Aus dem Institut für Tierernährung
und dem Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik der Tierärztlichen Hochschule Hannover
___________________________________________________________________________
Untersuchungen zur Optimierung und Nutzung eines Reportergenassays für die Bestimmung östrogener Aktivität in Futtermitteln für Schweine unter besonderer Berücksichtigung
der Phytoöstrogene aus Soja
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Petra Maria Winter
aus Lingen
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.- Prof. Dr. Josef Kamphues
Univ.-Prof. Dr. Heinz Nau
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Josef Kamphues
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Georg von Samson-Himmelstjerna
Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2006
Meiner lieben Familie
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 11
2. Schrifttum... 13
2.1 Hormone... 13
2.1.1 Endogene Estrogene... 14
2.2 Estrogenrezeptoren... 15
2.2.1 Entdeckung der Estrogenrezeptoren... 15
2.2.2 Die funktionellen Domänen der Estrogenrezeptoren α und β... 16
2.2.3 Ablauf der Rezeptoraktivierung ... 18
2.2.4 Bindungsmöglichkeiten an den Estrogenrezeptoren ... 18
2.2.5 Verteilung der Estrogenrezeptoren im Organismus ... 19
2.3 Phytoestrogene ... 20
2.3.1 Definition, historische Entdeckung und Einteilung ... 20
2.3.2 Chemische Struktur und Vorkommen der wichtigsten Phytoestrogene... 22
2.3.3 Phytoestrogengehalte verschiedener Pflanzen und pflanzlicher Produkte... 26
2.4 Struktur-Wirkungsbeziehungen von Phytoestrogenen... 27
2.4.1 Estrogene Wirkungsstärken von Phytoestrogenen... 29
2.4.2 Agonistische und antagonistische Wirkungen von Phytoestrogenen... 30
2.4.3 Kombinationseffekte von Phytoestrogenen ... 30
2.5 Absorption, Metabolisierung und Exkretion von Phytoestrogenen ... 31
2.5.1 Monogastrier ... 32
2.5.2 Besonderheiten beim Wiederkäuer ... 33
2.6 Pharmakokinetik der Phytoestrogene... 34
2.7 Verteilungsmuster der Phytoestrogene im Körper ... 35
2.8 Besonderheiten der Phytoestrogenaufnahme bei Neugeborenen ... 37
2.9 Effekte der Phytoestrogene ... 38
2.9.1 Reproduktionsgeschehen... 38
2.9.2 Krebsentstehung ... 41
2.9.3 Kardiovaskuläres System ... 42
2.9.4 Osteoporose... 43
2.9.5 Immunsystem ... 43
2.10 Analytische Verfahren zur Phytoestrogenbestimmung... 44
2.10.2 Funktionelle Analytik... 45
2.10.3 Chemische Analytik ... 50
3. Material und Methoden ... 52
3.1 Versuchsziel ... 52
3.2 Versuchsaufbau ... 53
3.3 Probennahme... 56
3.4 Allgemeine molekularbiologische und zellbiologische Arbeiten ... 57
3.4.1 Zelllinie: alpha und beta HEK 293... 57
3.4.2 Kultivierung der Zellen ... 57
3.4.3 Beurteilung und Pflege der Zellen ... 58
3.4.4 Subkultivierung der Zellen... 58
3.4.5 Einfrieren und Auftauen von Zellen... 59
3.4.6 Überprüfung der Mykoplasmenfreiheit einer Zellkultur... 60
3.4.7 Lebendzellzahlbestimmung (Zählkammer)... 62
3.4.8 Testung auf estrogene Wirkung mittels Luciferaseassay... 62
3.5 Versuchsdurchführung ... 65
3.6 Handhabung der Zelllinie und Methoden der Zellkultur (Teil 1a)... 65
3.6.1 Prüfung einer unterschiedlicher Zellkultivierung (48-/96-Well-Platte)... 65
3.6.2 Untersuchungen zur Verbesserung der Zelladhäsion mittels Beschichtung .... 65
3.6.3 Effekte unterschiedlicher Konzentrationen des Probenextraktes... 67
3.6.4 Wirkungen unterschiedlicher CO2-Konzentration auf das Zellwachstum ... 68
3.6.5 Berücksichtigung unterschiedlicher Zellzahlen (~ Proteingehalt) ... 69
3.7 Chemisch analytische Verfahren (Teil 1b)... 70
3.7.1 Etablierung eines geeigneten HPLC Verfahrens... 70
3.7.2 Entwicklung eines geeigneten Extraktionsverfahrens für Futtermittel ... 74
3.7.3 Entwicklung eines geeigneten Extraktionsverfahrens für Kolostrumproben... 75
3.8 Einsatz des Reportergenassays (Teil 2)... 77
3.8.1 Kombinationswirkungen von Genistein und Daidzein ... 77
3.8.2 Kombinationswirkungen von Genistein und Daidzein mit Estradiol... 78
3.8.3 Messung der estrogenen Aktivität in Futtermitteln und Kolostrumproben... 79
3.9 Statistik... 80
4. Ergebnisse ... 81
4.1 Ergebnisse methodischer Arbeiten: Zellkulturverfahren (Teil 1a) ... 81
4.1.2 Effekte unterschiedlicher Zellkultivierung (48-Well-Platte/96-Well-Platte)... 82
4.1.3 Verbesserung der Zelladhäsion durch Beschichtung der Well-Platten... 85
4.1.4 Effekte der unterschiedlicher Konzentrationen der Probenextrakte... 90
4.1.5 Effekte unterschiedlicher CO2-Konzentration auf das Zellwachstum ... 93
4.1.6 Berücksichtigung unterschiedlicher Zellzahlen pro Well ... 94
4.2 Ergebnisse chemisch analytischer Verfahren (Teil 1b)... 98
4.2.1 Entwicklung eines geeigneten Extraktionsverfahren für Futtermittel... 98
4.2.2 Entwicklung eines geeigneten Extraktionsverfahrens für Sauenmilch ... 102
4.3 Prüfung des Reportergenassays... 103
4.3.1 Korrelationsbestimmung: Luciferaseaasays und HPLC-UV Verfahren ... 103
4.4 Ergebnisse aus dem Einsatz des Reportergenassays (Teil 2)... 106
4.5 Prüfung einer Kombinationwirkung von Genistein und Daidzein... 106
4.6 Prüfung einer Kombinationswirkung von Phytoestrogenen mit E2... 108
4.6.1 Kombination von Genistein und Daidzein mit E2 (1 nM) ... 108
4.6.2 Kombination von Genistein und Daidzein mit E2 (0,1 nM) ... 112
4.7 Estrogene Aktivität in Futtermitteln und Kolostrumproben ... 115
4.7.1 Futtermittel ... 116
4.7.2 Kolostrum... 118
5. Diskussion ... 123
5.1 Methodenentwicklung... 123
5.1.1 Luciferaseassay ... 123
5.1.2 Beschichtung von Well-Platten... 125
5.1.3 Bedeutung unterschiedlicher Konzentrationen der Probenextrakte ... 126
5.1.4 Berücksichtigung unterschiedlicher Zellzahlen pro Well ... 127
5.1.5 Extraktionsverfahren für Futtermittel und Sauenmilch... 128
5.2 Korrelation der physikalisch-chemisch Analytik mit dem Bioassay ... 130
5.3 Kombinationseffekte von Genistein und Daidzein ... 131
5.4 Gehalte estrogenartig wirkender Substanzen in Futtermitteln für Sauen... 132
5.5 Genistein- und Daidzeingehalte im Kolostrum als Biomarker?... 138
5.6 Schlussfolgerungen und Ausblick... 141
6. Zusammenfassung... 143
Summary ... 145
7. Literaturverzeichnis... 147
Verzeichnis der Abkürzungen
µl Mikroliter
µM mikromolar (10-6)
Ǻ Angström (1/10 Nanometer)
Abb. Abbildung
AF-1 Ligandenunabhängige Aktivierungsfunktion 1 eines Steroidhormonrezeptors
AF-2 Ligandenabhängige Aktivierungsfunktion 2 eines Steroidhormonrezeptors
ATP Adenosin-5´-triphoshat
bp Basenpaare
BSA Bovines Serum Albumin
bzw. beziehungsweise
CALUX Chemical-activated luciferase gene expression
d. h. das heißt
DCC-FKS Dextran choated charcoal treated Fetal calf serum
(mit Dextran beschichteter Aktivkohle behandeltes fetales Kälberserum)
D-MEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleic acid (Desoyribonukleinsäure)
DTT Dithiothreitol
E2 17 ß-Estradiol
EEQ Estradiolequivalente
ER Estrogenrezeptor
ERE Estrogen response element
ER-α Estrogenrezeptor alpha
ER-β Estrogenrezeptor beta
et al. et alii
etc. et cetera
FKS Fetales Kälberserum
g Gramm
GlyGly Glycylglycerin
h hour, Stunde(n)
HDL High density lipoproteins
HEK-293 Human embryonal kidney cells
hsp90 Hitzeschockprotein 90
ICI 182, 780 Estrogenrezeptor-Antagonist
L Liter
LDL Low density lipoproteins
M Molar
Max Maxium
MetOH Methanol
Min Minimum
ml Milliliter
mM millimolar (10-3)
n Anzahl
n.s. statistisch nicht signifikant
nM nanomolar (10-9)
nm Nanometer
OD Optische Dichte
p Signifikanzniveau
PBS Phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösungen)
PCR Polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion)
pH Potentia Hydrogenii
pM pikomolar (10-12)
ppb Parts per billion
ppm Parts per million
r2 Bestimmtheitsmaß
RLU Relative Light Units (relative Lichteinheiten) upm Rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
s Standardabweichung
Sek Sekunden
SERM Selective estrogenrezeptor modulator
Tab. Tabelle
TS Trockensubstanz
U engl. Units (Einheiten)
uS ursprüngliche Substanz
UV Ultraviolettes Licht (100 bis 400 nm)
Well(s) Vertiefungen
ZEA Zearalenon
Anmerkung
In der vorliegenden Arbeit wird in Substanzklassen- und Verbindungsnamen wie „Östrogene“,
„Östradiol“, „Östron“ etc. ein „E“ anstatt „Ö“ verwendet. Diese Schreibweise wird im Klinischen Wörterbuch, Psychrembel (1994) benutzt. Aus Gründen der Einheitlichkeit wird daher auch in Ausdrücken wie „östrogenartig wirksam“, „östrogene Wirkung“ etc. kein Umlaut verwendet.
Einleitung
1. Einleitung
Die Aufnahme von Futtermitteln mit estrogenartiger Wirkung kann Fruchtbarkeitsstörungen hervorrufen, wie es seit mehr als 70 Jahren bekannt ist. Bei Schafen kam es nach der Einfuhr einer neuen Kleesorte (Rotklee Trifolium subterraneum var. Dwalganup) in Australien zu epidemischen Infertilitäten (BENNETTS et al. 1946). Die estrogene Wirkung des Klees war auf den natürlich vorkommenden Inhaltsstoff Formononetin, einem Phytoestrogen und dessen Metaboliten (Daidzein und Equol) zurückzuführen (SHUTT 1976). Eine große wirtschaftliche Bedeutung in der Schweineproduktion fand in den letzten Jahren das potente estrogen wirksame Stoffwechselprodukt von Fusarien, das Mykotoxin Zearalenon. Die Schweine (v. a. Jungsauen) sind besonders empfindlich gegenüber den Wirkungen von Zearalenon; hier kam es nach Aufnahme klinisch relevanter Zearalenongehalte (> 50 µg/kg Futter) zu Störungen wie Anestrus, Unfruchtbarkeit, Pseudogravidität, Gesäugeanbildungen sowie Schwellung und Rötung der Vulva (BÖHM 2000).
Bei der Analyse von Futtermittelproben, die wegen des Verdachts auf eine Mykotoxinkontamination untersucht wurden, konnte aber nur in einem Teil der Proben (43,3 %) Zearalenon nachgewiesen werden (PIETRZAK et al. 2003). Es stellte sich die Frage, ob nicht andere Xenoestrogene ebenfalls an der Auslösung o. g. Fruchtbarkeitsstörungen beteiligt sein könnten. Insbesondere von den Sojabohnen ist ein hoher Isolfavongehalt (v. a. Genistein und Daidzein) bekannt. Wenngleich in der Humanernährung diese Substanzen als positive, sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe in einer präventiven Ernährung angesehen werden und viele Studien einen gesundheitlichen Vorteil bei verschiedenen Erkrankungen wie z. B. Brust- oder Prostatakrebs vermuten lassen, so sind die vielfältigen Wirkungen der Phytoestrogene noch weitestgehend unklar und Gegenstand intensiver Forschungstätigkeiten (BARNES et al. 1990; ARJMANDI et al. 1996).
Sojaprodukte sind in westlichen Industrienationen weit verbreitet und spielen auch in der Kinder- und Säuglingsernährung (nicht nur bei Kuhmilchallergien) eine Rolle. Verglichen mit dem potenten endogenen 17-ß-Estradiol (E2) ist die estrogene Wirkung der Phytoestrogene in der Regel mindestens um den Faktor 100, meist sogar um den Faktor 1000 bis 10.000 geringer (WELSHONS et al. 1990; SONG et al. 1999). Andererseits können Phytoestrogene, die mit der Nahrung aufgenommen werden, im Körper jedoch in 1000 bis 10.000 fach höheren Konzentrationen vorliegen, als in Nahrungsmitteln nachweisbar ist.
Einleitung
In einer Studie von DRANE (1981) wurden Jungsauen untersucht, die 14 Wochen lang ein Mischfutter mit einem Sojaanteil von 20 %, d. h. das Doppelte der praxisüblichen Menge, aufnahmen. Bei diesen Tieren wurden bereits nach fünf Wochen eine signifikante Vergrößerung der Vulva festgestellt; eine Bestimmung des Uterusgewichtes sowie histologische Untersuchung des Reproduktionstrakts nach der Schlachtung ergaben jedoch keine Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe (DRANE et al. 1981). Retrospektive Untersuchungen von Futtermitteln aus Betrieben mit klinisch erkennbarem Hyperestrogenismus bei Sauen bzw. neugeborenen Ferkeln dienten zur weiteren Aufklärung möglicher Zusammenhänge zwischen Fertilitätsstörungen und der Aufnahme von Phytoestrogenen (BITSCH et al. 2001; KLUCZKA 2003). Laut KLUCZKA (2003) wurden in solchen Fällen bis zu 379 µg Estradiolequivalente (EEQ) pro Tier und Tag mit dem Futter aufgenommen. Bei Menschen ist bekannt, dass die kontinuierliche Aufnahme von 1 mg 17-ß-Estradiol pro Tag zu deutlich erkennbaren estrogenen Effekten führt. Geringe Futterprobenzahlen bzw. sehr hohe Standardabweichungen bei den Gehalten in Futtermitteln (problematisch v. a. bei der quantitativen Bestimmung) erlaubten jedoch keine eindeutigen Aussagen zur klinischen Bedeutung der Phytoestrogene in den o. g. Studien.
Mit der vorliegenden Arbeit sollte der in der Studie KLUCZKA (2003) eingesetzte Bioassay optimiert, standardisiert und mittels physikalisch-chemischer Analyse der Hauptisoflavone Genistein und Daidzein validiert werden. Ein weiteres Ziel der Arbeit war es, mit dem verbesserten Assay estrogen aktive Substanzen zu bestimmen. Zunächst sollten Fragen zur Wirkungsweise der Phytoestrogene im Hinblick auf mögliche überadditive Wirkungen der Kombination von Genistein mit Daidzein sowie mit dem endogenen Estradiol geklärt werden. Darüber hinaus wurde die estrogene Aktivität in Mischfuttermitteln für Schweine geprüft (z. T. aus vorberichtlich verdächtigen Fällen mit Fertilitätsstörungen), um die übliche Variation der estrogenen Aktivität einschätzen zu können. Insbesondere interessierte hierbei die Frage, zu welchem Anteil sich die estrogene Aktivität mit der Verwendung von Sojaschrot als Proteinquelle im Mischfutter erklärt.
Des Weiteren wurde untersucht, ob für die Variation der estrogenen Wirkung eine Belastung des Mischfutters mit Zearalenon eine bedeutsame Ursache sein könnte.
Nicht zuletzt sollte geklärt werden, inwieweit sich die Genistein- und Daidzeinkonzentration im Kolostrum „experimentell belasteter“ Sauen als Bioindikator für die Aufnahme erhöhter Mengen an estrogen aktiven Substanzen eignet.
Schrifttum
2. Schrifttum 2.1 Hormone
Ein Hormon (griechisch oρµόη, von horman, hormanus – in Bewegung setzen/anregen) ist ein biochemischer Botenstoff. Hormone steuern über „Anregung“ eine Reihe von Vorgängen der Fortpflanzung, der Entwicklung, des Stoffwechsels und der Verdauung sowie des Wachstums eines Organismus. Hormone werden von speziellen Organen, den sog. „endokrinen Drüsen“, oder in endokrin aktiven Zellgruppen von Organen mit primär anderer Funktion produziert und in den Blutstrom abgegeben (ENGELHARDT u. BREVES 2000). Sie binden an spezifische Bindungsstellen (Rezeptoren) und lösen so biologische Wirkungen aus. Bildung, Transport, Zusammenwirken und Abbau der Hormone werden durch das Hormonsystem reguliert; gesteuert werden diese Prozesse durch den Hypothalamus und die Hypophyse, welche einen Sollwert für die Hormonspiegel aus verschiedenen afferenten Impulsen aus dem ganzen Körper errechnen (DÖCKE 1994). Prinzipiell werden die Hormone in zwei große Gruppen unterteilt, die Peptid- und die Steroidhormone. Letztere werden v. a. in den Gonaden und den Nebennieren aus Cholesterol synthetisiert und besitzen - im Gegensatz zu den Peptidhormonen - mehr oder weniger lipophilen Charakter, was ihnen ein Durchdringen von Zell- und Kernmembranen ermöglicht (siehe Abbildung 2.1) und ihren intrazellulären Wirkmechanismus erklärt (KOOLMAN u. RÖHM 1998).
Abb. 2.1: Wirkmechanismus von Steroidhormonen
lipophiles Hormon
Zielzelle
Hormon- rezeptor
mRNA
Protein Zell-
antwort
Zellkern Cytoplasma
Schrifttum
2.1.1 Endogene Estrogene
Estrogene sind weibliche Sexualhormone, die überwiegend in den Eierstöcken und der Plazenta, daneben aber auch in der Nebennierenrinde und durch Aromatisierung von Androgenen im Fettgewebe sowie auch im Hoden des männlichen Organismus gebildet werden. Sie gehören zur Gruppe der Steroidhormone, dementsprechend entfalten Estrogene ihre Wirkung durch Bindung an nukleäre Rezeptoren (WELSHONS et al. 1984). Es gibt mehr als 20 natürliche Estrogene, die eine gemeinsame chemische Grundstruktur aufweisen (Abb. 2.2). Das Estrogen mit der höchsten hormonellen Aktivität ist 17-ß-Estradiol (Estra-1,3,5[10]-trien-3,17ß-diol). Die aus Estradiol durch Metabolisierung hervorgehenden Verbindungen Estriol und Estron haben eine deutlich schwächere Wirkung als ihre Ausgangsverbindung. Während Estron noch ca. ein Drittel der Estradiolwirkung besitzt, weist der Hauptmetabolit Estriol nur noch ca. ein Zehntel der biologischen Aktivität des Estradiols auf. Die Ausscheidung der drei Substanzen erfolgt nach der Bindung an Glucuron- oder Schwefelsäure in der Leber zum einen über die Galle und zum anderen über den Harn (MUTSCHLER et al. 2001).
H H
OH
H HO
H H
OH
H HO
OH
H H
H HO
O
Estradiol Estriol Estron
Abb. 2.2: Strukturformeln der wichtigsten Estrogene
Als primäre weibliche Geschlechtshormone sind die Estrogene neben dem Eitransport im Eileiter für die Uterusmotilität und die Zusammensetzung des Sekrets in Eileiter und Gebärmutter verantwortlich und bedingen zusammen mit Progesteron den Erhalt der Schwangerschaft bzw.
Trächtigkeit. Des Weiteren bewirken sie die Ausbildung und den Erhalt der weiblichen sekundären Geschlechtsorgane (FORTH et al. 2001). Diese klassisch estrogenregulierten Prozesse sind die Folge einer Interaktion der Hormone mit den Estrogenrezeptoren, die in entsprechend großer Zahl in den Zielorganen wie z. B. Uterus, Ovarien, Vagina und Mamma exprimiert werden. In den o. g.
Organen bewirken Estrogene u. a. eine Zellvergrößerung bzw. Zellvermehrung, die entweder durch
Schrifttum
eine Steigerung der Replikationsrate und/oder durch eine Senkung der Absterberate zustande kommt. Weiterhin sind auch Estrogenwirkungen in „nicht klassischen“ Zielorganen wie dem Gehirn, den Knochen, dem kardiovaskulären System, dem Immunssystem und der Leber zu nennen.
Hier wirken sich Estrogene positiv auf den Plasmacholesterolspiegel aus, indem sie u. a. den HDL- Plasmaspiegel erhöhen und den LDL-Plasmaspiegel senken (LAROSA 1994; TIKKANEN 1996).
Des Weiteren fördern sie die Knochenbildung, erhöhen die Resorption von Calcium, Natrium und Phosphor, bewirken die Wasserretention und erhöhen die Gerinnungsfähigkeit des Blutes. Die Estrogene haben direkte und indirekte Effekte auf Blutgefäße, u. a. durch verstärkte Vasodilatation (FARHAT et al. 1996).
Verschiedene pathologische Prozesse wie degenerative Veränderungen im ZNS (FILLIT et al.
1986), Osteoporose (TURNER et al. 1994) oder Arteriosklerose (HENDERSON et al. 1986;
HENDERSON et al. 1988) werden häufig mit einem Estrogenmangel z. B. in Folge des Klimakteriums in Verbindung gebracht. Andererseits sollen erhöhte Estrogenspiegel die Entstehung und Entwicklung von verschiedenen Tumorerkrankungen wie z. B. der Mamma begünstigen (COLDITZ 1993).
2.2 Estrogenrezeptoren
2.2.1 Entdeckung der Estrogenrezeptoren
In einer Studie wurde beobachtet, dass Estradiol sich zwar im Uterus, der Vagina und der Hypophyse, nicht jedoch in der Lunge oder im Muskelgewebe anreichert (JENSEN u. JACOBSON 1962). Die Autoren vermuteten, dass in den Zielgeweben des Estradiols ein Rezeptor für das Molekül vorhanden sein müsste. Dieses Rezeptorprotein konnte 1966 isoliert werden (TOFT u.
GORSKI 1966; TOFT et al. 1967) und Mitte der 80er Jahre gelang es erstmals, den Estrogenrezeptor (ER) zu „klonen“ (WALTER et al. 1985; GREEN et al. 1986; GREENE et al.
1986). KUIPER isolierte 1996 einen weiteren Estrogenrezeptor aus dem Prostatagewebe von Ratten, den Estrogenrezeptor-beta (ER-β), der später auch aus Mäusen und menschlichem Gewebe gewonnen werden konnte (KUIPER et al. 1996; MOSSELMAN et al. 1996; TREMBLAY et al.
1997). Es folgte die Umbenennung des bisher bekannten Rezeptors in Estrogenrezeptor-alpha (ER- α). Ein dritter Estrogenrezeptor, ER-γ aus dem Fisch Micropogonias undulatus, Sciaenidae wurde
Schrifttum
F E
D C
NH2 A/B COOH
DNA-bindene Domäne
Ligandenbindungsdomäne Antagonisten-
bindungsdomäne
Agonistenbindungs- domäne
Aktivierungsfunktion - 1 Aktivierungsfunktion - 2
2000 isoliert (HAWKINS et al. 2000). Erkenntnisse über die genauen physiologischen Aufgaben des ER-γ sind noch nicht vorhanden; weitere Studien sind hier erforderlich. Untersuchungen mit ER-α/β-knockout-Mäusen ergaben Hinweise auf die mögliche Existenz eines dritten ER auch bei Säugetieren (KARAS et al. 1999).
2.2.2 Die funktionellen Domänen der Estrogenrezeptoren α und β
Bei den Estrogenrezeptoren handelt es sich um nukleäre, ligandengesteuerte Transkriptionsfaktoren.
Als Transkriptionsfaktor bezeichnet man ein Regulatorprotein, welches die Transkription von Genen beeinflusst. Die Estrogenrezeptoren sind in der Zelle unterschiedlich lokalisiert. Sie können sowohl in der aktiven als auch in der inaktiven Form im Zellkern vorkommen oder unterliegen einer ligandabhängigen Translokation vom Cytoplasma in den Zellkern (BARRACLOUGH et al. 1986;
EISSA et al. 1997; MATSUMURA et al. 2005).
ER-α und ER-β lassen sich in bestimmte Domänen unterteilen (siehe Abbildung 2.3), die für die Ligandenbindung, die DNA-Bindung und die Aktivierung der Transkription verantwortlich sind.
Insgesamt werden sechs funktionelle Domänen, die Domänen A bis F, unterschieden (OGAWA et al. 1998).
Abb. 2.3: Schematische Darstellung der Struktur nukleärer Rezeptoren
Schrifttum
Während der menschliche ER-α aus 595 Aminosäuren besteht, besitzt ER-ß hingegen nur 530 Aminosäuren (OGAWA et al. 1998; DECHERING et al. 2000). Die N-terminale Region A/B besitzt nur eine Übereinstimmung von 30 % bezüglich der Länge und der Aminosäurensequenz der beiden ER. Diese Region ist in der gesamten Familie der Steroidhormonrezeptoren variabel. Sie ist Sitz der ligandenunabhängigen Aktivierungsfunktion-1 (AF-1), die für eine gen- und zellspezifische Aktivierung sorgt (PETERSEN et al. 1998). Hierfür tritt sie mit dem Präinitiationskomplex der Transkription oder mit Koaktivatoren in Wechselwirkung (WEIGEL u. ZHANG 1998; KUIPER et al. 1999). Dieser Bereich wird durch Phosphorylierung reguliert und ist unabhängig von der Aktivierungsfunktion-2 (BRZOZOWSKI et al. 1997). Die AF-1 wird für die partiell agonistische Wirkung der selektiven Estrogenrezeptor-Modulatoren (SERM) verantwortlich gemacht (HALL u.
MC DONNELL 1999).
Die zentral gelegene DNA-Bindungsdomäne (Region C des Rezeptors) weist eine 95 % ige Homologie von ER-α und ER-β auf und lässt sich in zwei Bereiche einteilen (PFAHL et al. 1994).
In jedem Bereich ist ein Zn2+- Ion tetraedisch von vier Cysteinresten umgeben. Einer dieser
„Zinkfinger“ ist für die spezifische Interaktion des Rezeptors mit der DNA verantwortlich, indem er bestimmte DNA-Sequenzen innerhalb der Promotoren der estrogenabhängigen Zielgene, den
„estrogen response elements“ (ERE), erkennt. Der andere „Zinkfinger“ stabilisiert diese Bindung durch Wechselwirkung mit dem „Phosphatrückgrat“ der DNA (GREEN u. CHAMBON 1988). Die Kombination der Region C des Rezeptors mit der Domäne D ermöglicht eine Rezeptor- dimerisierung (EVANS 1988; LUISI et al. 1991). Die kurze Domäne D ist dabei aufgrund ihrer hohen Flexibilität in ihrer räumlichen Struktur sehr variabel (ENMARK et al. 1997).
Die Ligandenbindungsdomäne (Domäne E) ist im C-Terminus des Rezeptors lokalisiert und wird für Steroidhormone auch als zell- und promotorspezifische ligandenabhängige Aktivierungs- funktion-2 (AF-2) bezeichnet. Neben den Aktivierungsfunktionen enthält die Domäne E auch eine Dimerisierungsregion und eine Bindungsstelle für das Hitze-Schock-Protein 90 (Heat shock protein 90, hsp90; WEBSTER et al. 1988; GRONEMEYER 1991). Sie besteht bei den Steroidrezeptoren aus 12 Alpha-Helices und zwei Beta-Ketten. Kommt es zur Bindung des spezifischen Hormons, dann drehen sich die Beta-Helices um 90° und der Hormonrezeptor verändert seine Struktur. Für die C-terminale Domäne F des Rezeptors konnte bislang noch keine eindeutige Funktion nachgewiesen werden, es wurde lediglich eine modulatorische Transkriptionsaktivierung bei ER-α vermutet (TSAI u. O'MALLEY 1994; MONTANO et al. 1995).
Schrifttum
2.2.3 Ablauf der Rezeptoraktivierung
In Abwesenheit eines Liganden liegen die Estrogenrezeptoren in inaktiver Form im Zellkern vor und sind durch die Assoziation mit dem hsp90 charakterisiert (ONATE et al. 1998). Die Bindung eines Liganden erfolgt nach dessen Durchqueren der Zellmembran und einer passiven Diffusion durch eine Kernpore in den Zellkern. Der Ligand lagert sich dabei in die hydrophobe Bindungstasche des Rezeptors ein und verursacht eine Konformationsänderung des Rezeptorproteins. Als Folge spaltet sich hsp90 ab, und es kommt zur Phosphorylierung des Rezeptors (KLINGE et al. 1997). Somit erhöht sich durch die Ligandenbindung der basale Phosphorylisierungsgrad des Rezeptors auf das Drei- bis Vierfache, wodurch sich wiederum die Transaktivierungsstärke und die Affinität zu bestimmten DNA-Sequenzen erhöht (LE GOFF et al.
1994).
Der Konformationswechsel des ER ermöglicht die Bildung eines Homodimers wie z. B. ER-α mit ER-α oder ER-β mit ER-β bzw. Heterodimers wie z. B. ER-α mit ER-β (KUMAR u. CHAMBON 1988; TSAI u. O'MALLEY 1994; CRITCHLEY et al. 2001). Mit der Dimerisierung ist die Voraussetzung zur Bindung des Ligand-Rezeptor-Komplexes an das „estrogen response element“
(ERE) auf der DNA geschaffen. Ein solches befindet sich in der Promotorregion eines von ihm kontrollierten Genes, eines Targetgens. Über ein ERE reguliert der Rezeptor somit die Transkription seiner Zielgene, die eine Proteinsynthese z. B. von Enzymen bedingt (GRONEMEYER 1991; PAECH et al. 1997).
Die AF-1-Region eines Rezeptors variiert in Größe und Aminosäurensequenz und ist von Gewebe zu Gewebe unterschiedlich. Jede Art eines Liganden, ein Agonist, partieller Agonist oder SERM, führt zu einer charakteristischen Konformation im Bereich dieser AF-1. Dieses erklärt zum Teil die gewebespezifischen Reaktionen der Estrogenrezeptoren auf Hormone (HUBBARD et al. 2000).
2.2.4 Bindungsmöglichkeiten an den Estrogenrezeptoren
17-ß-Estradiol ist das potenteste hormonell wirksame Estrogen. Strukturelle Voraussetzung für die Ligand-Rezeptor-Komplexbildung ist ein phenolischer Ring mit speziell positionierten OH - Gruppen. Bei der Bindung an einen Estrogenrezeptor bildet das Steroid Wasserstoffbrücken
Schrifttum
zu den basischen Aminosäuren Histidin und Arginin, zu der OH - Gruppe der Glutaminsäure sowie zu Wassermolekülen des Rezeptorproteins aus. Aufgrund der Unspezifität von Wasserstoffbrücken und der Größe der Rezeptortasche, die mit 450 Å fast doppelt so groß ist wie das Molekülvolumen von 17-ß-Estradiol (245 Å), können statt der eigentlichen Substrate auch viele andere Substanzen an den Estrogenrezeptor binden und eine agonistische oder antagonistische Wirkung hervorrufen (BRZOZOWSKI et al. 1997). Bei einer agonistischen Wirkung löst das „Andocken“ des Substrats an den Rezeptor nach Dimerisierung und Bindung an das ERE eine Genantwort aus; bei einer antagonistischen Wirkung wird der Rezeptor durch die Bindung des Substrates deaktiviert, so dass dann keine Dimerisierung und Bindung an DNA-Sequenzen mehr stattfinden kann. Der Rezeptor ist blockiert und kann nicht durch ein natürliches Substrat aktiviert werden (KOOLMAN u. RÖHM 1998).
2.2.5 Verteilung der Estrogenrezeptoren im Organismus
Die oben genannten charakteristischen Konformationen spezieller Bereiche (AF-1) des ER, die je nach Ligand variieren, erklären nur zum Teil die gewebsspezifischen Reaktionen von Hormonen. In diesem Zusammenhang ist v. a. die unterschiedliche Lokalisation von ER-α und ER-β in bestimmten Organen bzw. Gewebetypen zu berücksichtigen (BRANDENBERGER et al. 1997;
MATSUZAKI et al. 1999). Im menschlichen Organismus liegt ein spezifisches Verteilungsmuster vor; wobei ein Rezeptor häufig sehr stark in seiner Expression überwiegt (Tab. 2.1). Erkenntnisse über ein Verteilungsmuster der Rezeptoren im tierischen Organismus stehen größtenteils noch aus bzw. sind für Nagetiere wie Ratte und Maus bereits vorhanden. Das Verteilungsmuster der Estrogenrezeptoren in Ratte und Maus zeigt vereinzelt Abweichungen von dem im menschlichen Organismus: Allgemein ist jedoch festzustellen, dass der ER-α vor allem in Fortpflanzungsorganen und in Brustgewebe lokalisiert ist, während der ER-β vorwiegend im Knochengewebe, im Herzkreislaufsystem und im Gehirn zu finden ist.
Schrifttum
Tab. 2.1: Verteilungsmuster von ER-α und ER-β im menschlichen Organismus
Organ / Gewebe ER-α ER-β Quellen/Autoren
Niere + (+) TANAKA et al. 2003
Nebenniere + - MONTANARO et al. 2005
Brustdrüse + (+) CHANG et al. 2006
Leber + - IAVARONE et al. 2003
Uterus + (+) CRITCHLEY et al. 2001
Ovarien + + VASKIVUO et al. 2005
ZNS (Hypophyse) + (+) TORAN-ALLERAND 2005
Gefäßsystem (+) + NAKAMURA et al. 2004
Knochen (+) + SAXON u. TURNER 2005
Lunge - + SCHWARTZ et al. 2005
Harnblase - + SAUNDERS et al. 2001
Prostata (+) + TORLAKOVIC et al. 2005
2.3 Phytoestrogene
2.3.1 Definition, historische Entdeckung und Einteilung
Einige natürlich vorkommende Pflanzeninhaltsstoffe besitzen estrogene Wirkung und werden daher allgemein „Phytoestrogene“ genannt. Phytoestrogene wirken im Körper ähnlich wie das weibliche Sexualhormon 17-ß-Estradiol. Das Scientific Committee on Food (SCF) in Großbritannien definiert Phytoestrogene als jene Pflanzeninhaltsstoffe bzw. Metaboliten, die durch Beeinflussung einzelner oder verschiedener, hormongesteuerter Signalwege (in der Regel durch Bindung an den Estrogenrezeptor) die Wirkung des endogenen weiblichen Sexualhormons 17-ß-Estradiol nachahmen oder blockieren (COMMITTEE ON TOXICITY OF CHEMICALS IN FOOD 2003).
Die fruchtbarkeitsmodulierende Wirkung von bestimmten Pflanzen ist schon seit Jahrhunderten bekannt. In historischen Überlieferungen wird vom Einsatz bestimmter Pflanzen mit estrogener Wirkung zur Steigerung der Fruchtbarkeit (PRICE u. FENWICK 1985) bzw. zur Minderung der Libido bei Mönchen im Mittelalter (FUHRMANN 1992) berichtet. Die estrogene Wirkung von Pflanzenextrakten wurde erstmals 1926 genauer untersucht und wissenschaftlich bestätigt (LOEWE et al. 1927). Phytoestrogene erlangten 1940 eine enorme biologische und ökonomische Bedeutung, als es in Australien und Neuseeland zu epidemischem Auftreten von Fertilitätsstörungen bei Schafen kam. Die betroffenen weiblichen Tiere grasten auf Weiden mit einer neu eingeführten
Schrifttum
Kleesorte (Trifolium subterraneum var. Dwalganup). Diese später als „Clover disease“ bezeichnete Erkrankung war auf den erhöhten Gehalt an Phytoestrogenen im Klee zurückzuführen (BENNETTS et al. 1946). Bis 1975 wurden bereits mehrere hundert Pflanzen bzw. Pflanzeninhaltsstoffe als im Bioassay estrogen aktiv beschrieben (FARNSWORTH et al. 1975).
Die genaue biologische Bedeutung dieser Substanzen für die Pflanze ist bis heute weitgehend unbekannt. In der Literatur gibt es Hinweise, dass die Phytoestrogene unter anderem als Schutz vor Pilzbefall dienen (NAIM et al. 1974), antibakterielle und antivirale Eigenschaften besitzen (MAZUR u. ADLERCREUTZ 1998; SETCHELL u. CASSIDY 1999), als Pigmente eine Rolle spielen (CLEVENGER 1964) oder lediglich als eine Vorstufe zur Verholzung von Pflanzenteilen vorkommen (FRANCIS u. HUME 1971). Des Weiteren wird spekuliert, dass die Pflanzen diese Stoffe im Laufe der Evolution zur Abwehr von Pflanzenfressern entwickelt haben, um deren Reproduktionsfähigkeit über eine Beeinflussung des Hormonsystems einzuschränken (HUGHES 1988).
Die Mehrheit der Phytoestrogene gehört einer großen Gruppe diphenolischer Verbindungen mit Strukturähnlichkeit zu natürlichen und künstlichen Estrogenen an, den Flavonoiden (KURZER u.
XU 1997). Flavonoide kommen in vielen Pflanzen vor und können bis zu 7 % der Trockenmasse dieser Pflanzen ausmachen (KUHNAU 1976). In der Gruppe der Flavonoide wird eine Vielzahl von chemischen Klassen unterschieden, wobei sich die Isoflavone, Coumestane und Prenylflavonoide durch eine hohe estrogene Aktivität auszeichnen (ADLERCREUTZ 1998; IBARRETA et al. 2001).
Daneben gibt es die Klasse der Lignane, die zur Gruppe der Nicht–Flavonoide gehören und die ebenfalls estrogene Wirkungen besitzen (ADLERCREUTZ 1998). In der Abbildung 2.4 ist ein Ausschnitt über die Einteilung der Phytoestrogene in Gruppen und Klassen dargestellt.
Schrifttum
Abb. 2.4: Übersicht über die wichtigsten Gruppen und Klassen von Phytoestrogenen; Komponente in Klammern ist ein estrogen aktiver Metabolit
2.3.2 Chemische Struktur und Vorkommen der wichtigsten Phytoestrogene
Isoflavone
Die Hauptvertreter der Isoflavone sind Genistein, Daidzein und Glycitein. Sie kommen überwiegend in der Familie der Schmetterlingsblütler (Fabaceae) und hier vor allem bei den Leguminosen vor. Besonders hohe Gehalte besitzt die Sojabohne, welche die drei oben genannten Isoflavone Genistein, Daidzein und Glycitein etwa im Verhältnis 10 : 8 : 1 enthält (BINGHAM et al. 1998). Formononetin und Biochanin A sind Derivate von Genistein und Daidzein mit einer zusätzlichen Methylgruppe (-CH3) in der chemischen Struktur. Sie kommen nur in geringen Mengen in Pflanzen vor und sind vor allem in Rotklee, Klee- und Luzernesprossen zu finden (siehe Tabelle 2.2).
Isoflavone unterscheiden sich als 3-Phenylchromonderivate von den in der Pflanzenwelt weit verbreiteten Flavonen nur durch die Position der Verknüpfung von Chromon- und Phenylring (siehe Abbildung 2.5).
Phytoestrogene
Flavonoide Nicht - Flavonoide Isoflavone
Coumestane
Prenylflavonoide
Lignane
Genistein Daidzein Glycitein
Coumestrol
8-Prenylnarigenin 6-Prenylnarigenin
Matairesinol (Enterolacton)
Phytoestrogene
Flavonoide Nicht - Flavonoide Isoflavone
Coumestane
Prenylflavonoide
Lignane
Genistein Daidzein Glycitein
Coumestrol
8-Prenylnarigenin 6-Prenylnarigenin
Matairesinol (Enterolacton)
Phytoestrogene
Flavonoide Nicht - Flavonoide Isoflavone
Coumestane
Prenylflavonoide
Lignane
Genistein Daidzein Glycitein
Coumestrol
8-Prenylnarigenin 6-Prenylnarigenin
Matairesinol (Enterolacton)
Schrifttum
R1 R2 R3
Daidzein -OH -H -H
Genistein -OH -OH -H
Glycitein -OH -H -OCH3
Formononetin -OCH3 -H -H Biochanin A -OCH3 -OH -H O
O R1
OH
R2
R3
Abb. 2.5: Strukturformel der wichtigsten Isoflavone-Aglykone
Isoflavone liegen in der Pflanze meist als Zuckerkonjugate vor. Die Glykosyl-Gruppe ist durch eine Veresterung an dem 7-C-Atom mit dem Isoflavon konjugiert. Darüber hinaus ist der Zucker häufig mit einer Acetyl- oder Malonylgruppe verestert. In der Sojabohne dominieren die 6’’-O-Malonyl-7- ß-Glykoside (BINGHAM et al. 1998). Diese sind jedoch hitzelabil, so dass in wärmebehandelten Produkten, beispielsweise gerösteten Sojabohnen, die 6’’-0-Acetyl-7-ß-Glykoside und vor allem die 7-ß-Glykoside zu finden sind. Demgegenüber überwiegen in fermentierten Sojaprodukten die Aglykone, weil hier der Zuckerrest durch die zur Fermentation eingesetzten Mikroorganismen enzymatisch abgespalten wird (KULLING u. WATZL 2003).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Isoflavone in vier Formen auftreten können:
- Aglykone: Daidzein, Genistein, Glycitein, Formononetin und Biochanin A - Glykoside: Daidzin, Genistin, Glycitin, Ononin und Sissotrin
- Acetylglykoside: 6’’-Acetyldaidzin, 6’’Acetylgenistin und 6’’Acetylglycitin - Malonylglykoside: 6’’Malonyldaizin, 6’’Malonylgenistin und 6’’Malonylglycitin
Coumestane
Die Coumestane, zu deren wichtigsten Vertretern Coumestrol und 4´-Methylcoumestrol gehören, sind bis zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht hinreichend untersucht. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu den Isoflavonen weisen sie gleiche physikalische und chemische Eigenschaften auf (siehe Abbildung 2.6; HUMFREY 1998). Sie sind überwiegend in Luzerne und diversen Kleearten zu finden (MIKSICEK 1993b) und in geringerer Konzentration in Sojasprossen (REINLI u.
BLOCK 1996).
Schrifttum
R
Coumestrol -H
4´-Methoxycoumestrol -OCH3
O
O
O O
H
R
Abb. 2.6: Strukturformel der wichtigsten Coumestane
Prenylflavonoide
MILLIGAN entdeckte 1999 estrogen aktive Substanzen im Hopfen, die sich im Vergleich zu den bislang untersuchten Phytoestrogenen als um ein Vielfaches potenter erwiesen. Er identifizierte diese als 8-Prenylnaringenin (8-PN), 6-Prenylnaringenin, Xanthohumol und Isoxanthohumol (MILLIGAN et al. 1999). Die Pflanzeninhaltsstoffe zeigten strukturelle Ähnlichkeiten zu den Isoflavonen (siehe Abbildung 2.7), jedoch war eine Prenylgruppe substituiert und der Phenolring räumlich in eine andere Richtung orientiert (KITAOKA et al. 1998). Das wichtigste und zugleich wirksamste Prenylflavonoid ist 8-PN und stammt aus den weiblichen Blüten des Hopfens, die zur Geschmacksverbesserung und Haltbarmachung des Bieres genutzt werden (siehe Tabelle 2.2).
O O
H
OH
OH
C H3 CH3
Box A = Phenolring Box B = Prenylgruppe
Abb. 2.7: Strukturformel von 8-Prenylnaringenin
Lignane
Die Gruppe der Lignane umfasst Klassen von Phytoestrogenen, die wie Isoflavone ein diphenolisches Ringsystem besitzen, aber - wie Abbildung 2.8 zeigt - als Grundgerüst zwei Phenylpropan-Einheiten besitzen (MAZUR u. ADLERCREUTZ 1998). Im Gegensatz zu
A
B
Schrifttum
Isoflavone und Coumestane sind Lignane in Pflanzen bzw. in pflanzlichen Produkten weit verbreitet (siehe Tabelle 2.2), wobei verschiedene Getreidearten, Ölsaaten und andere faserreiche Pflanzenkomponenten die Hauptquellen darstellen (MORTON et al. 1997). Die wichtigsten Vertreter aus der Gruppe der Lignane sind Secoisolariciresinol und Matairesinol. Sie können in der Pflanze bzw. in pflanzlichen Produkten als Aglykone oder als Mono- und Diglykoside vorliegen (ADLERCREUTZ et al. 1995; TOU et al. 1998).
Strukturelement
O
O H
CH3
OH OH
OH
CH3
Abb. 2.8: Strukturformel des wichtigsten Lignans: Secoisolariciresinol
Über die estrogene Potenz dieser Pflanzeninhaltsstoffe ist noch wenig bekannt, aber es wird angenommen, dass die Lignane ihrerseits keine estrogene Wirkung haben, sondern erst durch die Magen-Darmflora in schwach estrogen aktive Komponenten wie Enterolakton und Enterodiol metabolisiert werden (SETCHELL u. ADLERCREUTZ 1988).
Tab. 2.2: Quellen von Phytoestrogenen in Pflanzen bzw. pflanzlichen Produkten*
Isoflavone Coumestane Prenyl-
flavonoide
Lignane
Leguminosen Sojaprodukte Sprossen Futter- pflanze
Pflanze Samen, Obst, Gemüse
Getreide
Sojabohne Sojamehl Alfalfa Klee Hopfen Leinsamen Weizen
Linse Sojabohne Weizen-
keime Bohnen
Sojaprotein-
konzentrat Sonnen-
blumenkerne
Gerste
Kichererbse Möhren Roggen
Ölfrüchte Hafer
Apfel Reis
Birne Mais
Kirsche Hopfen
* MURKIES et al. 1998
Schrifttum
2.3.3 Phytoestrogengehalte verschiedener Pflanzen und pflanzlicher Produkte
Lange Zeit gab es kaum detaillierte Informationen über die Gehalte von Phytoestrogenen in den verschiedenen Pflanzen und pflanzlichen Produkten, da geeignete analytische Methoden fehlten.
Bis heute gibt es aufgrund der komplizierten Extraktion und Grenzen in der Analytik häufig nur Angaben über Gesamtgehalte von Aglykonen (REINLI u. BLOCK 1996).
Die Gehalte an Phytoestrogenen variieren sehr stark in Abhängigkeit von der Pflanzenspezies und dem Pflanzenstamm, der geographischen Lokalisation sowie dem Erntejahr und Erntezeitpunkt (ELDRIGE u. KWOLEK 1983; WANG u. MURPHY 1994). Die Konzentration an Isoflavonen in 14 verschiedenen Sojabohnen kann z. B. dabei zwischen „nicht nachweisbar“ und Gehalten in g/kg-Bereichen liegen (FRANKE et al. 1995).
Des Weiteren beeinflussen auch Verarbeitungsprozesse der Pflanze bzw. der pflanzlichen Produkte die Konzentration an Phytoestrogenen. Der Gehalt an Genistein und Daidzein (gemessen in der Trockenmasse) in der ursprünglichen, unbehandelten Sojabohne bleibt in Sojaprodukten wie Sojamehl oder Sojapulver nahezu konstant. Ein Verlust durch Entfettung findet nicht statt (ELDRIGE u. KWOLEK 1983). Zu einer Reduzierung des Gehaltes an Phytoestrogenen gegenüber dem Ausgangsprodukt Sojabohne kommt es jedoch z. B. während der Herstellung von Soja- Protein-Konzentraten oder Soja-Protein-Isolaten aufgrund von Waschschritten, Extraktions- prozessen und der Fällung durch Säure (WANG et al. 1998).
Eine Übersicht über gemessene Gehalte an Phytoestrogenen in verschiedenen Pflanzen und pflanzlichen Produkten wird in der Tabelle 2.3 gegeben. Soja stellt die Hauptquelle für Phytoestrogene dar (BINGHAM et al. 1998; MAZUR u. ADLERCREUTZ 1998). Produkte auf Sojabasis zeigen die höchsten Gehalte an Isoflavonen mit bis zu 2 g/100 g ursprünglicher Substanz.
Alle anderen Quellen wie Getreide, Obst und Gemüse enthalten nur sehr wenig Isoflavone (LIGGINS et al. 2000a, b). Weitere Phytoestrogene können in höherer Konzentration in Klee und Luzerne (Coumestrol) sowie Getreide und Samen (Lignane) vorliegen (FRANKE et al. 1995;
MORTON et al. 1997; BINGHAM et al. 1998).
Schrifttum
Tab. 2.3: Gesamtgehalte von Phytoestrogenen in mg/100 g ursprünglicher Substanz in verschiedenen Pflanzen und pflanzlichen Produkten (- = keine Anlaysendaten vorhanden, 0 = Gehalt entspricht 0 mg/100 g uS)
Isoflavone mg/100 g uS
Coumestrol mg/100 g uS
Lignane mg/100 g uS
Sojabohnena,b 14 - 238 0,05 0,01 - 0,27
Sojamehla,b 131 - 198 0 0 - 0,15
Sojaproteinkonzentratc 12 - 102 - -
Samen: Sonnenblume, Klee, Alfalfaa,d 0,01 - 0,60 0 0,0 - 0,6
Sojaöla 0 - -
Leinsamene - - 60 - 370
Früchte b,e: z. B. Äpfel, Birnen, etc. < 0,1 - 0,1
Alfalfaa - 4,7 -
Kleed,f 3,07 28,1 -
Sojasprosseng 44,1 - 53,0 0,9 - 1,2 -
Getreideh,e: Roggenschrot 0 - 0,11 - 0,50 Weizenschrot in Spuren - 0,008
Gerstenschrot 0,02 - 0,058
Haferschrot 0 - 0,013
Mais 0 - 0,008
Naturreis 0 - 0,3
a UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE 2002 bMAZUR u. ADLERCREUTZ 1998 cLIGGINS et al.
2002 dMAZUR et al. 1996 eLIGGINS et al. 2000a fFRANKE et al. 1994 gWANG et al. 1990 hMAZUR 1998
2.4 Struktur-Wirkungsbeziehungen von Phytoestrogenen
Aufgrund der flexiblen Ligandenbindungsdomäne des Estrogenrezeptors können neben dem 17-ß- Estradiol eine Reihe anderer Substanzen an den Estrogenrezeptor binden und eine agonistische oder antagonistische Wirkung auslösen (siehe Kapitel 2.2). Eine wichtige Voraussetzung für die Ligand-
Schrifttum
Rezeptor-Komplexbildung ist die Strukturähnlichkeit zum Estradiol (siehe Abbildung 2.9), wie sie bei den Phytoestrogenen gegeben ist (BRZOZOWSKI et al. 1997; BLAIR et al. 2000; FANG et al.
2001). Selbst Phytoestrogene mit Substituenten wie z. B. die Alkyl-Gruppe des 8-PN können an den Estrogenrezeptor binden (MILLIGAN et al. 2000). Wichtig für eine Bindung ist die Position der Hydroxylgruppen im Molekül. Der Abstand der 4´- und 7´-OH-Gruppen, der beim Estradiol ca. 10,8 Å beträgt, entspricht bei Genistein und Daidzein jeweils ca. 12,0 Å.
Abb. 2.9: Darstellung der Strukturähnlichkeit diphenolischer Phytoestrogene zum 17-ß-Estradiol
Des Weiteren hat die Anzahl der Hydroxylgruppen einen großen Einfluss auf die Bindung an den Estrogenrezeptor. Es sind hydrophobe Interaktionen mit der Ligandentasche notwendig, die durch eine tetrazyklische Anordnung des Steroidgerüstes als hydrophobes Element gegeben ist. Eine sterische Anordnung von Substituenten, die von der Anordnung der Substituenten vom Estradiol abweicht, führt im Allgemeinen zu einer schlechteren Bindung an den Estrogenrezeptor (MIKSICEK 1993a, 1995; BREINHOLT u. LARSEN 1998). Die Affinität der Phytoestrogene für die Estrogenrezeptoren steht im unmittelbaren Zusammenhang zur stereochemischen Struktur und ist im Allgemeinen niedriger als die des Estradiols. So bindet z. B. Coumestrol mit einer dreifach niedrigeren Affinität als Estradiol an den ER- α (siehe Tabelle 2.4). Während Estradiol mit gleicher Affinität an die beiden Estrogenrezeptoren ER-α und ER-β bindet, besitzen im Vergleich dazu die Phytoestrogene eine mehr oder weniger große Affinität zu nur einem Estrogenrezeptor, dem ER- β (KUIPER et al. 1997). Das Prenylflavonoid 8-PN ziegt diese Selektivität zu den Estrogenrezeptoren nicht und Untersuchungen bezüglich der Affinität der Lignane stehen noch aus (PIKE et al. 1999).
O H
O H
O O
H
OH Estradiol
Isoflavon
Schrifttum
Tab.2.4: Relative Bindungsaffinitäten verschiedener Phytoestrogene zum ER-α und ER-β Bindung an ER-α (%) Bindung an ER-β (%)
Estradiola 100 100
Coumestrola 34 100
Genisteina 0,7 13
Daidzeina 0,2 1
8-Prenylnaringeninb 10 10
a KUIPER et al. 1998 bPIKE et al. 1999
2.4.1 Estrogene Wirkungsstärken von Phytoestrogenen
Für die Wirkung estrogen aktiver Substanzen sind die Interaktionen mit den Estrogenrezeptoren von zentraler Bedeutung. Allerdings ist die Stärke der Interaktion wie oben beschrieben sehr unterschiedlich. Phytoestrogene zeigen eine etwa 10 bis 100 fach schwächere Bindungsaffinität zu den Estrogenrezeptoren als das körpereigene Estradiol (MIKSICEK 1994). Die Affinität zum Rezeptor allein lässt jedoch keine Aussagen über die Wirkstärke und Qualität (agonistisch oder antagonistisch) zu. Funktionelle Testsysteme liefern Messwerte auf zellulärer oder molekularer Ebene, die auf Rezeptorinteraktion resultierende Effekte beruhen und auf die Wirkstärke schließen lassen (ZACHAREWSKI 1997). In der Tabelle 2.5 sind estrogene Wirkungsstärken einiger Phytoestrogene relativ zum 17-ß-Estradiol aufgeführt. Verglichen mit Estradiol ist die estrogene Wirkung der Phytoestrogene mindestens um den Faktor 100, meist sogar um den Faktor 1000 bis 10.000 geringer.
Tab. 2.5: Estrogene Wirkungsstärken verschiedener Phytoestrogene relativ zum 17-ß-Estradiol (=1)
Substanzen Wirkungsstärkea
Estradiol 1
Coumestrol 0,0003 - 0,09
Genistein 0,000001 - 0,002
Daidzein 0,0000024 - 0,00014
Biochanin A 0,0000001 - 0,0045
Formononetin 0,00002 - 0,00006
8-Prenylnaringenin 0,002 - 0,04
Equol 0,000023 - 0,001
a (WELSHONS et al. 1990; MAYR et al. 1992; MARKIEWICZ et al. 1993; S. F. ARNOLD et al. 1996a; COLLINS et al. 1997; PETIT et al. 1997; ZAVA u. DUWE 1997; BREINHOLT u. LARSEN 1998; BREITHOFER et al. 1998;
HOPERT et al. 1998; KITAOKA et al. 1998; WILLARD u. FRAWLEY 1998; ASHBY et al. 1999; BAKER et al.
1999; HUNTER et al. 1999)
Schrifttum
Coumestrol erweist sich in den oben aufgeführten Studien als das potenteste Phytoestrogen, gefolgt von 8-Prenylnarigenin, Genistein, Equol, Daidzein und Biochanin A.
Die Phytoestrogene zeigen zwar geringe Wirkungsstärken – d. h. sie müssen in viel höheren Konzentrationen eingesetzt werden, um eine ähnliche Wirkung wie die des Estradiols zu erreichen – jedoch können Phytoestrogene im Körper bzw. in bestimmten Geweben in einer 1000 bis 10.000 fach höheren Konzentration als die endogenen Estrogene vorliegen (KULLING u. WATZL 2003).
2.4.2 Agonistische und antagonistische Wirkungen von Phytoestrogenen
Wenn Phytoestrogene an den Estrogenrezeptor binden, können ganz unterschiedliche biologische Wirkungen auftreten. Bewirkt die Bindung eines Phytoestrogens die Aktivierung des Estrogenrezeptors und es kommt zur gewebsspezifischen Reaktion, so spricht man von einer agonistischen Aktivität (PAIGE et al. 1999). Andererseits kann es bei der Bindung der Phytoestrogene ebenso zur Blockierung des Estrogenrezeptors kommen. Es handelt sich dann um eine antagonistische Wirkung der Phytoestrogene. Je nachdem, welche Konzentrationen der Phytoestrogene nötig sind, um die Reaktionen des Estradiols zu imitieren, spricht man von schwachen oder starken Agonisten und Antagonisten (COLLINS et al. 1997).
In Abhängigkeit von der Höhe des endogenen Estradiolsspiegels können Phytoestrogene sowohl eine agonistische als auch eine antagonistische Wirkung auslösen. In einem Individuum mit relativ niedrigem Estrogenspiegel kann eine Rezeptorbelegung schon durch relativ schwache Phytoestrogene einen estrogenen Effekt haben. Andererseits können im ”normalen” Organismus große Mengen an Phytoestrogenen die effektive estrogene Wirkung aufgrund von Kompetition und Blockierung des Estrogenrezeptors für die körpereigenen Hormone verringern (KALDAS u.
HUGHES 1989).
2.4.3 Kombinationseffekte von Phytoestrogenen
Aus der Interaktion eines Phytoestrogens mit dem Estrogenrezeptor kann eine antagonistische Wirkung resultieren, die jedoch erst feststellbar ist, wenn die fragliche Substanz in Kombination mit
Schrifttum
Estradiol geprüft wird. Doch selbst dann ist eine eindeutige Zuordnung zur Gruppe der Agonisten oder Antagonisten nicht immer möglich, wie das Beispiel des Arzneimittels Tamoxifen zeigt. Im Bioassay mit MCF-7 Brustkrebszellkulturen sind – je nachdem, ob es allein oder in Kombination mit Estradiol geprüft wird – estrogene bzw. antiestrogene Wirkungen festzustellen. Im Endometrium, einem „Zielgewebe“, wirkt Tamoxifen überwiegend agonistisch (WAKELING 1995). Für viele Phytoestrogene stehen Untersuchungen in Kombination mit Estradiol noch aus;
diese müssen dem Umstand Rechnung tragen, dass der weibliche und männliche Organismus selbst estrogene Hormone produziert.
Eine weitere ungeklärte Frage ist die nach additiven oder überadditiven Effekten bei Mischexpositionen. Phytoestrogene liegen häufig nicht als Einzelkomponente in der Pflanze bzw.
pflanzlichen Produkten vor und werden daher vom Organismus als Mischung aufgenommen. Im Juni 1996 erschien eine Studie, die auf eine hochgradig synergistische Wirkung zweier einzeln nur schwach estrogen wirksamen Chemikalien (binäre Gemische aus Pestiziden wie Endosulfan, Dieldrin, Toxaphen und Chlordan) hinwies (ARNOLD et al. 1996b). Diese Ergebnisse konnten jedoch in anderen Studien (ASHBY et al. 1997; RAMAMOORTHY et al. 1997) und schließlich auch von den Autoren selbst nicht reproduziert werden, die daraufhin die Veröffentlichung zurückzogen (MCLACHLAN 1997).
2.5 Absorption, Metabolisierung und Exkretion von Phytoestrogenen
Die Mechanismen der Absorption, Metabolisierung und Ausscheidung von Phytoestrogenen sind noch nicht vollständig geklärt. Die meisten Informationen sind über die Isoflavone vorhanden, denn diese werden von dem Menschen sowie besonders auch von den Nutztieren in mehr oder weniger großen Mengen (durch Sojabohnen bzw. Sojaprodukten) vermehrt aufgenommen. Neuere und detaillierte Daten stammen aufgrund der besonderen Bedeutung für den Menschen zum größten Teil aus Humanstudien. Die Prinzipien der Absorption, des Metabolismus und der Exkretion von Phytoestrogenen stimmen jedoch zwischen Mensch und monogastrischem Tier weitgehend überein (AXELSON et al. 1984).
Schrifttum
2.5.1 Monogastrier
Die Absorption von Isoflavonen ist davon abhängig, ob sie in freier Form (Aglykone) oder als Isoflavonglykoside vorliegen. Werden Isoflavone als Aglykone aufgenommen, erfolgt eine Resorption im Dünndarm auf Grund ihrer Lipophilie und ihres geringen Molekulargewichts durch passive Diffusion. Isoflavone liegen in den Pflanzen und den pflanzlichen Produkten jedoch hauptsächlich als Glykoside vor. Bei Aufnahme in Glykosidform werden mehrere Resorptionswege diskutiert, deren Bedeutung im Einzelnen noch unklar ist. Fest steht allerdings, dass die Isoflavone nicht in ihrer natürlichen Form als Glykosid aufgenommen werden, denn Isoflavonglykoside konnten im Blutplasma nicht nachgewiesen werden (SETCHELL et al. 2002). Glykoside müssen zunächst gespalten werden. Es wird daher vermutet, dass bereits im Magen eine saure Hydrolyse stattfindet (KELLY et al. 1995). Ergebnisse einer Studie mit Ratten widersprechen jedoch dieser These (PISKULA et al. 1999).
Vielmehr spielen die Leberzellen und die Enterozyten des Dünndarms eine wichtige Rolle, denn sie enthalten ß-Glukosidasen, die effizient eine große, jedoch nicht die gesamte Menge an Isoflavonglykosiden hydrolisieren (DAY et al. 1998). ß-Glukosidasen, die von der Darmflora (z. B. Lactobazillen und Bifidobakterien) gebildet werden, haben ebenfalls eine große Bedeutung für die Spaltung der Isoflavonglykoside in Aglykone (XU et al. 1995; BARNES et al. 1996). Im Dünndarm nicht resorbierte Isoflavone gelangen in den Dickdarm und können so durch die Darmflora zu Aglykonen umgewandelt werden.
Bevor es zur Resorption kommt, können weitere intestinale Metabolisierungsschritte erfolgen.
Dabei wird Daidzin zu Dihydrodaidzein reduziert, welches dann entweder durch Spaltung des Phenolringes zu O-Demethylangolensin oder unter Erhalt des Ringes zu dem Isoflavon Equol umgewandelt werden kann (KELLY et al. 1995; WAHALA et al. 1998). Analog zu Daidzin wird Genistin im ersten Schritt zu Dihydrogenistein reduziert und kann weiter zu 6-Hydroxy-O- Demethylangolensin metabolisiert werden. Im Unterschied zu Daidzin wird der analoge Equol- Metabolit aber nicht gebildet. Stattdessen kann ein Abbau des O-Demethylangolensinderivates zu d-Ethylphenol erfolgen (CHANG u. NAIR 1995).
Schrifttum
Isoflavone sowie ihre reduzierten Metaboliten gelangen nach Resorption aus dem Darm via Pfortader in die Leber. Dort unterliegen sie Phase-II-Konjugationsreaktionen und werden überwiegend entweder mit Glucuronsäure oder zu einem geringeren Anteil mit Sulfat rekonjugiert (KNIGHT u. EDEN 1996; BINGHAM et al. 1998). Einige Bakterien im Dickdarm besitzen ebenfalls Glukuronsäure-Transferasen und Sulfotransferasen, so dass diese Konjugationsreaktionen bereits im intestinalen Epithel ablaufen können (SFAKIANOS et al. 1997).
Glukuronidierte oder sulfatierte Isoflavonkonjugate treten in die systematische Zirkulation ein oder werden sowohl renal als auch biliär ausgeschieden (BAYER et al. 2001). Gelangen sie mit der Galle in den Darm, können die Konjugate durch die Enzyme der Darmflora gespalten und die Aglykone erneut resorbiert werden. Damit unterliegen die Isoflavone – ähnlich den körpereigenen Steroidhormonen – einem enterohepatischen Kreislauf. Je nach Umfang der enterohepatischen Zirkulation kann der Organismus den Isoflavonkomponenten so über längere Zeit ausgesetzt sein (BARNES et al. 1996).
Der überwiegende Teil der aufgenommenen Isoflavone wird renal ausgeschieden. In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass in der Regel nicht mehr als 35 – 62 % der verabreichten Dosis an Daidzein und lediglich nur 9 – 22 % des aufgenommenen Genisteins in ihrer diphenolischen Form im Urin nachweisbar waren. Diese geringe Wiederfindung wird durch den Abbau der Isoflavone zu einfachen Phenolen durch mikrobielle Umsetzungen erklärt (SETCHELL et al. 1998;
COLDHAM et al. 1999; COLDHAM u. SAUER 2000).
Die Ausscheidung mit den Faeces erreicht zwei bis drei Tage nach Aufnahme der Isoflavone ihr Maximum, wobei die Ausscheidungsrate dabei meist unter 5 % liegt (BAYER et al. 2001).
2.5.2 Besonderheiten beim Wiederkäuer
Bestimmte Phytoestrogene spielen als Bestandteil einiger wirtschaftlich wichtiger Weide- oder Futterpflanzen für den Wiederkäuer eine große Rolle. Zu diesen Pflanzen gehören vor allem zwei Pflanzengruppen, Gramineen und Leguminosen. Die Isoflavone Genistein, Daidzein, Biochanin A und Formononetin (als Pflanzeninhaltsstoffe vieler Kleearten) sowie zu einem geringeren Anteil Coumestrol (in Klee und in Luzerne) werden dabei vom Wiederkäuer aufgenommen
Schrifttum
(DROCHNER 1990). Aufgrund der Verhältnisse im Vormagensystem kommt es zu einer anderen Metabolisierung der Phytoestrogene als beim Monogastrier. Die in den Pflanzen glykosidisch gebundenen Isoflavone werden vorrangig bereits im Pansen durch mikrobielle Aktivitäten gespalten und umgewandelt. Genistein und Biochanin A, die beim Mensch und monogastrischen Tier eine estrogene Wirkung haben, werden im Pansen der Wiederkäuer zu Para-Ethylphenol und einer Phenolsäure (ohne estrogene Wirkung) abgebaut (NILSSON et al. 1967). Im Gegensatz dazu werden Daidzein und methyliertes Daidzein (Formononetin) durch die mikrobielle Pansenflora zu dem estrogen aktiven Equol reduziert. Während also der Abbau von Genistein und Biochanin A im Pansen zu inaktiven Phenolen führt, bleibt die Umwandlung von Daidzein und Formononetin in Equol - einmal in Gang gesetzt - ziemlich konstant und ein weiterer Equolabbau tritt nicht auf (SHUTT u. BRADEN 1968). Im Pansen wird nur eine sehr geringe Menge an Isoflavonaglykonen resorbiert. Der größte Anteil wird konjuguiert, wobei diese Konjugation mit Glukuronsäure oder Sulfat - im Gegensatz zu den Monogastriern - bereits hauptsächlich im gastrointestinalen Epithelium stattfindet; nur ein kleiner Rest an unkonjugierten Metaboliten wird durch die Phase-II- Konjugationsreaktionen in der Leber konjugiert.
Coumestrol ist zunächst estrogen aktiv, wird aber nach einer Anpassungsperiode vermutlich aufgrund des Abbaus zu noch nicht identifizierten Stoffwechselprodukten immer weniger estrogenwirksam (KELLY 1972).
Zum überwiegenden Teil werden die Phytoestrogene beim Wiederkäuer wie bei den Monogastriern renal ausgeschieden, wobei bis zu 70 % des täglichen aufgenommenen Formononetins im Harn von Schafen und Rindern wiedergefunden wurden (SHUTT et al. 1970).
2.6 Pharmakokinetik der Phytoestrogene
Viele Studien beschäftigten sich mit der Exkretion der Phytoestrogene, jedoch gibt es nur wenige Untersuchungen zur Pharmakokinetik dieser Substanzen. Aus einer Humanstudie mit sieben männlichen Probanden ist allerdings bekannt, dass der Genisteinwert im Plasma zwei Stunden nach oraler Aufnahme einer Isoflavon-Diät mit Genistein und Daidzein langsam anstieg. Die maximalen Plasmakonzentrationen der beiden Komponenten wurden nach sechs bis acht Stunden erreicht (WATANABE et al. 1998). Die Plasmaspiegel beider Isoflavone fallen nach Erreichen des
Schrifttum
Maximalwertes nach einer Kinetik erster Ordnung ab. Dabei wurden für Genistein Halbwertszeiten zwischen sechs und acht Stunden und für Daidzein zwischen fünf und sechs Stunden ermittelt (KING u. BURSILL 1998).
Das pharmakokinetische Verhalten der Isoflavone ist stark abhängig von der Angebotsform der Isoflavone als Aglykone bzw. Glykoside. Die Aglykone erreichen im Vergleich zu den Glykosiden nach kürzerer Zeit ihr Maximum im Plasma; Glykoside zeigen erst nach neun bis zehn Stunden die höchsten Plasmakonzentrationen. Die Verzögerung entspricht der benötigten Zeit zur Hydrolyse der Glykoside vor der Absorption (SETCHELL et al. 2001).
Die renale Ausscheidung der Isoflavone verläuft parallel mit steigenden Konzentrationen der Komponenten im Plasma und erreicht entsprechend den Halbwertszeiten nach sechs bis acht Stunden ihr Maximum (WATANABE et al. 1998).
Im Kurvenverlauf der Plasma- und Urinkonzentrationen von Isoflavonen sind häufig biphasische Peaks zu beobachten, die vermutlich den enterohepatischen Kreislauf der Komponenten widerspiegeln.
2.7 Verteilungsmuster der Phytoestrogene im Körper
Nach der Absorption und Metabolisierung von Phytoestrogenen wie z. B. Isoflavonen findet man diese Substanzen in einer Vielzahl von Körperflüssigkeiten wie Plasma, Urin, Prostata- und Samenflüssigkeiten, Galle, Milch, Lungensekret sowie Zysteninhalten wieder. Die höchsten Konzentrationen der Isoflavone und Metaboliten werden dabei im Blut und Urin gemessen. Es handelt sich hierbei zum größten Teil um die Aglykone Genistin und Daidzin sowie um Equol und den Metaboliten O-Demethylangolensin (ADLERCREUTZ et al. 1995; KNIGHT u. EDEN 1996).
Die im Plasma gemessenen Isoflavonwerte korrelieren dabei nicht zwangsläufig mit den Konzentrationen im Gewebe. In einer Bioverfügbarkeitsstudie mit Ratten, denen radioaktiv markiertes Genistein verabreicht wurde, konnte gezeigt werden, dass in Geweben wie Brust, Eierstöcken und Uterus bei weiblichen Tieren sowie der Prostata bei männlichen Tieren ein Großteil (zwischen 50 - 90%) der Isoflavone als Aglykone (= biologisch wirksame Form) vorliegen. Wie der Tabelle 2.6 zu entnehmen ist, liegt der Aglykonanteil im Plasma hingegen bei nur 1 - 2 % (CHANG et al. 2000).
Schrifttum
Tab. 2.6: Konzentration von Genistein im Plasma (pmol/L) und Gewebe (pmol/mg) von Ratten nach Applikation eines Futters mit 500 mg Genistein/kg Futter (CHANG et al. 2000)
Genistein Konzentration pmol/mg (% Aglykon)
Genistein Konzentration pmol/mg (% Aglykon)
Gewebe Männchen Weibchen
Plasma 6 µmol/L (<5 %) 7,9 µmol/L (<5 %)
Mammagewebe 0,8 (24 %) 2,4 (49 %)
Leber 0,7 (34 %) 7,33 (77 %)
Gehirna n.d. - n.d. -
Prostata 1,1 (45 %) - -
Testes 0,6 (11 %) - -
Ovarien - - 1,1 (80 %)
Uterus - - 1,4 (90 %)
a n.d. = nicht detektierbar, Konzentration im Gehirn lag unter der Nachweisgrenze (0,5 pmol/mg)
Die Metabolisierung von Phytoestrogenen unterliegt individuellen Variationen, wobei neben dem Faktor Geschlecht vor allem die Zusammensetzung der Darmflora und - damit unmittelbar zusammenhängend - die Nahrungszusammensetzung Einfluss nehmen (SETCHELL et al. 1998).
Die Unterschiede der Phytoestrogenmetabolisierung zwischen zwei Individuen ergeben sich aus der unterschiedlichen Zusammensetzung der Darmflora. Die bekannten Faktoren, welche die Zusammensetzung der Magen-Darmflora beeinflussen, haben somit indirekt einen Einfluss auf die Metabolisierung der Phytoestrogene. Solche Faktoren sind z. B. die Komposition und Matrix der Diät, der pH-Wert im Magen-Darmtrakt, die Darmmotilität, die Verweildauer des Chymus im Verdauungstrakt, Stress sowie pathologische Vorgänge im Zuge einer Erkrankung und der Einsatz von Antibiotika (ROWLAND et al. 1999).
Beim Menschen führt der Verzehr einer kohlenhydratreichen Diät in Form von Zucker zu einer vermehrten Metabolisierung der Isoflavone (SLAVIN et al. 1998). Die gesteigerte Fermentation im Dickdarm bewirkt einem verstärkten Abbau von Daidzein zu Equol (ROWLAND et al. 1999;
ROWLAND et al. 2000). Des Weiteren zeigt eine ballaststoffreiche Diät Effekte auf die Absorption, Reabsorption und Exkretion von Phytoestrogenen, indem sie die Enzymaktivität von ß- Glucuronidasen und ß-Sulfatasen der Darmflora beeinflusst. Bei Vegetariern mit einer hohen Aufnahme faserreicher Nahrungsmittel konnte im Unterschied zu Nicht-Vegetariern eine verminderte bakterielle Aktivität der ß-Glucuronidase mit entsprechender Wirkung auf die Absorption und Metabolisierung beobachtet werden (ADLERCREUTZ et al. 1987).
