3. Material und Methoden
3.6 Handhabung der Zelllinie und Methoden der Zellkultur (Teil 1a)
3.6.1 Prüfung einer unterschiedlicher Zellkultivierung (48-/96-Well-Platte)
Der unter 3.4.1. beschrieben Luciferaseassay wurde in parallelen Ansätzen mit identischer Substanzaufgabe auf einer 96-Well-Platte und einer 48-Well-Platte (Nunc, Wiesbaden) durchgeführt.
Folgende Veränderungen zu dem oben genannten Verfahren auf einer 96-Well-Platte mussten aufgrund der größeren Bodenfläche pro Vertiefung einer 48-Well-Platte durchgeführt werden:
Nach Zählung wurden die Zellen mit dem Assaymedium derart verdünnt, dass eine Zelldichte von 45.000 Zellen/500 µl Medium pro Vertiefung der Platte erreicht wurde. Die 48-Well-Platten wurden ebenfalls vor der Aussaat der Zellen mit einer 1 % igen Gelatine-Lösung beschichtet. Dafür wurden 500 µl der Gelatine-Lösung auf die Bodenfläche der Vertiefungen gegeben, 30 min bei 37 °C inkubiert und anschließend die Lösung wieder abgesaugt.
Bei der Substanzzugabe musste ebenfalls die Konzentration der Lösungen von 0,1 % eingehalten werden und somit wurden die Probelösungen im Verhältnis 1:10 mit dem Assaymedium verdünnt und anschließend jeweils 5 µl pro Well dem Medium zugegeben.
Estradiol wurde als Referenzstandard eingesetzt, reines Assaymedium ohne Substanzzugabe diente als Negativkontrolle.
3.6.2 Untersuchungen zur Verbesserung der Zelladhäsion mittels Beschichtung
Die Untersuchungen zur Verbesserung der Zelladhäsion erfolgten durch eine unterschiedliche Beschichtung der Bodenoberfläche der Vertiefungen einer Well-Platte. Es wurde gezielt die 24-Well-Platte gewählt, da sie eine bessere Ausprägung der Effekte aufgrund der größeren Bodenoberfläche bot. Das Zellwachstum auf einer unbehandelten und einer mit Gelatine behandelten 24-Well-Platte wurde direkt mit dem Wachstum auf Kollagen-beschichteten (Collagen
Material und Methoden
rat tail, Roche) sowie Serumalbumin-beschichteten (Bovines Serum Albumin, BSA, Sigma-Aldrich, Steinheim) Oberflächen verglichen.
Die 1 % ige Gelatine-Lösung wurde wie unter 3.4.8 beschrieben hergestellt. Ein Volumen von 150 µl wurde in jede Vertiefung pipettiert und gleichdarauf erneut abgesaugt. Es folgte eine Luftrocknung der Platten für ein bis zwei Tage.
Das Kollagen wurde als Gebrauchslösung mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml frisch angesetzt.
Hierfür wurden 10 mg Kollagenlyophilisat in 20 ml einer 0,2 % igen sterilen Essigsäure gelöst und für zwei Stunden stehen gelassen. Anschließend wurde der Boden jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte kurz mit der Lösung bedeckt. Die 24-Well-24-Well-Platten kamen zum einem im frischen Zustand und zum anderen nach ein bis zwei Tagen Lufttrocknung zum Einsatz.
Eine Lösung mit BSA in einer Konzentration von 2 mg/ml wurde ebenfalls frisch hergestellt. Auch hier erfolgte nur kurz ein Bedecken der Bodenflächen einer 24-Well-Platte mit anschließender Lufttrocknung.
Mit der unbehandelten sowie mit den unterschiedlich beschichteten 24-Well-Platten wurden zeitlich parallel Luciferaseassays durchgeführt. Die Aussaat der Zellen wurde entsprechend der vergrößerten Bodenoberfläche angepasst (90.000 Zellen/1 ml pro Well).
Die Beurteilung des Zellwachstums erfolgte zum einen optisch durch Erfassung der Zellmorphologie mittels mikroskopischer Betrachtung und zum anderen durch die indirekte Bestimmung der Lebendzellzahl anhand der Alamar-Blue-Messung (siehe unten).
Die Luciferaseassays wurden mit der Lumineszenzmessung abgeschlossen.
Estradiol wurde als Referenzstandard eingesetzt, reines Assaymedium ohne Substanzzugabe diente als Negativkontrolle.
Alamar-Blue-Messung
Die Bestimmung der Lebendzellzahl erfolgte mit der Alamar-Blue-Messung indirekt über die Bestimmung der mitochondrialen metabolischen Aktivität der Zellen. Hierbei wurde ein wasserlöslicher blauer Farbstoff durch lebende Zellen zu einem roten Endprodukt reduziert (AHMED et al. 1993).
24 Stunden nach Aussaat bzw. nach Substanzzulage wurde das Assaymedium aus den Wells durch Umdrehen der Platten und vorsichtiges Ausklopfen auf einem saugfähigen Papiertuch entfernt. In jede Vertiefung wurden 400 µl der mit frischen Assaymedium 1:10 verdünnten blauen
Alamar-Material und Methoden
Blue-Lösung (laboserv GmbH, Gießen) pipettiert. Nach dreistündiger Inkubation im Brutschrank wurden die 24-Well-Platten bei 550 nm (Referenz 630 nm) photometrisch mit dem Multimodereader (Infinite M200, Tecan, Crailsheim) vermessen.
Nach der Messung konnte die Alamar-Blue-Lösung erneut durch Umdrehen der Platten und vorsichtiges Ausklopfen entfernt und die Lumineszenz-Messung im Rahmen des Luciferaseassays durchgeführt werden.
Für die Messung in anderen Formaten der Well-Platten wurde das eingesetzte Volumen der Alamar-Blue-Lösung entsprechend proportional verringert.
Die Intensität der Farbreaktion (Umschlag von blau nach rot) ist direkt proportional zur Lebendzellzahl.
3.6.3 Effekte unterschiedlicher Konzentrationen des Probenextraktes
Ein Luciferaseassay wurde - wie unter 3.4.1 beschrieben - mit der Gabe von 2 µl 1:10 mit Assaymedium verdünnter Probe zu 200 µl Medium pro Well durchgeführt (siehe Abbildung 3.1).
Abb. 3.1: Verdünnungsschema der Proben bei einem Zulagevolumen von 2 µl (nach KLUCZKA 2003)
Zeitlich parallel wurde ein Assay mit veränderter Substanzzugabe durchgeführt, der ein größeres Ansatzvolumen beinhaltete. Hierbei wurde vorweg die Probe mit Assaymedium auf eine
80 % 8 % ~ 0,08 % MetOH
Konzentration
1:10 ~ 1:100 Verdünnung
80 % 8 % ~ 0,08 % MetOH
Konzentration
1:10 ~ 1:100 Verdünnung
10 µl
90 µl
2 µl
200 µl
Material und Methoden
Endkonzentration von max. 0,1 % gebracht. Das alte Assaymedium wurde abgenommen und die Proben wurden mitsamt dem neuen Mediums auf die Zellen gegeben (siehe Abbildung 3.2).
Abb. 3.2: Verdünnungsschema der Proben bei einem Zulagevolumen von 200 µl (Methode B)
3.6.4 Wirkungen unterschiedlicher CO2-Konzentration auf das Zellwachstum
Es wurde das reine Zellwachstumsverhalten in einer 96-Well-Platte ohne Durchführung eines Luciferaseassays untersucht. Hierfür wurden Zellen - wie unter 3.4.1 beschrieben - in einer Zelldichte von 15.000 Zellen/200 µl Medium pro Vertiefung ausgesät. 24 Stunden nach Aussaat erfolgten die optische Beurteilung des Zellwachstums und die Bestimmung der lebenden Zellen pro Well mittels Alamar-Blue-Messung (siehe 3.5.2). Die Untersuchung der lokal unterschiedlichen CO2-Konzentration wurde zum einen auf den äußeren Bereich und zum anderen auf den inneren Bereich einer 96-Well-Platte festgelegt. Somit erfolgte der Vergleich zwischen den 36 äußeren Wells mit 36 Wells im inneren der Platte.
10 µl
9990 µl
200 µl
80 % 0,08 % 0,08 % MetOH
Konzentration
1:1000 Verdünnung
80 % 0,08 % 0,08 % MetOH
Konzentration
1:1000 Verdünnung
Material und Methoden
3.6.5 Berücksichtigung unterschiedlicher Zellzahlen (~ Proteingehalt)
Nach der Durchführung eines Luciferaseassays mit der Bestimmung der estrogenen Aktivität einer Referenzsubstanz mittels Lumineszenzmessung wurde von derselben Probe in Form des Zelllysats der Proteingehalt bestimmt. Die Analyse des Gesamtproteingehaltes erfolgte nach der Methode von SMITH mit Bicinchoninsäure/Kupfer-(II)-sulfat (SMITH et al. 1985). Als Proteinstandard dienten verschiedene Verdünnungen von BSA (100 bis 20 µg/ml) in PBS. Der Leerwert enthielt 100 µl PBS anstelle der Probe. Zunächst wurden je 100 µl der Standardlösungen bzw. der Proben jeweils als Doppelbestimmung in eine 96-Well-Platte pipettiert. Als Farbreagenz diente die frisch angesetzte Bicinchoninsäure/Kupfer-(II)-sulfat-Lösung (Verhältnis 50:1; Kupfersulfat 4 % [w/v]), die je 100 µl pro Well dazu pipettiert wurde. Zur Beschleunigung der Farbentwicklung wurde die verschlossene 96-Well-Platte für 45 min bei 60 °C erwärmt. Die Messung der Extinktion erfolgte bei 550 nm mittels photometrischer Messung. Die reduzierende Wirkung von Peptidbindungen sowie bestimmten Aminosäurenresten führt zur Umsetzung von Cu2+ Ionen zu einwertigem Kupfer, welches mit der Bicinchoninsäure einen violetten Farbkomplex bildet. Die Tiefe der Färbung ist dem Gehalt an Gesamtprotein direkt proportional.
Die Berechnung der Lumineszenzaktivität in Relation zum Proteingehalt einer Probe erfolgte mit den in dem Programm Excel programmierten Makros.
Material und Methoden