Ergebnisse chemisch analytischer Verfahren (Teil 1b)

Folgende Ansatzpunkte im Bereich der analytischen Methoden wurden untersucht, um indirekt (durch verbesserte Probenvorbereitung) eine Optimierung des Reportergenassays zu erreichen.

4.2.1 Entwicklung eines geeigneten Extraktionsverfahren für Futtermittel

Für die Untersuchung eines Futtermittelextraktes mit dem Reportergenassay war es notwendig, zuvor die glykosidisch gebundenen Isoflavone in die freien (= estrogen aktiven) Formen Genistein und Daidzein umzuwandeln. Die Spaltung der Glykoside im Rahmen der Extraktion wurde zum einen nach der bisherigen Methode (KLUCZKA 2003) und zum anderen nach einem neuen Extraktionsverfahren auf Grundlage einer enzymatischen Behandlung durchgeführt. Eine Überprüfung fand durch Messung der Extrakte mittels HPLC-UV Verfahren statt.

Ergebnisse

Spaltung der Glykoside in einem Isoflavonkonzentrat

Als Probe wurde ein pulverisiertes, industriell behandeltes Isoflavonkonzentrat (Novasoy^®) verwendet. Das Genistein-Daidzein-Mengenverhältnis sowie das Vorkommen der aglykonischen bzw. glykosidierten Isoformen entsprachen den natürlichen Verhältnissen in der Sojabohne. Das heißt, die Isoflavone Genistein und Daidzein lagen in einem Verhältnis von 10:8 vor und waren zu 99 % glykosidisch gebunden. Nach Angaben des Herstellers belief sich der Gesamtisoflavongehalt auf mindestens 40 %.

In vier unabhängigen Durchgängen an vier verschiedenen Tagen (Messtage nicht signifikant) wurde das Isoflavonkonzentrat nach den zwei unterschiedlichen Methoden extrahiert. Beim Einsatz des bisherigen Extraktionsverfahrens zeigte die quantitative Bestimmung der freien Isoflavone einen nahezu hundertfach niedrigeren Gesamtgehalt an Genistein und Daidzein (siehe Tabelle 4.9). Der gemessene Gesamtgehalt an Isoflavonen im enzymbehandelten Extrakt von 458,3 g/kg uS entsprach den Angaben des Herstellers.

Tab. 4.9: Gehalte an Genistein und Daidzein (g/kg uS) in einem Isoflavonkonzentrat gemessen mittels HPLC-UV Verfahren; Vergleich einer Extraktion ohne und mit Enzymbehandlung (Mw, Min, Max, n = 4)

Freie Isoflavone Extraktion ohne Enzyme Extraktion mit Enzymen

(g/kg uS) (g/kg uS)

Mw ±s Min Max Mw ±s Min Max

Genistein 1,79 ^a 0,08 1,67 1,85 234,3 ^b 6,15 225,7 240,1 Daidzein 2,71 ^a 0,17 2,57 2,95 224,0 ^b 2,84 219,8 226,4

Gesamtgehalt 4,50 ^a 0,11 - - 458,3 ^b 8,79 - -

Unterschiedliche Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede innerhalb einer Zeile mit p<0,05

Prüfung von Matrixeffekten auf die enzymatische Spaltung der Glykoside

Sojaextraktionsschrot als häufig eingesetzte Komponente in Mischfuttermitteln wurde beispielhaft dafür verwendet, die Matrixeffekte auf die enzymatische Spaltung im Extraktionsverfahren zu untersuchen. Es wurde eine Extraktion nach dem bisherigen Verfahren ohne Enzymeinsatz

Ergebnisse

durchgeführt. Diese Probenlösung wurde mit dem Extrakt des enzymbehandelten Sojaextraktionsschrots verglichen. Die glykosidisch gebundenen Isoflavone Genistin und Daidzin wurden durch die enzymatische Spaltung zu 93,8 % in Aglykone umgewandelt (siehe Abbildung 4.14). Ein Anteil von lediglich 6,2 % verbleibt in der glykosidisch gebundenen Form.

Abb. 4.14: Relation der glykosidisch gebundenen Isoflavone zu den Aglykonen innerhalb eines Extraktes, Vergleich der Extraktion ohne und mit Enzymeinsatz

Blindwert

Bei den Messungen der Blindwerte (= Durchführung der Extraktion ohne Probeneinwaage, n = 5) konnten keine Kontaminationen der Proben im Verlauf des HPLC-UV Verfahrens festgestellt werden. Der Test auf estrogene Aktivität mittels Luciferaseassay zeigte das Gleiche. Alle Blindwerte waren negativ, d. h. eine estrogene Aktivität konnte nicht nachgewiesen werden.

Reproduzierbarkeit

Die Einwaage für das neue Extraktionsverfahren (mit Enzymen) wurde aufgrund der Problematik eines zu konzentrieren Extraktes (10 g Einwaage, KLUCZKA 2003) auf 100 mg Futterprobe reduziert. Trotz der geringen Probeneinwaage konnte eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Messwerte beobachtet werden. Die Untersuchung von zwölf durchgeführten unabhängigen

94,7

6,2 5,3

93,8

0 20 40 60 80 100

ohne Enzyme mit Enzymen

Glykoside Aglykone

% des Gesamtgehalts

Ergebnisse

Einzelextraktionen einer Probe an verschiedenen Tagen ergab Messwerte mit einem sehr geringen Variationskoeffizienten von 7 %.

Wiederfindung

Die Probenmatrix beeinflusste die Wiederfindung des zugesetzten Standards in Futtermitteln. Es wurde eine verringerte durchschnittliche Wiederfindungsrate von 93 % festgestellt (n = 24, Min 70,0 %, Max 117,5 %).

Weiterführende Untersuchungen der Matrixeffekte auf die Quantifizierung von Isoflavonen wurden anhand einer Art „Verdünnungsreihe“ mit Sojaextraktionsschrot durchgeführt. Die gemessenen Gehalte an Genistein und Daidzein korrelierten sehr gut mit den erwarteten Konzentrationen (rein rechnerisch auf Grundlage des Mischungsverhältnisses Soja : Weizen). Die Abweichungen vom Sollwert variierten in einem engen Bereich von 4 % bis 14 %. Allgemein konnte mit zunehmender

„Verdünnung“ des Sojaextraktionsschrotes eine Verringerung der Gehalte an Genistein und Daidzein gemessen werden (siehe Tabelle 4.10).

Tab. 4.10: Gehalte an Genistein und Daidzein (g/kg uS) in zunehmend mit Weizen verdünntem Sojaextraktionsschrot; Vergleich gemessener Wert (Ist) mit errechnetem Wert (Soll)

Genistein (g/kg uS) Daidzein (g/kg uS) Mischungsverhältnis

Soja : Weizen Ist Soll Ist Soll

1 : 0 1,28 - 1,01 -

4 : 1 1,07 1,02 0,89 0,81

1 : 1 0,60 0,64 0,47 0,50

1 : 4 0,22 0,26 0,17 0,20

0 : 1 <0,01 - <0,01 -

Neben einer sehr guten Reproduzierbarkeit und guten Wiederfindung der neuen Extraktionsmethode auf der Grundlage einer enzymatischen Spaltung, erfolgte eine effektive Konversion von glykosidisch gebundenen Isoflavonen in die freien Isoformen. Dieses Verfahren wurde daher für die weiteren Untersuchungen eingesetzt.

Ergebnisse

4.2.2 Entwicklung eines geeigneten Extraktionsverfahrens für Sauenmilch

Für die Untersuchung eines Kolostrumextraktes mit dem Reportergenassay war es notwendig, zuvor die glukuronidierten und sulfatierten Isoflavone in die freien (= estrogen aktiven) Formen Genistein und Daidzein umzuwandeln. Die Spaltung der gebundenen Isoflavone im Rahmen der Extraktion wurde auf Grundlage einer enzymatischen Behandlung durchgeführt und durch anschließende Messung der Extrakte mittels HPLC-UV Verfahren bestimmt.

Wie bereits unter 3.5.8 erwähnt, war es aufgrund fehlender Referenzsubstanzen für die gebunden Isoflavone sowie fehlender natürlicherweise „belasteter“ Proben nicht möglich, die Reproduzierbarkeit und Wiederfindungsraten für glukuronidiertes bzw. sulfatiertes Genistein und Daidzein zu bestimmen.

Um einen Anhaltspunkt über die Substanzverluste, die während einer Extraktion auftreten könnten, zu erhalten, wurde die Wiederfindungsrate von freiem Genistein und Daidzein bestimmt. Die Probenmatrix beeinflusste die Wiederfindung des zugesetzten Standards in den Kolostrumproben.

Es wurde eine verringerte durchschnittliche Wiederfindungsrate von 89 % (n = 4, Min 81 %, Max 97 %).

Für die weiteren Untersuchungen zur Entwicklung eines Extraktionsverfahrens wurde unmittelbar auf die Kolostrumproben aus dem Versuchsvorhaben (KARALJOV, Dissertation in prep.) zurückgegriffen. Die Ergebnisse der HPLC-UV Messungen sowie die Untersuchungen mittels Luciferaseassay werden dementsprechend unter 4.12.3 ausführlich dokumentiert.

Blindwert

Bei den Messungen der Blindwerte (= Durchführung der Extraktion ohne Probeneinwaage, n = 5) konnten keine Kontaminationen der Proben im Verlauf des HPLC-UV Verfahrens festgestellt werden. Der Test auf estrogene Aktivität mittels Luciferaseassay zeigte Gleiches. Alle Blindwerte waren negativ, d. h. eine estrogene Aktivität konnte nicht nachgewiesen werden.

Ergebnisse

-14 -12 -10 -8 -6 -4

0 2