendzellzahlen im Versuchsansatz mit frischer Kollagenbeschichtung der Well-Platten führten zu durchgehend niedrigen Induktionsraten der alpha sowie beta HEK Zellen.

Die Überprüfung der Gleichheit der Varianzen zwischen den unterschiedlichen Behandlungen zeigte, dass die Streuung der Induktionswerte in Gruppen „unbehandelt“ und „Kollagen frisch“ z. T.

deutlich höher war (siehe Abbildung 4.6 und 4.7). Allgemein bestand jedoch ein sehr heterogenes Bild bezüglich der Streuungen. Hervorzuheben war hierbei die z.T deutlich niedrigere Streuung in den Messwerten der Zellen, die auf Well-Platten mit getrocknetem Kollagen kultiviert wurden.

Ergebnisse

ohne Beschichtung Kollagen frisch Kollagen trocken BSA Gelatine

ohne Beschichtung Kollagen frisch Kollagen trocken BSA Gelatine

Abb. 4.6: Dosis-Wirkungskurven für zunehmende E2 Konzentrationen in alpha HEK Zellen, Vergleich der Effekte unterschiedlich behandelter Well-Platten (Mw ±s, n = 4)

Unterschiedliche Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede innerhalb einer E2 Verdünnungsstufe mit p<0,05; Unterschiedliche Symbole kennzeichnen signifikante Unterschiede in der Homogenität der Varianzen zwischen mehreren Gruppen mit p<0,05

Abb. 4.7: Dosis-Wirkungskurven für zunehmende E2 Konzentrationen in beta HEK Zellen, Vergleich der Effekte unterschiedlich behandelter Well-Platten (Mw ±s, n = 4)

Unterschiedliche Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede innerhalb einer E2 Verdünnungsstufe mit p<0,05; Unterschiedliche Symbole kennzeichnen signifikante Unterschiede in der Homogenität der Varianzen zwischen

1 10 100 1000 10.000

ohne Beschichtung Kollagen frisch Kollagen trocken BSA Gelatine

ohne Beschichtung Kollagen frisch Kollagen trocken BSA Gelatine

Ergebnisse

Die positiven Effekte einer Beschichtung mit getrocknetem Kollagen auf die Zelladhäsion und demzufolge auf das Zellwachstum sowie die resultierenden hohen Induktionsraten wurden zum Anlass genommen, diese Verfahren für die weiteren Untersuchungen fortzuführen.