3. Material und Methoden
3.7 Chemisch analytische Verfahren (Teil 1b)
Die Entwicklung eines HPLC-UV Verfahrens zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Phytoestrogenen diente indirekt - als Status einer Prüfmethode für neue Verfahren - zur Optimierung des Reportergenassays. Einen direkten Einfluss auf die Verbesserung des Luciferaseassays hatten die nachfolgenden analytischen Ansätze bezüglich der Probenextrakion.
Diese sollten jedoch im Zuge ihrer Etablierung mit den HPLC-UV Messungen geprüft und validiert werden. Ein bestehendes geeignetes HPLC-UV Verfahrens zum Nachweis von Phytoestrogenen war somit Voraussetzung für die Entwicklung der Extraktionsverfahren. Daher wird die Etablierung der HPLC-Messmethode bereits an dieser Stelle ausführlich dokumentiert und es werden die Ergebnisse von Untersuchungen dargestellt.
Die Methodenentwicklung auf der Grundlage von SETCHELL erfolgte gezielt auf die qualitative und quantitative Bestimmung von den Phytoestrogenen, die in dieser Arbeit schwerpunktmäßig behandelt wurden: den estrogen aktiven Substanzen aus Soja (SETCHELL et al. 2001). Die Kalibrierung des HPLC Systems fand daher mit den Isoflavonen Genistein und Daidzein als vorherrschende Phytoestrogene aus Soja statt. Zunächst wurde die HPLC Anlage mit den glykosidisch gebundenen Isoflavonen Genistin und Daidzin sowie den Aglykonen Genistein und Daidzein kalibriert, die als Stammlösungen vorlagen (siehe 3.3). Im Hinblick auf die Entwickling neuer Extraktionsverfahren von Proben (siehe 3.5.8 und 3.5.9), die eine enzymatische Spaltung der gebundenen Isoflavone für die Messung im Bioassay beinhaltete, wurde der Schwerpunkt jedoch auf die Bestimmung des Gesamtgehalts der freien Isoflavone gelegt (NURMI et al. 2002).
Für die Untersuchung von Probenlösungen wurden diese vor der Messung zunächst für einige Minuten im Ultraschallbad gelöst, ggf. mit Laufmittel B (siehe Tabelle 3.5) verdünnt und anschließend per Injektion durch den Autosampler (SIL-6B Shimadzu) in die HPLC-Anlage gebracht. Diese bestand aus einer Vorsäule (Security Guard, Phenomenex, Aschaffenburg) mit nachgeschalteter C-18 Säule (Luna, 5 µm, 250 x 4,6 mm, Phenomenex, Aschaffenburg) und einem
Material und Methoden
UV-Detektor (Shimadzu SPD-6A). Die chromatographischen Bedingungen sind der Tabelle 3.5 zu entnehmen.
Tab. 3.5: Chromatographische Bedingungen für die qualitative und quantitative Bestimmung der Isoflavone Genistein und Daidzein
Fließmittel A 67 % einer 1 %igen Essigsäure : 33 % Acetonitril Fließmittel B 60 % einer 1 %igen Essigsäure : 40 % Acetonitril
Flussrate 1 ml / min
Injektionsvolumen 100 µl
Säulentemperatur Raumtemperatur
Analysendauer 91 min
Equilibrierung 30 min
Trennsäule C-18-Phase
Detektion UV-Messung 260 nm
Zur Messung der Phytoestrogengehalte wurde eine Gradienten-Elution angewandt. Die gesteuerte Änderung der Zusammensetzung des Eluenten-Gemisches ist der Tabelle 3.6 zu entnehmen.
Tab. 3.6: Gradient für das HPLC-UV Verfahren zur Bestimmung von Genistein und Daidzein
Zeit (min) Fließmittel A
67 % Essigs.(1%ig)/33 % ACN (%)
Fließmittel B
60 % Essigs. (1%ig)/40 % ACN (%)
0,1 0 100
6 0 100
6,1 100 0
75 100 0
75,1 0 100
90 0 100
90,1 Stop Stop
Nach der Messung wurde mittels „Gold Chromatography Software“ (Version V310, Fa. Beckman Instruments) ein Chromatogramm erstellt.
Material und Methoden
Interner Standard
Es musste ein geeigneter interner Standard gefunden werden, der sich zum einen durch gleiche chemische Eigenschaften wie die des zu untersuchenden Stoffes auszeichnet und zum anderen sich im Chromatogramm deutlich von den anderen Referenenzsubstanzen abgrenzt. Es standen das Isoflavon Biochanin A (8,32 µg/ml) und Apigenin (2,7 µg/ml), ein Flavon analog zum Isoflavon Genistein, zur Verfügung. Die Standards wurden im Extraktionsverfahren (siehe 3.5.8) jeweils vor der Extraktion der Probe zugesetzt.
Ergebnis
Trotz Veränderungen in den chromatographischen Bedingungen zeigte sich Apigenin als interner Standard unter den gegebenen apparativen Vorraussetzungen als ungeeignet. Der Peak von Apigenin ließ sich von dem Signal der Referenzsubstanz Genistein im Chromatogramm nicht eindeutig abgrenzen. Biochanin A hingegen wurde als eine der letzten Substanzen von der Säule eluiert und der Peak erscheint deutlich getrennt von den Referenzsubstanzen am Ende des Chromatogramms. Für die weiteren Untersuchunge mittels HPLC wurde daher Biochanin A als interer Standard eingesetzt.
Auswertung
Die Kalibrierung erfolgte mit den Referenzsubstanzen der o.g. Isoflavone sowie Biochanin A. Mit erreichten Bestimmtheitsmaßen von r2 > 0,9999 der Standardkurven wurde die Kalibrierung erfolgreich abgeschlossen. Die Identifizierung der beiden Phytoestrogene erfolgte über den Vergleich von Retentionszeiten mit den zuvor gemessenen Referenzsubstanzen.
Zur quantitativen Bestimmung der einzelnen Substanzen wurde die Peakfläche zugrunde gelegt.
Der Phytoestrogengehalt einer Probe verhält sich dabei proportional zur Fläche des entsprechenden Peaks und ist somit quantitativ zu bestimmen.
Blindwert
Die Bestimmung des Blindwertes erfolgte vor Aufnahme eines neuen Messverfahrens und in regelmäßigen Zeitabständen bei den laufenden Methoden. Die gesamte Probenvorbereitung wurde unter der exakt gleichen Chemikalien und Lösungsmittelmengen mit dem Blindwert (= reines Laufmittel) durchgeführt.
Material und Methoden
Ergebnis
Die Messungen der Blindwerte (n = 5) zeigten keine Kontaminationen der Proben im Verlauf der HPLC-UV Messung.
Reproduzierbarkeit und Wiederfindung
Die Reproduzierbarkeit von Messergebnissen in der HPLC-UV Methode wurde durch die Untersuchung von Proben (reines Laufmittel) bestimmt, denen eine definierte Menge an Referenzsubstanzen (jeweils drei pro Probe) zugesetzt wurde.
Ergebnis
Die gemessenen Gehalte ließen sich auch nach wiederholten Messungen (n = 13) sehr gut reproduzieren (99,2 % bis 99,9 % Wiederfindung der eingesetzten Substanzmenge).
Nachweisgrenzen
Zur Bestimmung der Nachweisgrenzen wurde über einen längeren Zeitraum das typische Basislinienrauschen gemessen. Anschließend wurde die Peakhöhe für eine Substanz gemessen und die Menge an Substanz berechnet, die ein Peak mit der zweifachen Höhe des Basislinienrauschens ergab.
Ergebnis
Es wurden folgende Nachweisgrenzen bestimmt: Genistein 1,63 ng/ml Injektionsvolumen, Daidzein 10,5 ng/ml Injektionsvolumen und Biochanin A 2,8 ng/ml Injektionsvolumen.
Fazit
Die entwickelte HPLC-UV Methode weist eine hohe Selektivität und Spezifität bei der Bestimmung von Isoflavonen auf und wurde im Folgenden zum qualitativen und quantitativen Nachweis der oben genannten Isoflavone im Rahmen der Methodenüberprüfung verwendet.
Zu einem späteren Zeitpunkt - über diese Arbeit hinausgehend - sollte das HPLC-Verfahren immer dann für die Untersuchung von Proben eingesetzt werden, wenn diese im Screening mittels funktioneller Analytik eine erhöhte estrogene Aktivität aufweisen.
Material und Methoden
3.7.2 Entwicklung eines geeigneten Extraktionsverfahrens für Futtermittel
Ausgangspunkt war das Extraktionsverfahren für Futtermittel nach KLUCZKA (2003) mit einer Flüssig-Flüssig-Extraktion auf der Basis von Dichlormethan (Aldrich, Steinheim) als organisches Lösungsmittel (PFANNHAUSER et al. 1994; KLUCZKA 2003). Hierfür wurden 10 g einer Futtermittelprobe mit 10 ml H2O dest. und 40 ml Aceton (Merck, Darmstadt) vermischt und für 12 Stunden auf einem Magnetrührer (Gerhardt, Bonn) gerührt. Nach dem Filtern des Homogenisats erfolgten die Flüssig-Flüssig-Extraktion im Scheidetrichter und das Sammeln der organischen Phase. Diese wurde im Vakuumrotationsverdampfer (Rotavapor R114, Fa. Büschi Schweiz) eingetrocknet und anschließend in 3 ml Aceton aufgenommen. Nach der Lösung des Extraktes im Ultraschallbad (Sonorex TK 30, Bangelin Electronic Berlin) wurde dieser in einer Hochgeschwindigkeitsvakuumzentrifuge (Christ Alpha RVE, Braun Biotech) getrocknet.
Abschließend erfolgte die Lösung des Pellets in 1 ml Methanol (80 % ig, Baker Griesheim) und die Proben wurden bis zur Messung bei 4 °C aufbewahrt.
Grundlage für das neue Extraktionsverfahren war die enzymatische Aufspaltung der glykosidisch gebundenen Phytoestrogene (NURMI et al. 2002). Hierfür wurden 100 mg einer vermahlenen Futtermittelprobe in einem 100 ml – Spitzkolben mit 20 ml Methanol (80 % ig) versetzt und für 30 min in einem Ultraschallbad bei einer Temperatur von 50 °C belassen. Anschließend wurde der Extrakt im Vakuumrotationsverdampfer bei einem Druck von initial 550 millibar bis 30 millibar Endvakuum getrocknet. Der trockene Rückstand wurde in 10 ml Natriumacetat-Puffer (12,31 g Natriumacetat von Applichem in 1 L H2O dest, pH 5) gelöst. Es folgte eine Enzymzulage von 1 mg ß-Glucosidase aus Mandeln (7,55 U/mg, Fluka Steinheim) und 10 mg Glucuronidase aus Helix pomatia (5,2 U/mg, Fluka Steinheim). Die Probe wurde über Nacht im Wasserbad bei 37 °C unter ständigem Schütteln mittels Magnetstäbchen inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte eine Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat (Fluka Steinheim) als organisches Lösungsmittel. Hierfür wurde die Probe in 50 ml Zentrifugengläser überführt und dreimal mit jeweils 10 ml Ethylacetat extrahiert.
Zur Phasentrennung wurde die Probe 5 min bei 3000 g zentrifugiert (Varifuge 3.0, Heraeus Sepatech). Die vereinigten Ethylacetatphasen wurden am Vakuumrotationsverdampfer eingetrocknet, abschließend konnte der Rückstand in 1 ml Methanol (80 % ig) aufgenommen werden. Die Proben wurden bis zur Messung bei 4 °C aufbewahrt.
Material und Methoden
Interner Standard
Den Futtermittelproben, die mit dem HPLC-UV Verfahren gemessen werden sollten, wurde ein interner Standard zugemischt. Der interne Standard wurde vor der Extraktion der Probe zugesetzt.
Als Standard diente Biochanin A (8,32 µg/ml).
Blindwert
Die Bestimmung des Blindwertes erfolgte vor der Aufnahme eines neuen Probenextraktionverfahrens und in regelmäßigen Zeitabständen bei der laufenden Probenextraktion.
Hierzu wurde die gesamte Probenvorbereitung unter Verwendung der exakt gleichen Chemikalien und Lösungsmittelmengen - und für die HPLC-UV Messung unter Zugabe des internen Standards - durchgeführt.
Wiederfindungsrate
Zur Beurteilung möglicher Matrixeffekte der Futtermittel auf die Wiederfindungsrate wurde ein interner Standard in genau definierter Konzentration zur Probeneinwaage gegeben und mit dieser zusammen extrahiert. Anschließend erfolgte die Messung mittels HPLC-UV Verfahren.
Des Weiteren erfolgte die Bestimmung der Wiederfindungsrate anhand der Untersuchung einer natürlich belasteten Probe (Sojaextraktionsschrot). Das Sojaextraktionschrot wurde dabei mit steigenden Anteilen einer unbelasteten Probe (Weizen) vermischt und extrahiert. Die Extrakte aus dieser „Verdünnungsreihe“ wurden mittels HPLC-UV Verfahren untersucht.
3.7.3 Entwicklung eines geeigneten Extraktionsverfahrens für Kolostrumproben
Die Kolostrumproben wurden bis zur Extraktion bei – 20 °C gelagert. Ein Volumen von 2 ml Kolostrum wurde mit 50 µl ß-Glucuronidase aus E.Coli K12 (200 U/ml, Fluka Steinheim) und 50 µl Arylsulfatase aus Helix pomatia (5 U/ml, Fluka Steinheim) für eine Stunde bei 37 °C im Wasserbad unter ständigem Rühren mittels Magnetstäbchen inkubiert (FRANKE u. CUSTER 1996). Anschließend erfolgte eine Proteinfällung mit 2 ml Acetonitril (Fisher Scientific). Das gefällte Protein wurde mittels Zentrifugation (5 min, 2000 g) von der flüssigen Phase getrennt. Die flüssige Phase wurde in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und dreimal mit jeweils 2 ml Ethylacetat extrahiert. Zur Phasentrennung wurde die Probe 5 min bei 2000 g zentrifugiert. Die
Material und Methoden
vereinigten Ethylacetatphasen wurden am Vakuumrotationsverdampfer eingetrocknet, abschließend konnte der Rückstand in 1 ml Methanol (80 % ig) aufgenommen werden. Die Proben wurden bis zur Messung bei 4 °C aufbewahrt.
Interner Standard
Aufgrund der geringen Probenzahl und des geringen Probenvolumens aus der Fütterungsstudie war es nicht möglich, parallel Proben mit einem internen Standard für die HPLC-UV Messung zu versehen, weil diese ansonsten der Messung mittels Luciferaseassay nicht zur Verfügung gestanden hätten.
Blindwert
Die Bestimmung des Blindwertes erfolgte vor der Aufnahme eines neuen Probenextraktionverfahrens und in regelmäßigen Zeitabständen bei der laufenden Probenextraktion.
Hierzu wurde die gesamte Probenvorbereitung unter Verwendung der exakt gleichen Chemikalien und Lösungsmittelmengen - und für die HPLC-UV Messung unter Zugabe des internen Standards - durchgeführt.
Wiederfindungsrate
Die Bestimmung der Wiederfindungsrate gestaltete sich als sehr schwierig. Zum einen waren keine glukuronidierten bzw. sulfatierten Referenzsubstanzen verfügbar und zum anderen standen als natürlich „belastete“ Proben nur die zu untersuchenden aus der Fütterungsstudie (KARALJOV 2006) zur Verfügung. Zur Beurteilung des Extraktionsverfahrens wurde auf die freien Isoflavone Genistein und Daidzein zurückgegriffen, die in genau definierter Konzentration zu Kolostrumproben (unbelastete Probe) gegeben und mit diesen zusammen extrahiert wurden.
Anschließend erfolgte die Messung mittels HPLC-UV Verfahren.
Die weiteren Messungen erfolgten im Zusammenhang mit dem Einsatz des Luciferaseassays (siehe 4.12).
Material und Methoden